Name: Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę oceny przepuszczalności błon liposomowych zwiększającą czułość detekcji zmian wywołanych przez fosfolipazę A2. Technika ta umożliwia badania w biofizyce membran i interakcjach toksyn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tym artykule zostały wsparte przez grant startowy od Beijing Chaoyang KaiWen Academy (E.S.G.) oraz przez nagrodę SEPA, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.). Prace związane z przygotowaniem HDP-2 były wspierane grantem Rosyjskiej Fundacji Nauki nr 24-15-00280 (Y.N.U.). Autorzy pragną podziękować dr Maryam Barancheshmeh za napisanie scenariusza i opracowanie filmu o zastosowaniu symulacji dokowania molekularnego, który został przygotowany po publikacji tego artykułu naukowego.

1. Symulacja in silico interakcji HDP-2P z PI i fosfoinozydami z wykorzystaniem oprogramowania do modelowania molekularnego
<ol>
	<li>Instalacja i przygotowanie oprogramowania<ol>
		<li>Zainstaluj edytor rysunków chemicznych do konstrukcji cząsteczek ligandów, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Ilustracja Uzupełniająca S1A.</li>
		<li>Zainstaluj oprogramowanie do modelowania molekularnego do molekularnego dokowania ligandu do receptora.</li>
		<li>Zainstaluj Automatyczne Narzędzia Dokowania do przygotowania ligandów i receptorów.</li>
		<li>Ponieważ oprogramowanie do symulacji modelowania molekularnego zależy od środowiska Pythona, zainstaluj Pythona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ligandów<ol>
		<li>Po pierwsze, użyj edytora rysunków chemicznych do zbudowania współrzędnych atomowych struktur molekularnych PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, kardiolipiny i fosfatydyloseriny. UWAGA: Przykładowy protokół w kolejnych krokach przygotowania ligandu opisuje tylko kroki dla PI.</li>
		<li>Zbuduj strukturę molekularną PI za pomocą edytora rysunków chemicznych, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunku Uzupełniającego S1B , i zapisz plik w formacie PDB, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunek Uzupełniający S2.</li>
		<li>Otwórz plik PDB w oprogramowaniu narzędzia do automatycznego dokowania, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Rysunek uzupełniający S3A.</li>
		<li>Dodaj atomy wodoru zgodnie z Plikiem Uzupełniającym 1-Rysunkiem uzupełniającym S3B i wybierz albo atomy polarne, albo wszystkie atomy wodoru, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1 - Rysunku uzupełniającym S4A. UWAGA: Po zakończeniu dokowania PI z HDP-2P wybieraj wyłącznie atomy wodoru polarnego, aby ułatwić wizualizację wiązań polarnych lub wodorowych.</li>
		<li>Ustaw cząsteczkę PI jako ligand dla automatycznego narzędzia dokowania, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Rysunku uzupełniającym S4B.</li>
		<li>Zapisz ligand jako plik PDBQT, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1 – Rysunek uzupełniający S5A. Upewnij się, że wszystkie obligacje są rotacyjne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie receptorów<ol>
		<li>Pobierz plik PDB fosfolipazy A2 HDP-2 (kod PDB 2I0U), składający się z dwóch monomerów: jeden jest kwaśny, enzymatycznie nieaktywny, A, a drugi zasadowy, enzymatycznie aktywny, E. Aby usunąć enzymatycznie nieaktywny monomer A, zaimportuj plik 2I0U do oprogramowania do modelowania molekularnego (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S5B), wybierz wszystkie atomy monomeru A (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S6A), a następnie przejdź do Edytuj i usuń wszystkie atomy monomeru A (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S6B). Utrzymuj enzymatycznie aktywny monomer E, który obecnie jest wyznaczony jako receptor.</li>
		<li>Otwórz plik PDB receptora HDP-2P w oprogramowaniu narzędzia do automatycznego dokowania, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Rysunku uzupełniającym S7.</li>
		<li>Usuń wszystkie cząsteczki wody, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1 – Rysunku uzupełniającym S8A.</li>
		<li>Dodaj atomy wodoru zgodnie z Plikiem Uzupełniającym 1-Rysunkiem uzupełniającym S8B. Prosimy pamiętać, że po zakończeniu dokowania HDP-2P z PI, należy wybrać jedynie wodory polarne, aby ułatwić wizualizację wiązań polarnych i wodorowych.</li>
		<li>Ustaw HDP-2P jako receptor, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunku Uzupełniającego S9A, i zapisz go jako plik PDBQT. Upewnij się, że receptor jest ustawiony bez więzów obrotowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja parametrów dokowania<ol>
		<li>Otwórz zarówno pliki ligandu, jak i receptora PDBQT.</li>
		<li>Wejdź do interfejsu konfiguracji siatki pudełek, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Ilustracja uzupełniająca S9B, i zdefiniuj rozmiar siatki (rozmiar x = 44,644; rozmiar y = 74,939; rozmiar z = 43,050) oraz współrzędne (środek x = 25,626; środek y = 9,582; środek z = 41,825), które w pełni obejmują całą powierzchnię cząsteczki receptora, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1 - Ilustracja uzupełniająca S10A.</li>
		<li>Zamknij interfejs konfiguracyjny grid box z aktualnymi ustawieniami, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Dodatkowym Rysunku S10B i zapisz parametry dokowania w pliku config.txt, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Dodatkowym Rysunku S11A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie oprogramowania dokującego molekularnego<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie dokujące molekularne, korzystając z pliku config.txt, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunku Uzupełniającym S11B.</li>
		<li>Wykonaj obliczenia dokowania (~30-90 min; Plik uzupełniający 1-Rysunek uzupełniający S12).</li>
		<li>Sprawdź plik docking_log.txt, aby przejrzeć wyniki dokowania (powiązanie wiązania).</li>
		<li>Wybierz wynik dokowania o najniższej konformacji energetycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych dokowania<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do automatycznego dokowania, aby otworzyć plik PDBQT z wynikiem dokowania.</li>
		<li>Przeanalizuj miejsca wiązania ligand-receptor, koncentrując się na aktywnym centrum receptora oraz interakcjach międzycząsteczkowych, w tym wiązaniach jonowych, jonowo-polarnych, polarnych i wodorowych. Sporządź tabelę dla PI i fosfoinozydydu, które oddziałują z aktywnym miejscem receptora, aby opisać powinowactwa miejsc wiązania w kcal/mol, naładowane i polarne części w głowie polarnej PI/fosfoinozytydowej oraz reszty HDP-2P zaangażowane w wiązania międzycząsteczkowe, a także rodzaje wiązań pokazanych w Tabeli 1 i Tabeli 2. Powtórz dokowanie dla każdej pary receptor-ligand 3 razy, aby upewnić się, że nie ma odchyleń w miejscach wiązania, powinowactwach wiązania, naładowanych i polarnych połowach reszt PI/fosfoinozydydu i HDP-2P oraz rodzaju wiązań.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Aktywność hydrolityczna HDP-2P w liposomach PC wzbogaconych o PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS lub CL, monitorowana za pomocą koenzymu A asylowanego wolnymi kwasami tłuszczowymi
UWAGA: Chloroform, metanol, NH3 i CuSO4 są niebezpieczne. Zawsze używaj rękawiczek nitrylowych, gogli i fartucha laboratoryjnego. Zajmij się wszystkimi protokołami z tymi odczynnikami pod maską oparową. Przechowuj chloroform w butelce z bursztynowego szkła. Przechowuj metanol w łatwopalnych szafkach, z dala od utleniaczy. Trzymaj metanol z dala od płomieni i iskier. Oznaczaj wszystkie pojemniki na odpady z tymi odczynnikami i utylizuj je zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów niebezpiecznych.
<ol>
