Name: Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół IBEX z blokowaniem heparynowym i detekcją spektralną do obrazowania wysoko-plexowego tkanek z obfitością eozynofilów. Metoda eliminuje autofluorescencję i niespecyficzne wiązanie, umożliwiając precyzyjną analizę przestrzenną proteomiki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Andrei Radtke i dr Zivowi Yaniv za wsparcie podczas wdrażania i doskonalenia IBEX. Dziękujemy dr João Bronze de Firmino i dr Mouhanad Babi za wsparcie mikroskopii i rozwiązywanie problemów oraz Centrum Zaawansowanej Mikroskopii Świetlnej na McMaster za dostęp do ich mikroskopów. Dziękujemy Tinie Walker, Jianpingowi Wenowi i Ranganowi Talpe Guruge za wsparcie techniczne. Prace te są wspierane przez recenzowany grant badawczy na temat alergii pokarmowych, finansowany wspólnie przez CIHR Institute of Infection and Immunity (CIHR-III), CIHR Institute of Circulatory and Respiratory Health (CIHR-ICRH) oraz Canadian Allergy Asthma and Immunology Foundation (CAAIF). Prace te zostały sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research (PJT-198169; JFEK), GRANT BADAWCZY J.P. Bickell Foundation (JFEK), Kanadyjska Fundacja Astmy i Immunologii (JFEK, MJ), Kanadyjskie Towarzystwo Alergii i Immunologii Klinicznej (VO, MJ), Fundacja Schroeder (JFEK, SW, MJ), Food Allergy Canada (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), Zych Family (SW, MJ), Buckrell Family (JFEK), Ontario Graduate Scholarship (SD) oraz program licencjacki z nauk o zdrowiu na Uniwersytecie McMaster (VO).

<ol><li>Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+The+ultimate+regulator+of+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Philosoph+Trans+Royal+Soc+B%3A+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function.</a> Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).</li>
<li>Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+Cell+Identity+with+Single-Cell+Omics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Defining Cell Identity with Single-Cell Omics.</a> Proteomics. 18 (18), (2018).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Genomics%3A+Advances+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genet. 10 (1), (2014).</li>
<li>de Vries, N. L., Mahfouz, A., Koning, F., de Miranda, N. F. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Complexity+of+the+Cancer+Microenvironment+With+Multidimensional+Genomic+and+Cytometric+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Complexity of the Cancer Microenvironment With Multidimensional Genomic and Cytometric Technologies.</a> Front Oncol. , 10(2020).</li>
<li>van Dam, S., Baars, M. J. D., Vercoulen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Tissue+Imaging%3A+Spatial+Revelations+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Multiplex Tissue Imaging: Spatial Revelations in the Tumor Microenvironment.</a> Cancers. 14 (13), (2022).</li>
<li>Bressan, D., Battistoni, G., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dawn+of+spatial+omics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dawn of spatial omics.</a> Science. 381 (6657), (2023).</li>
<li>Williams, C. G., Lee, H. J., Asatsuma, T., Vento-Tormo, R., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+spatial+transcriptomics+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Med%22%5BJournal%5D)">An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research.</a> Gen Med. 14 (1), (2022).</li>
<li>Ståhl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+analysis+of+gene+expression+in+tissue+sections+by+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics.</a> Science. 353 (6294), (2016).</li>
<li>Pascal, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+and+protein+levels%3A+Cell+type-specific+gene+expression+of+cluster+designation+antigens+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA and protein levels: Cell type-specific gene expression of cluster designation antigens in the prostate.</a> BMC Genom. 9, (2008).</li>
<li>Patel, S. S., Rodig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Tissue+Imaging+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of Tissue Imaging Methods.</a> Methods Mol Biol. 2055, (2020).</li>
<li>Ohno, M., Karagiannis, P., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+analyses+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Protein expression analyses at the single cell level.</a> Molecules. 19 (9), (2014).</li>
<li>Zimmermann, T., Marrison, J., Hogg, K., O’Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+up+the+signal%3A+Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Clearing up the signal: Spectral imaging and linear unmixing in fluorescence microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 1075(2014).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+an+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), (2022).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Aca+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Aca Sci U S A. 117 (52), (2020).</li>
<li>Kothurkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%99Iterative+Bleaching+Extends+Multiplexity%E2%80%99+facilitates+simultaneous+identification+of+all+major+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">’Iterative Bleaching Extends Multiplexity’ facilitates simultaneous identification of all major retinal cell types.</a> J Cell Sci. 137 (23), (2024).</li>
<li>Cohn, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+spatial+cell-cell+interactions+in+the+solid+tumour+microenvironment+through+the+lens+of+highly+multiplexed+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Delineating spatial cell-cell interactions in the solid tumour microenvironment through the lens of highly multiplexed imaging.</a> Front Immunol. 14, (2023).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+An+open+and+extensible+method+for+high+content+multiplex+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">IBEX: An open and extensible method for high content multiplex imaging of diverse tissues.</a> arXiv. , (2021).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IBEX+Knowledge-Base%3A+A+central+resource+for+multiplexed+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The IBEX Knowledge-Base: A central resource for multiplexed imaging techniques.</a> PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).</li>
<li>Croce, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+and+Autofluorescence%2C+Multitasking+Features+in+Living+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem%22%5BJournal%5D)">Light and Autofluorescence, Multitasking Features in Living Organisms.</a> Photochem. 1 (2), (2021).</li>
<li>Wizenty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence%3A+A+potential+pitfall+in+immunofluorescence-based+inflammation+grading%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence: A potential pitfall in immunofluorescence-based inflammation grading.</a> J Immunol Methods. 456, (2018).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Staining.</a> Curr Protoc Cell Biol. 69 (1), 4.3.1-4.3.7 (2015).</li>
<li>Sicherre, E., Favier, A. L., Riccobono, D., Nikovics, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-specific+binding%2C+a+limitation+of+the+immunofluorescence+method+to+study+macrophages+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Non-specific binding, a limitation of the immunofluorescence method to study macrophages in situ.</a> Genes. 12 (5), (2021).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Monique+Hartlen%C2%A0Histotechnology+Lab+Manual%22">Monique Hartlen Histotechnology Lab Manual</a>. , NSCC. (2022).</li>
<li>Stephen Peters Frozen Section Technique. , Pathology Innovations, LLC. 