	<li>Przygotuj 100 mL roztworu buforowego do hydrolizy fosfolipidów katalyzowanych przez HDP-2P poprzez rozpuszczenie 5,55 mg CaCl2 w buforze Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4).</li>
	<li>Przygotuj 50 mL roztworu zapasowego 1,0 M EDTA poprzez rozpuszczenie 7,31 g EDTA w destylowanej wodzie destylowanej (ddH20).</li>
	<li>Przygotuj 0,54 mM roztworu HDP-2P w buforze Tris-HCl o pojemności 0,10 m (pH 7,4). Masa molowa HDP-2P wynosi 13,827 kDa.</li>
	<li>Przygotuj następujące roztwory zapasowe fosfolipidów w stężeniu 10,0 M w mieszance chloroformu i metanolu (2 do 1 objętościowo): żółtko jaj L-α-fosfatydylocholina (PC), serce bydła kardiolipina (CL), mózg bydła L-α-fosfatydylo-L-seryna (PS), PI, PI-4-P oraz PI-4,5-P2. Masy molowe PC, CL, PS, PI, PI-4-P i PI-4,5-P2 to odpowiednio 768 Da, 1 466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da i 1 057 Da, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Przygotuj pięć próbek liposomów PC. Aby przygotować próbkę liposomów PC, dodaj 75 μL roztworu chloroformu/metanolu PC do szklanej probówki i susz lipidy w temperaturze 25 °C pod próżnią 10 Pa przez godzinę, aż powstanie film lipidowy. Nawadnij błonę lipidową przez 1 godzinę 15 mL roztworu buforowego do hydrolizy fosfolipidów w temperaturze 25 °C w termostacie. Następnie włóż tytanowy pistolet z dozownika ultradźwiękowego 100-150 W do zawiesiny lipidowej w szklanej probówce umieszczonej w kąpieli lodowej i sonikuj zawiesinę na częstotliwości 22 kHz przez 10 minut, nie przekraczając 50% maksymalnej mocy. Aby usunąć cząstki tytanu "pyłowe", wiruj liposomy o temperaturze 200 × g (1 270 obr./min z rotorem 10 cm) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj próbki liposomów PC wzbogaconych o CL, PS, PI, PI-4-P lub PI-4,5-P2 w stosunku PC oraz innych lipidów molowych 4 do 1, mieszając roztwory zapasowe chloroformu/metanolfosfolipidów-60 μL PC z 15 μL CL, PS, PI, PI-4-P lub PI-4,5-P2-w szklanej tubie. Następnie susz lipidy w próżni 10 Pa lub przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, nawilżaj film lipidowy w roztworze buforowym do hydrolizy fosfolipidów i soniknuj falami ultradźwiękowymi, jak opisano powyżej. UWAGA: Dla każdego typu liposomów przygotuj pięć próbek.</li>
	<li>Umieść 1,0 mL z pięciu próbek każdego typu liposomów opisanych powyżej do oddzielnych probówek i dodaj 10 μL bezbarwnego roztworu koenzymu-A z zestawu NEFA do każdej probówki, a następnie dodaj 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 lub 3,72 μL roztworu zapasowego 0,54 mM HDP-2P do oddzielnych probówek, aby uzyskać w próbkach liposomów molowe proporcje molowe HDP-2P/fosfolipidów wynoszące 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 i 0,004, odpowiednio.</li>
	<li>Bezpośrednio po dodaniu HDP-2P do liposomów inkubuj próbki liposomów przez 15 minut w temperaturze 37 °C w termostacie, a następnie zatrzymaj hydrolizę fosfolipidów indukowaną przez HDP-2P poprzez dodanie 100 μL roztworu EDTA z bazy. Potem przez 1 minutę przekuwaj próbki w wir.</li>
	<li>Ilościowo określić aktywność hydrolityczną HDP-2P, mierząc gęstość optyczną próbek liposomatów na 550 nm za pomocą spektrofotometru, który zmierzyłby stopień, w jakim bezbarwny roztwór koenzymu-A staje się fioletowy po asylacji wolnymi kwasami tłuszczowymi.</li>
	<li>Powyższa procedura powtórz się jeszcze dwa razy, aby uzyskać średnie wartości gęstości optycznej z trzech niezależnych prób. UWAGA: Każdy punkt danych uzyskany w tym eksperymentalnym badaniu to średnia wartość gęstości optycznej. Idealnie odchylenie standardowe punktów danych eksperymentalnych powinno mieścić się w granicach ±5% od średniej.</li>
</ol>
3. Wpływ HDP-2P na przepuszczalność błon liposomalnych PC wzbogaconych PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS lub CL mierzone przez reakcję podstawienia ligandu w roztworze CuSO4, z udziałem ligandu NH3 uwięzionego wewnątrz liposomów
UWAGA: Chloroform, metanol, NH3 i CuSO4 są niebezpieczne. Zawsze używaj rękawiczek nitrylowych, gogli i fartucha laboratoryjnego. Zajmij się wszystkimi protokołami dotyczącymi tych odczynników pod maską oparową. Przechowuj chloroform w butelce z bursztynowego szkła. Przechowuj metanol w łatwopalnych szafkach, z dala od utleniaczy. Trzymaj metanol z dala od płomieni i iskier. Oznaczaj wszystkie pojemniki na odpady z tymi odczynnikami i utylizuj je zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów niebezpiecznych.
<ol>
	<li>Przygotuj 20 ml roztworów zapasowych 0,03 M dla każdego z sześciu fosfolipidów – PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- w chloroformie/metanolu (2 do 1 objętości). Masy cząsteczkowe PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 to odpowiednio 768, 1466, 792, 867, 962 i 1057 Da.</li>
	<li>Przygotuj 100 mL buforu Tris-HCl o zawartości 0,10 M (pH 7,4) z końcowym stężeniem 0,05 M CuSO4.</li>
	<li>Przygotuj 4 mL 1,5 × 10-3 M HDP-2P w buforze 0,05 M CuSO4, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4). Masa molowa HDP-2P wynosi 13,827 kDa.</li>
	<li>Aby przygotować 100 mL roztworu NH3 0,5 M, należy użyć roztworu 25% NH3 (gęstość 905 g/L30, równa 13,30 M [905 g/L × 0,25 M ÷ 17,00 g/L = 13,30 M]). Aby przygotować 100 mL 0,5 M NH3, należy użyć 3,76 mL roztworu NH3 25%: (0,5 M × 1000 mL ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 mL roztworu NH3 25%. Włóż 3,76 mL roztworu NH3 25% do kolby objętościowej 100 mL i zmień objętość do 100 mL za pomocą buforu Tris-HCl (pH 7,4) 0,10 M.</li>
	<li>Aby przygotować liposomy z NH3 w wewnętrznej objętości liposomów, umieść 12,5 mL roztworu fosfolipidów 0,03 M w chloroformie/metanolu w tubce i wysusz fosfolipidy w próżni 10 Pa lub przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Nawadnij folię fosfolipidową przez 1 godzinę 12,5 mL 0,5 M NH3, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) w termostacie 25 °C; następnie sonikować zawiesinę lipidową z częstotliwością 22 kHz, jak opisano w kroku 2.5, aby uzyskać sonikowane liposomy. UWAGA: W roztworze z liposomami sonikowanymi NH3 znajduje się wewnątrz i na zewnątrz liposomów.</li>
	<li>Aby wyeliminować NH3 spoza liposomów, dializuj liposomy za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie molekularne 1,0 kDa) o temperaturze pokojowej 5 kap w porównaniu do 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) za pomocą mieszadła magnetycznego. UWAGA: Dializa trwająca 5 godzin wystarczyła do całkowitego usunięcia NH3, ponieważ dodanie 0,5 mL dializowanych liposomów do 0,5 mL buforu Tris-HCl 0,10 M Tris-HCl i 0,05 M CuSO4 dało taką samą gęstość optyczną przy 600 nm jak liposomy przygotowane bezNH 3 i zmieszane z tym samym buforem.</li>
	<li>Po dializie wiruj liposomy w dawce 200 × g przez 90 minut, zgodnie z krokiem 2.5, aby rozpylić liposomy. Usuń supernatant i ponownie zawiesij liposomy z 5,0 mL buforu 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4) i podziel ponownie zawiesowane liposomy na pięć próbek po 1,0 mL każda. Do tych pięciu próbek po 1,0 mL osobno należy dodać 80, 60, 40, 20 i 0 μL buforu 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4), a następnie 0, 20, 40, 60, 80 μL buforu HDP-2P, aby skorygować w próbkach liposomów stosunki molowe HDP-2P/fosfolipidów 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 i 0,004, odpowiednio.</li>
	<li>Inkubuj próbki liposomów przez 30 minut w termostacie w temperaturze 37 °C; Następnie zmierz gęstość optyczną próbek liposomów przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3 dla wszystkich sześciu próbek liposomów i powtarzaj 3 razy, aby zapewnić potrójne odczyty gęstości optycznej dla każdego punktu danych. UWAGA: Odchylenie standardowe punktów danych eksperymentalnych powinno zawsze mieścić się w granicach ±5% od średniej.</li>
</ol>

<ol><li>De Matteis, A., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Lipids%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides.</a> Biochim Biophys Acta Lipids. 1851 (6), 697-918 (2015).</li>
<li>Hokin, M. R., Hokin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+secretion+and+the+incorporation+of+P32+into+phospholipids+of+pancreas+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzyme secretion and the incorporation of P32 into phospholipids of pancreas slices.</a> J Biol Chem. 203 (2), 967-977 (1953).</li>
<li>Hokin, L. E., Hokin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetylcholine+on+the+turnover+of+phosphoryl+units+in+individual+phospholipids+of+pancreas+slices+and+brain+cortex+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of acetylcholine on the turnover of phosphoryl units in individual phospholipids of pancreas slices and brain cortex slices.</a> Biochim Biophys Acta. 18, 102-110 (1955).</li>
<li>Hokin, L. E., Hokin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+and+protein+secretion+in+pancreas+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides and protein secretion in pancreas slices.</a> J Biol Chem. 233, 805-810 (1958).</li>
<li>Lolicato, F., Nickel, W., Haucke, V., Ebner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+switches+in+cell+physiology%3A+from+molecular+mechanisms+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide switches in cell physiology: from molecular mechanisms to disease.</a> J Biol Chem. 300, 105757(2024).</li>
<li>Powis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleckstrin+homology+%28PH%29+domain%2C+structure%2C+mechanism%2C+and+contribution+to+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Pleckstrin homology (PH) domain, structure, mechanism, and contribution to human disease.</a> Biomed Pharmacother. 165, 115024(2023).</li>
<li>Burke, J. E., Triscott, J., Emerling, B. M., Hammond, G. R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+PI3Ks%3A+targeting+phosphoinositide+kinases+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Beyond PI3Ks: targeting phosphoinositide kinases in disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 22, 357-386 (2023).</li>
<li>Palamiuc, L., Ravi, A., Emerling, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+autophagy%3A+current+roles+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in autophagy: current roles and future insights.</a> FEBS J. 287, 222-238 (2020).</li>
<li>Calvillo-Robledo, A., Cervantes-Villagrana, R. D., Morales, P., Marichal-Cancino, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oncogenic+lysophosphatidylinositol+%28LPI%29%2FGPR55+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The oncogenic lysophosphatidylinositol (LPI)/GPR55 signaling.</a> Life Sci. 301, 120596(2022).</li>
<li>Madsen, R. R., Vanhaesebroeck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cracking+the+context-specific+PI3K+signaling+code%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Cracking the context-specific PI3K signaling code.</a> Sci Signal. 13, eaay2940(2020).</li>
<li>Wills, R. C., Hammond, G. R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI%284%2C5%29P2%3A+signaling+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">PI(4,5)P2: signaling the plasma membrane.</a> Biochem J. 479, 2311-2325 (2022).</li>
<li>Epand, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+the+phosphatidylinositol+cycle+and+its+role+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Features of the phosphatidylinositol cycle and its role in signal transduction.</a> J Membr Biol. 250, 353-366 (2017).</li>
<li>De Craene, J. O., Bertazzi, D. L., Bär, S., Friant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides%2C+major+actors+in+membrane+trafficking+and+lipid+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides, major actors in membrane trafficking and lipid signaling pathways.</a> Int J Mol Sci. 18, E634(2017).</li>
<li>Ivanova, A., Atakpa-Adaji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+calcium+at+ER-PM+junctions%3A+complex+interplay+of+simple+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and calcium at ER-PM junctions: complex interplay of simple messengers.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1870, 119475(2023).</li>
<li>Premrajan, P., Abhithaj, J. A., Variyar, E. J. PLA2: implications in neurological disorders as a prospective therapeutic target. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPremrajan%2C+P+%22Phospholipases+in+Physiology+and+Pathology%22">Phospholipases in Physiology and Pathology</a>. 2, Academic Press. 139-158 (2023).</li>
<li>André, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cytosolic+phospholipase+A2+as+a+potential+therapeutic+strategy+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis+Rep%22%5BJournal%5D)">Modulation of cytosolic phospholipase A2 as a potential therapeutic strategy for Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis Rep. 7 (1), 1395-1426 (2023).</li>
<li>Trotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phospholipase+A2+in+multiple+sclerosis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">The role of phospholipase A2 in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis.</a> Mult Scler Relat Disord. 27, 206-213 (2019).</li>
<li>Schaloske, R. E., Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipase+A2+superfamily+and+its+group+numbering+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system.</a> Biochim Biophys Acta. 1761 (11), 1246-1259 (2006).</li>
<li>Petrovic, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammodytoxin%2C+a+neurotoxic+secreted+phospholipase+A2+can+act+in+the+cytosol+of+the+nerve+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ammodytoxin, a neurotoxic secreted phospholipase A2 can act in the cytosol of the nerve cell.</a> Biochem Biophys Res Commun. 324 (3), 981-985 (2004).</li>
<li>Gasanov, S. E., Dagda, R. K., Rael, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+venom+cytotoxins%2C+phospholipase+A2s%2C+and+Zn-dependent+metalloproteinases%3A+mechanisms+of+action+and+pharmacological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Snake venom cytotoxins, phospholipase A2s, and Zn-dependent metalloproteinases: mechanisms of action and pharmacological relevance.</a> J Clin Toxicol. 4 (1), 1000181(2014).</li>
<li>Harris, J. B., Scott-Davey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+phospholipases+A2+of+snake+venoms%3A+effects+on+the+peripheral+neuromuscular+system+with+comments+on+the+role+of+phospholipases+A2+in+disorders+of+the+CNS+and+their+uses+in+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Secreted phospholipases A2 of snake venoms: effects on the peripheral neuromuscular system with comments on the role of phospholipases A2 in disorders of the CNS and their uses in industry.</a> Toxins (Basel). 5 (12), 2533-2571 (2013).</li>