 <a target="_blank" href="https://pathology-innovations.squarespace.com/frozen-section-technique">https://pathology-innovations.squarespace.com/frozen-section-technique</a> (2023).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nat Methods. 18 (1), (2021).</li>
<li>Mayeno, A. N., Hamann, K. J., Gleich, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granule-associated+flavin+adenine+dinucleotide+%28FAD%29+is+responsible+for+eosinophil+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Granule-associated flavin adenine dinucleotide (FAD) is responsible for eosinophil autofluorescence.</a> J Leukocyte Biol. 51 (2), (1992).</li>
<li>Jenvey, C. J., Stabel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+and+Nonspecific+Immunofluorescent+Labeling+in+Frozen+Bovine+Intestinal+Tissue+Sections%3A+Solutions+for+Multicolor+Immunofluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence and Nonspecific Immunofluorescent Labeling in Frozen Bovine Intestinal Tissue Sections: Solutions for Multicolor Immunofluorescence Experiments.</a> J Histochem Cytochem. 65 (9), (2017).</li>
<li>Vlaminck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+local+eosinophilia+in+the+surgical+outcome+of+chronic+rhinosinusitis%3A+A+3-year+prospective+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Rhinol+Allergy%22%5BJournal%5D)">The importance of local eosinophilia in the surgical outcome of chronic rhinosinusitis: A 3-year prospective observational study.</a> Am J Rhinol Allergy. 28 (3), (2014).</li>
<li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+morphologies%3A+their+diversity+and+functional+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), (2017).</li>
<li>Duhamel, R. C., Johnson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonfat+dry+milk+to+block+nonspecific+nuclear+and+membrane+staining+by+avidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 33 (7), (1985).</li>
<li>Valnes, K., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+nonspecific+eosinophil+staining+or+identification+of+eosinophilic+granulocytes+by+paired+counterstaining+in+immunofluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of nonspecific eosinophil staining or identification of eosinophilic granulocytes by paired counterstaining in immunofluorescence studies.</a> J Histochem Cytochem. 29 (5), (1981).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47 (9), (1999).</li>
<li>Bystrom, J., Amin, K., Bishop-Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+the+eosinophil+cationic+protein+-+a+clue+to+the+function+of+the+eosinophil+granulocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Res%22%5BJournal%5D)">Analysing the eosinophil cationic protein - a clue to the function of the eosinophil granulocyte.</a> Respiratory Res. , 12(2011).</li>
<li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cyt+Part+A%22%5BJournal%5D)">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cyt Part A. 89 (6), (2016).</li>
<li>Saitou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+intrinsic+fluorescence+spectra-based+digital+pathology+of+liver+fibrosis+by+marker-controlled+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue intrinsic fluorescence spectra-based digital pathology of liver fibrosis by marker-controlled segmentation.</a> Front Med. 5 (DEC), (2018).</li>
<li>Acuña-Rodriguez, J. P., Mena-Vega, J. P., Argüello-Miranda, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+spectral+imaging+as+a+data+science+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence spectral imaging as a data science challenge.</a> Biophys Rev. 14 (2), (2022).</li>
<li>Constantinou, P., Dacosta, R. S., Wilson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+immunofluorescence+detection+limits+in+whole+paraffin-embedded+formalin+fixed+tissues+using+hyperspectral+confocal+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Extending immunofluorescence detection limits in whole paraffin-embedded formalin fixed tissues using hyperspectral confocal fluorescence imaging.</a> J Microscopy. 234 (2), (2009).</li>
<li>Enninful, A., Baysoy, A., Fan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmixing+for+ultra-high-plex+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Unmixing for ultra-high-plex fluorescence imaging.</a> Nat Comm. 13 (1), (2022).</li>
<li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cyt+Part+A%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Cytometry.</a> Cyt Part A. 91 (2), (2017).</li>
<li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nat Med. 20 (4), (2014).</li>
<li>Baharlou, H., Canete, N. P., Cunningham, A. L., Harman, A. N., Patrick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry+Imaging+for+the+Study+of+Human+Diseases%E2%80%94Applications+and+Data+Analysis+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry Imaging for the Study of Human Diseases—Applications and Data Analysis Strategies.</a> Front Immunol. 10, (2019).</li>
<li>Goltsev, Y., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CODEX+multiplexed+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CODEX multiplexed tissue imaging.</a> Nat Rev Immunol. 23 (10), 613-613 (2023).</li>
<li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nat Protoc. 16 (8), (2021).</li>
<li>Vorobjev, I. A., Kussanova, A., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Spectral+Imaging+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Spectral Imaging Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2635, (2023).</li>
<li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Immunofluorescence+Tyramide+Signal+Amplification+for+Immune+Cell+Profiling+of+Paraffin-Embedded+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification for Immune Cell Profiling of Paraffin-Embedded Tumor Tissues.</a> Front Mol Biosci. 8, (2021).</li>
</ol>

JFEK, MJ otrzymują finansowanie od ALK Abello A/S. JFEK otrzymuje opłaty konsultacyjne od Merida Biosciences.