<li>Ramazanova, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimeric+neurotoxic+phospholipases+A2%3A+the+first+proteins+from+venom+of+recently+established+species+Vipera+nikolskii%3A+implication+of+venom+composition+in+viper+systematics%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2: the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: implication of venom composition in viper systematics.</a> Toxicon. 51 (4), 524-537 (2008).</li>
<li>Chaudary, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelin+inhibits+hydrolytic+activity+of+heterodimeric+PLA2+in+model+myelin+membranes%3A+pharmacological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelin inhibits hydrolytic activity of heterodimeric PLA2 in model myelin membranes: pharmacological relevance.</a> J Membr Biol. 258, 29-46 (2025).</li>
<li>Li, M., Gasanoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+proteins+rich+in+lysine+residue+trigger+formation+of+non-bilayer+lipid+phases+in+model+and+biological+membranes%3A+biophysical+methods+of+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cationic proteins rich in lysine residue trigger formation of non-bilayer lipid phases in model and biological membranes: biophysical methods of study.</a> J Membr Biol. 256 (4-6), 373-391 (2023).</li>
<li>Gasanoff, E. S., Dagda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cobra+venom+cytotoxins+as+a+tool+for+probing+mechanisms+of+mitochondrial+energetics+and+understanding+mitochondrial+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Cobra venom cytotoxins as a tool for probing mechanisms of mitochondrial energetics and understanding mitochondrial membrane structure.</a> Toxins. 16, 287(2024).</li>
<li>Li, F., Shrivastava, I. H., Hanlon, P., Dagda, R. K., Gasanoff, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+by+which+cobra+venom+cardiotoxins+interact+with+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism by which cobra venom cardiotoxins interact with the outer mitochondrial membrane.</a> Toxins. 12 (7), 425(2020).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naja+mosambica+mossambica+cobra+cardiotoxin+targets+mitochondria+to+disrupt+mitochondrial+membrane+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Naja mosambica mossambica cobra cardiotoxin targets mitochondria to disrupt mitochondrial membrane structure and function.</a> Toxins. 11, 152(2019).</li>
<li>Gasanov, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naja+naja+oxiana+cobra+venom+cytotoxins+CTI+and+CTII+disrupt+mitochondrial+membrane+integrity%3A+implications+for+basic+three-fingered+cytotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Naja naja oxiana cobra venom cytotoxins CTI and CTII disrupt mitochondrial membrane integrity: implications for basic three-fingered cytotoxins.</a> PLoS One. 10 (6), 1-28 (2015).</li>
<li>Akosah, Y., Yang, J., Pavlov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+polyphosphate+and+ion+transport+across+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Inorganic polyphosphate and ion transport across biological membranes.</a> Biochem Soc Trans. 52 (2), 671-679 (2024).</li>
<li>Weast, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22CRC+Handbook+of+Chemistry+and+Physics%22">CRC Handbook of Chemistry and Physics</a>. , 62nd ed, CRC Press. (1982).</li>
<li>Lemmon, M. A., Ferguson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+membrane+targeting+by+pleckstrin+homology+%28PH%29+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains.</a> Biochem J. 350 (Pt 1), 1-18 (2000).</li>
<li>Ford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curvature+of+clathrin-coated+pits+driven+by+epsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Curvature of clathrin-coated pits driven by epsin.</a> Nature. 419 (6905), 361-366 (2002).</li>
<li>Khan, S. A., Ilies, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipase+A2+superfamily%3A+structure%2C+isozymes%2C+catalysis%2C+physiologic+and+pathologic+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The phospholipase A2 superfamily: structure, isozymes, catalysis, physiologic and pathologic roles.</a> Int J Mol Sci. 24 (2), 1353(2023).</li>
<li>De Oliveira, A. L. N., Lacerda, M. T., Ramos, M. J., Pedro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viper+venom+phospholipase+A2+database%3A+the+structural+and+functional+anatomy+of+a+primary+toxin+in+envenomation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Viper venom phospholipase A2 database: the structural and functional anatomy of a primary toxin in envenomation.</a> Toxins. 16 (2), 71(2024).</li>
<li>Hayashi, D., Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+human+phospholipase+A2%27s+activity+toward+phosphatidylinositol%2C+phosphatidylinositol+phosphate+and+phosphatidylinositol+bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Differentiating human phospholipase A2's activity toward phosphatidylinositol, phosphatidylinositol phosphate and phosphatidylinositol bisphosphate.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1869, 159527(2024).</li>
<li>Alekseeva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimeric+V.+nikolskii+phospholipases+A2+induce+aggregation+of+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Heterodimeric V. nikolskii phospholipases A2 induce aggregation of the lipid bilayer.</a> Toxicon. 133, 169-179 (2017).</li>
<li>Burke, J. E., Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+structure%2Ffunction%2C+mechanism%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling.</a> J Lipid Res. 50, S237-S242 (2009).</li>
<li>Dennis, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+enzymes%3A+physical+structure%2C+biological+function%2C+disease+implication%2C+chemical+inhibition%2C+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chem Rev. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li>
<li>Gasanov, S. E., Kim, A. A., Yaguzhinski, L. S., Dagda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-bilayer+structures+in+mitochondrial+membranes+regulate+ATP+synthase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Non-bilayer structures in mitochondrial membranes regulate ATP synthase activity.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1860, 586-599 (2018).</li>
<li>Aripov, T. F., Gasanov, S. E., Salakhutdinov, B. A., Rozenshtein, I. A., Kamaev, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Asian+cobra+venom+cytotoxins-induced+aggregation%2C+permeability+and+fusion+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Physiol+Biophys%22%5BJournal%5D)">Central Asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes.</a> Gen Physiol Biophys. 8, 459-474 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

W tym badaniu badaliśmy, czy grupy fosforanowe kowalencyjne związane z pierścieniem inozytolowym w fosfatydylinozytolu (PI) mogą zapobiegać degradacji błon fosfolipidowych przez enzym fosfolipazy A2 (PLA2). Aby ocenić postęp degradacji błony fosfolipidowej spowodowanej aktywnością hydrolityczną PLA2, zaprojektowaliśmy prostą, lecz bardzo czułą i dokładną metodę pomiaru zmian przepuszczalności błony, które powinny wzrastać wraz z postępem degradacji strukturalnej.
Metoda opiera się na reakcji podstawiania ligandów z udziałem kompleksu heksaaquacopper(II), [Cu(H2O)6]2+, zawieszonego w środowisku wodnym poza liposomami fosfolipidowymi, podczas gdy amoniak (NH3) jest otoczony wewnątrz liposomów. Amoniak ma większe powinowactwo do Cu2+ niż cząsteczki wody, ale NH3 musi przenikać przez błonę liposomalną, aby dostać się do zewnętrznej fazy wodnej, gdzie zastępuje cząsteczkiH2Ow [Cu(H2O)6]2+. Jeśli integralność strukturalna błony liposomowej zostanie osłabiona przez hydrolizę fosfolipidów katalyzowanychprzez PLA 2, zwiększona przepuszczalność błony dla NH3 ułatwi podstawienie ligandów, prowadząc do zmiany koloru z jasnoniebieskiego [Cu(H2O)6]2+ na ciemnoniebieski [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. Monitorowaliśmy tę transformację ilościowo, wykorzystując spektrofotometrię do rejestrowania zmiany gęstości optycznej na 600 nm.
Wcześniej używaliśmy 1H-NMR z paramagnetycznym jonem ferrocyjankiem, [Fe(CN)6]3-, do badania zmian przepuszczalności błon wpływanych przez HDP-2P24 oraz kardiotoksyny jadu kobry 24,25,26,27,28,39. Wykorzystaliśmy także szereg sond fluorescencyjnych i fosforescencjowych do badania wpływu kardiotoksyn jadu kobry na przepuszczalność błon liposomowych 20,23,40. Jednak sondy ferrocyjankowe oraz fluorescencyjne/fosforescencyjne to duże, niefizjologiczne jednostki molekularne, które przenikają przez błony lipidowe, gdy integralność błony jest znacząco uszkodzona. Dla porównania, nasz nowatorski test podstawiania ligandów wykorzystuje NH3 — mały, naturalny metabolit komórkowy zdolny do przenikania błon lipidowych przy subtelnych zaburzeniach upakowania lipidów. Ta zwiększona czułość naszej nowej metody przepuszczalności błon potwierdza jej zdolność do wykrywania zmian przepuszczalności błony przy molowym stosunku HDP-2P/lipid 0,001, w porównaniu do 0,004 wymaganego do wykrywania ¹H-NMR/ferrocyjanku23.
W tym samym badaniu zastosowaliśmy fosforescencję erytrosyny metodą ferrocenu do badania wpływu HDP-2P na międzybłonową wymianę lipidową, ocenianą przez zmianę stosunku długości życia erytrosyny w próbkach testowych (τn) do tego w próbce kontrolnej (τ0)23. Przy molowym stosunku HDP-2P/lipidów 0,004 wartość τn/τ0 spadła do 0,423, co wskazuje na stan płynności błony przepuszczalnej dla kationów dwuwartościowych24. W związku z tym nasz test podstawiania ligandów oparty na NH3 wykrywa przepuszczalność błony przy stosunku molowym HDP-2P/lipid wynoszącym 0,001, podczas gdy testy konwencjonalne (1H-NMR/ferrocyjanek oraz hartowanie przez sondę fosforescencyjną) wykrywają przepuszczalność błony jedynie przy stosunku molowym 0,004. To pokazuje, że nasz test oparty na NH3 jest czterokrotnie bardziej czuły niż testy konwencjonalne.
Wyjątkowa czułość naszego testu opartego na NH3 dała dane o przepuszczalności ściśle korelujące z pomiarami aktywności hydrolitycznej, z jedynie jedną widoczną rozbieżnością: liposomy PC+PI-4-P wykazały nieistotną hydrolizę bez zmian przepuszczalności, co sugeruje, że minimalna lokalna produkcja lizofosfolipidów/kwasów tłuszczowych nie wpływa na globalne upakowanie lipidów, które nie wpływa na integralność strukturalną i przepuszczalność błony. W ten sposób badanie wykazało, że reakcja podstawienia ligandu w złożonym układzie jonowym, obejmująca ligand zamknięty wewnątrz wewnętrznej objętości liposomów, dała wyniki doskonale zgodne z danymi aktywności hydrolitycznej HDP-2P. Te wyniki z kolei były w silnej zgodzie z badaniami in silico dotyczącymi wiązania PI i fosfoinozydów z powierzchnią molekularną HDP-2P.
Ogólnie symulacja AutoDock w niniejszym badaniu wykazała, że PI wiąże się z aktywnym centrum w czterech z dziewięciu zidentyfikowanych miejsc wiązania, podczas gdy PI-4-P wiąże się z aktywnym centrum tylko w jednym z dziewięciu przewidywanych miejsc. Aktywność hydrolityczna HDP-2P w liposomach PC+PI-4-P była około 5 razy niższa niż w liposomach PC+PI. Ponadto badania in silico przewidywały brak wiązania PI-4,5-P2 z aktywnym centrum HDP-2P. Konsekwentnie testy aktywnościPLA 2 oraz reakcje substytucji ligandów wykazały, że PI-4,5-P2 całkowicie hamował zarówno hydrolizę fosfolipidów, jak i wzrost przepuszczalności błon, podczas gdy PI-4-P wykazywał mniejszą, nieistotną aktywność hydrolityczną i całkowicie zapobiegał zmianom przepuszczalności błony. Obserwacje te są zgodne z badaniami aktywności in vitro dotyczących ludzkich enzymów cytosolicznych, niezależnych od wapnia i wydzielanych PLA2 w odniesieniu do PI, PI-4-P i PI-4,5-P2,35. Badania te wykazały, że tylko cytosolowy PLA2 grupy IVA wykazywał stosunkowo wysoką aktywność katalityczną wobec PI i PI-4-P, podczas gdy aktywność wobec PI-4,5-P2 była ledwo wykrywalna. Wszystkie pozostałe testowane enzymy PLA2 nie wykazały aktywności wobec PI-4,5-P235. Brak tej aktywności przypisuje się silnie hydrofilowym grupom fosforanowym na pierścieniu inozytolowym, które zakłócają produktywne interakcje między powierzchnią błony a enzymami PLA2 35. Sugerujemy, że rozszerzanie grup fosforanowych na pierścieniu inozytolowym do roztworu oraz ich zdolność do tworzenia wiązań jonowo-polarnych i wodorowych z resztami rowkowatej wnęki HDP-2P prawdopodobnie uniemożliwia HDP-2P zbliżenie się do powierzchni błony na tyle, by wywierać swoją aktywność hydrolityczną, co stabilizuje błonę i zmniejsza degradację błon fosfolipidowych przez HDP-2P, co może być szkodliwe dla komórek, aktywując szlaki śmierci komórkowej. Ten mechanizm wydaje się być zgodny z potencjalną ochronną rolą fosfoinozydów w chorobach związanych z nieprawidłową aktywnością enzymów.
Silna korelacja między wynikami uzyskanymi z testów przepuszczalności błony, pomiarów aktywności hydrolitycznej oraz badań molekularnego dokowania in silico podkreśla wiarygodność metody reakcji podstawiania ligandów. To podejście, wykorzystujące ligand zamknięty w liposomach, okazuje się dokładnym i skutecznym narzędziem do oceny zmian przepuszczalności błon spowodowanych zaburzeniami strukturalnymi w stabilnej organizacji dwuwarstwy fosfolipidów. Chociaż przyznajemy, że badania dokowania molekularnego z użyciem AutoDock przedstawione w tym artykule nie zapewniają dogłębnego zrozumienia, jak fosfolipidy mogą oddziaływać z HDP-2P w sposób dynamiczny i podłużny, w przyszłości należy przeprowadzić badania dynamiki molekularnej, aby zidentyfikować dodatkowe mechanizmy molekularne przenikania przez HDP-2 dwuwarstw fosfolipidów złożonych z różnych fosfolipidów. Ważne jest, aby zauważyć, że prowadzenie badań nad dynamiką molekularną wymaga dużych zasobów obliczeniowych, takich jak wysokowydajne komputery i klastry, które nie są dostępne w wielu instytucjach akademickich dysponujących ograniczonymi zasobami i funduszami badawczymi. Na koniec przyznajemy użycie receptora sztywnego (HDP-2P) w niniejszym artykule o technikach oraz brak środowiska rozpuszczalnika/błony. Chcemy jednak podkreślić, że wykonywanie molekularnych dokowania HDP-2P z różnymi fosfolipidami przy użyciu sztywnego receptora jest konwencjonalnym podejściem do przeprowadzania wstępnych badań dokowania w celu identyfikacji pierwszego przejścia zadokowanych struktur kandydatów, które można w przyszłości kontynuować za pomocą elastycznego receptora, gdy zostaną zidentyfikowane krytyczne reszty aminokwasowe po stronie katalitycznej wiążące się z substratami, aby skupić się na obszarach molekularnych, które można uczynić elastycznymi w dalsze badania dokowania molekularnego oraz w środowisku rozwiązłym. Dlatego wykorzystanie współpracy z innymi instytucjami dysponującymi większymi zasobami może pomóc potwierdzić niektóre z początkowych wyników dostarczonych przez AutoDock i zidentyfikować dodatkowe molekularne mechanizmy interakcji substrat-enzym.
Podsumowując, wyniki tego badania pokazują, że metoda reakcji podstawiania ligandów, wykorzystująca ligand zamknięty w liposomach, może być skutecznie stosowana w badaniach przepuszczalności błony w różnych procesach pośredniczonych przez błonę. Należą do nich interakcje ligand-receptor, lipid-białko, wymiana między błonami, fuzja i rozszczepienie błon oraz skurcze nerwowo-mięśniowe, między innymi. Ponadto takie podejście ma znaczący potencjał do badania farmaceutyków membranotropowych. Jednocześnie zdajemy sobie sprawę, że choć nowe metody w modelowych membranach są nieocenione do rozkładania konkretnych mechanizmów interakcji błon, ich wrodzone uproszczenia ograniczają ich zdolność do pełnego oddania złożoności strukturalnej, składowej i funkcjonalnej błon biologicznych in vivo. Dlatego kluczowe jest ostrożne interpretowanie danych z systemów modelowych i weryfikowanie wyników za pomocą modeli komórkowych lub organizmów, gdzie to możliwe.

Fosfatydylinozytol (PI) to fosfolipid anionowy składający się z szkieletu kwasu fosfatydowego powiązanego z inozytolem, sześciowęglowym pierścieniem heksahydroksowym, za pośrednictwem grupy fosforanowej. Inozytol można odwracalnie przekształcać w fosfoinozydy przez fosforylację na pozycjach 2, 3, 4, 5 i 6węgla 1. PI i fosfoinozydy występują w błonach plazmatycznych i organellach różnych komórek zwierząt, roślin i mikroorganizmów. Siedemdziesiąt lat po ich odkryciu przez Mable'a i Lowella Hokina 2,3,4, PI i fosfoinozydy pozostają przedmiotem szeroko zakrojonych badań mających na celu zrozumienie ich mechanizmów molekularnych i ich znaczenia dla zdrowia ludzi 5,6,7.
Poza tkanką mózgową, fosfoinozydy występują zazwyczaj w niskich stężeniach, odpowiadając za około 0,5 do 1% całkowitej liczby lipidów w wewnętrznej płatce błony plazmatycznej. Opublikowane dane wskazują, że PI prawdopodobnie nie będzie pełnić głównej roli strukturalnej w warunkach fizjologicznych1. Jednak w stadiach chorobowych poziomy PI i fosfoinozydów wzrastają, a one przechodzą na zewnętrzną płatkę błony plazmatycznej, co wskazuje, że te fosfolipidy mogą być powiązane z odpornością na chorobę1. Chociaż od dawna uważa się, że PI odgrywa mniej istotną rolę fizjologiczną w porównaniu do fosfoinozydów, pojawiające się dowody podkreślają znaczenie PI-4-P i PI-4,5-P2 w różnych procesach fizjologicznych1. Procesy te obejmują sygnalizację wewnątrzkomórkową, międzykomórkową transdukcję sygnałów 8,9,10, transport błonowy 11,12,13, modulację ekspresji genów 1, a także proliferację komórek14 i przeżywalność1. Mimo to mechanizmy molekularne, dzięki którym PI i fosfoinozydy napędzają te procesy, pozostają słabo poznane.
PI i fosfoinozydy są obficie obecne w komórkach tkanki mózgowej, gdzie stanowią około 10% wszystkich fosfolipidów, choć ich poziomy mogą przejściowo wzrastać we wczesnych stadiach chorób mózgu, co sugeruje, że fosfoinozydy mogą przeciwdziałać rozwojowi patologii neurologicznych1, takich jak stwardnienie rozsiane i choroba Alzheimera, wywołane przez demielinizację aksonalną spowodowaną nieprawidłową aktywnością PLA215, 16,17. Enzymy te należą do różnych klas i grup, w tym do grupy IIA wydzielniczej fosfolipazy A2 (sPLA2)15. Podwyższone poziomy tej grupy enzymów występują w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i chorobą Alzheimera, gdzie przyczyniają się do rozkładu błon mielinowych prowadzących do demielinizacji15. Zgłoszono również, że sPLA2s pochodzące z jadu węża hamuje transmisję na synapsach nerwowo-mięśniowych18,19, powodując zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego i negatywnie wpływając na obwodowy układ nerwowo-mięśniowy20.
W tym badaniu badaliśmy, czy PI i fosfoinozydy mogą chronić modelowe błony fosfolipidów przed działaniem nieprawidłowo ekspresowanych enzymów sPLA2. Błony modelowe wykonano z fosfatydylocholiny (PC), najliczniejszego fosfolipidu we wszystkich błonach komórkowych ssaków21, wzbogaconego o 20% molowy stosunek PI, PI-4-P lub PI-4,5-P2. Aby naśladować działanie nieprawidłowo ekspresowanych enzymów sPLA2 na błony modelowe, użyliśmy podstawowej podjednostki HDP-2P enzymu PLA22 grupy IIA wydzielającej jad żmii grupy IIA, którego aktywność hydrolityczna była wcześniej badana na modelowych błonach mielinowych23.
W ramach tych prac opracowaliśmy nowatorskie podejście do badania zmian przepuszczalności błon liposomowych dotkniętych przez HDP-2P. Nowatorska metoda opiera się na reakcji podstawiania ligandów w roztworze CuSO4 poza liposomami, z udziałem ligandu NH3 uwięzionego wewnątrz liposomów. Jeśli przepuszczalność błony indukowanej przez HDP-2P pozwala na wyciek NH3 z liposomów, uwolniony amoniak ilościowo zastąpi cztery cząsteczki wody w uwodnionych jonach miedzi poprzez reakcję: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68594/68594eq1.jpg" style="margin: auto;" /> [Cu(H,2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l). Ta wymiana ligandów powoduje charakterystyczny wzrost gęstości optycznej roztworu mierzonej spektrofotometrią (λ = 600 nm), służąc jako ilościowy odczyt zmian przepuszczalności błon. Nasze podejście oparte na podstawieniu ligandów wykazuje wyższą czułość przy ocenie przepuszczalności błony w porównaniu z konwencjonalnymi technikami, takimi jak 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 oraz testy transportu jonowego29, oferując jednocześnie dodatkową zaletę w postaci braku kosztownego instrumentarstwa. Ta prosta i opłacalna metoda, stosowana w połączeniu z pomiarami aktywności hydrolitycznej HDP-2P oraz symulacją in silico wiązania PI, PI-4-P i PI-4,5-P2 z powierzchnią molekularną HDP-2P, pozwoliła nam stwierdzić, że fosforany pierścienia inozytolowego w PI łagodzą zakłócające działanie HDP-2P na membrany PC wzbogacone PI-4-P lub PI-4, 5-P2. Jeśli to odkrycie zostanie potwierdzone w kolejnych badaniach, zdolność fosforanów pierścieni inozytolowej w PI do ochrony przed szkodliwym działaniem nieprawidłowo działających białek komórkowych, potencjalnie przyczyniających się do stabilności błon w chorobach związanych z nieprawidłową aktywnością białek, może utorować drogę do opracowania nowych leków do leczenia zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane.

<table><tbody><tr><td>Podstawowa podjednostka HDP-2P jadu żmiji V. nikolskii PLA2, HDP-2, 98,5% czystości &nbsp;</td><td>Instytut Chemii Bioorganicznej, Moskwa</td><td></td><td>HDP-2 izolowany według potocolu w PMID:18083205. HDP-2P oczyszczony z HDP-2 przez DEAE Sephadex A-50&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kardiolipina (sercowa, bydła) (sól sodowa), >99%</td><td>Macklin</td><td>C916138</td><td></td></tr><tr><td>Koenzym A, FUJIFILM Wako' s NEFA kit&nbsp;</td><td>Lexington, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolacja masy masy cząsteczkowej rury dializacyjnej w rurze celulozowej 1,0 kDa</td><td>Sigma Aldrich Trading Co. Ltd., Szanghaj, Chiny&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowo sterowany termostat zbiornika wody&nbsp;</td><td>YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Pekin, Chiny &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczna wysokoprecyzyjna waga analityczna FA2004&nbsp;</td><td>Shanghai Maiyi Ltd. Co., Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JingHua 752 spektrofotometr z zakresem widzialnym UV&nbsp;</td><td>Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydycholina (jajko, kurczak),&ge; 95%</td><td>Macklin</td><td>L799415</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydylinozytol (wątroba, bydło) (sól sodowa),&ge; 99%</td><td>Macklin</td><td>L780292</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydylinozytol-4,5-bisfosforan (Mózg, Porcine) (sól amonowa),&ge; 99%</td><td>Macklin</td><td>L996223</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydylinozytol-4-fosforan (Mózg, Porcine) (sól amonowa), 99%</td><td>Macklin</td><td>L970250</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyserynę (mózg, wieprzowinka) (sól sodowa), >99%</td><td>Macklin</td><td>L864755</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne JB-3&nbsp;</td><td>Shanghai Leici JB-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH miernik PHS-3C&nbsp;</td><td>Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka TGL-16B & niebsp;</td><td>Shanghai 3 Anting Co., Szanghaj, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dozownik ultradźwiękowy Yt-JY96-IIN&nbsp;</td><td>Shanghai Yetuo Technology Co., Ltd., Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa TW-1M</td><td>Tingwei Co. Ltd., Wenling, Chiny</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu pla2

A Liposome Membrane Permeability Assay for Investigating the Effects of Phosphatidylinositol Phosphate Groups on Membranotropic Action of Venom PLA2

Opracowaliśmy nowatorski, opłacalny i bardzo czuły test oceniający przepuszczalność błony liposomalowej, oparty na reakcjach podstawiania ligandów z udziałem ligandów zamkniętych w wewnętrznej objętości liposomów, który połączyliśmy z testem aktywności hydrolitycznej (z użyciem acylacji koenzymu A) oraz symulacją modelowania molekularnego, aby zbadać, czy fosforany pierścienia inozytolu w fosfatydylinozytolu chronią błony przed szkodliwym skutkiem enzymów o nieprawidłowej ekspresji. Nieprawidłowa ekspresja fosfolipaz A2 (PLA2) prowadzi do demielinizacji aksonów, co wywołuje rozwój stwardnienia rozsianego i choroby Alzheimera. Aby naśladować efekty nieprawidłowo ekspresyjnego PLA2, użyliśmy podstawowej podjednostki jadu żmijowego PLA2, HDP-2P. HDP-2P testowano na liposomach fosfatydylocholinowych (PC) wzbogaconych w fosfatydylininozytol, fosfatydylininozytol-4-fosforan (PI-4-P) lub fosfatydylinozytol-4,5-difosforan (PI-4,5-P2). Podczas gdy HDP-2P wykazywał minimalną aktywność hydrolityczną i jedynie nieznacznie zwiększoną przepuszczalność w liposomach PC, wzbogacenie liposomów PC o PI poprawiło zarówno hydrolizę, jak i przepuszczalność. Co niezwykłe, PI-4-P i PI-4,5-P2 dramatycznie hamowały aktywność hydrolityczną HDP-2P i całkowicie zmniejszały przepuszczalność. Symulacje modelowania molekularnego wykazały, że fosforany pierścienia inozytolu w fosfatydylinozytolu sterycznie blokują dostęp fosfolipidów do aktywnego miejsca HDP-2P, zapobiegając hydrolizie. Zarówno dane in vitro, jak i in silico sugerują, że fosforylowane fosfatydylininozytole wiążą się ze zmniejszoną aktywnością PLA2, co wskazuje na potencjalny mechanizm łagodzenia nadmiernej aktywności PLA2 — prawdopodobnie jako sposób ochrony błon komórkowych przed degeneracją.

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

We developed a novel, cost-effective, and highly sensitive assay for assessing liposomal membrane permeability based on ligand substitution reactions ...

a-liposome-membrane-permeability-assay-for-investigating-effects

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

W tym filmie demonstrujemy test pozwalający ustalić obecność fosfolipazy w surowym ekstrakcie z jadu Anthopleura dowii - morskiego ukwiału. Test wykorzystuje technikę dyfuzji żelu agarozowego, w której enzym fosfolipaza dyfunduje i rozkłada fosfolipidy zawarte w pożywce stałej w sposób promienisty.

Test aktywności fosfolipazy: Test dyfuzji żelu w celu określenia aktywności fosfolipazy w surowym ekstrakcie jadu z Anthopleura dowii

Ten film omawia test wycieku fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydów penetrujących komórki z błonami komórkowymi za pomocą mimiki błony komórkowej - dużych pęcherzyków jednopłytkowych lub LUV, otoczonych barwnikiem fluorescencyjnym i gaszącym.

Test nieszczelności fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydu przenikającego przez komórkę z błoną

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Poznaj metodę oceny przepuszczalności błon liposomowych zwiększającą czułość detekcji zmian wywołanych przez fosfolipazę A2. Technika ta umożliwia badania w biofizyce membran i interakcjach toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2 (Wideo) | JoVE Journal

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA₂

Przeglądaj więcej filmów