Spektralny IBEX, adaptacja protokołu IBEX, skutecznie rozwiązuje dwa kluczowe problemy w obrazowaniu immunofluorescencji: wiązanie niespecyficzne oraz autofluorescencję. Traktowanie wysoce eozynofilnych tkanek heparyną oraz stosowanie spektralnego rozdzielania w celu wyeliminowania autofluorescencji i nakładania się spektralnego między kanałami znacząco zwiększyło wykrywanie prawdziwego sygnału powyżej tła. Przechwycenie wszystkich markerów w jednym przebiegu skraca czas pozyskiwania, co może zwiększyć tempo cyklowania I...

Tkanki składają się z różnorodnego zestawu komórek o specjalistycznych funkcjach, które organizują się w trójwymiarowe struktury i poprzez interakcje koordynują procesy biologiczne niezbędne do życia. Patologia powstaje, gdy zaburzenia składu komórkowego lub architektury tkanek zakłócają te interakcje i zaburzają homeostazę tkanek1. Wiedza o tym, jak liczne wyspecjalizowane typy komórek lokalizują i oddziałują w naszych tkankach, jest niezbędna, aby zrozumieć biologię leżącą u podstaw ludzkiego zdrowia i chorób.
Postępy w technologiach profilowania pojedynczych komórek na poziomie transkryptomicznym, epigenomicznym i proteomicznym ujawniły wyjątkową różnorodność wyspecjalizowanych typów komórek. 2,3 Technologie takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek oraz cytometria przepływowa spektralna mogą mierzyć liczbę parametrów potrzebnych do scharakteryzowania tych heterogenicznych populacji. Jednak te podejścia nie zawierają informacji przestrzennej, ponieważ komórki muszą być rozdzielone od swojego rodzimego środowiska tkankowego do zawiesin pojedynczych komórek 4,5. W związku z tym zidentyfikowano typy komórek powiązane z różnymi kontekstami chorób, jednak ich interakcje w tkance oraz ich wkład w utrwalanie choroby pozostają niejasne.
Aby rozwiązać niektóre z tych ograniczeń, opracowano kilka technologii przestrzennej omiki, które rejestrują heterogeniczność komórkową w tkance, jednocześnie zachowując pozycję każdej komórki6. Na przykład transkrypcję genów można zmierzyć albo poprzez amplifikację RNA w zrasteryzowanych miejscach na przekroju tkanki (np. Visium) lub poprzez wykorzystanie sond hybrydyzujących RNA skierowanych na panel określonych genów obrazowanych w rozdzielczości pojedynczej komórki (np. Xenium)7,8. Metody te są skuteczne w śledzeniu wzorców transkrypcji i mechanizmów regulacyjnych w tkankach. Jednak profile transkrypcyjne często słabo korelują z ekspresją białek, co bardziej bezpośrednio odzwierciedla funkcjonalne możliwości komórki9. Ekspresję białek można zidentyfikować za pomocą specyficznych przeciwciał sprzężonych z fluoroforami, które można wykryć mikroskopią fluorescencyjną10,11. Zastosowanie tradycyjnej mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na dyskretne obrazowanie nawet sześciu takich fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami. Jednak nakładające się profile wzbudzenia i emisji tych fluoroforów powodują niepewność co do pochodzenia sygnału fluorescencyjnego w dowolnym kanale12.
Iterative Bleaching Extending multipleXity (IBEX) to metoda obrazowania o wysokiej zawartości ciała, opracowana w celu przezwyciężenia ograniczeń mikroskopii fluorescencyjnej 13,14,15. IBEX wykorzystuje borowodnik litu (LiBH4) do chemicznej inaktywacji fluoroforów po obrazowaniu, co pozwala na ponowne zabarwienie tej samej próbki tkanki kolejną serią przeciwciał sprzężonych z fluoroforami przed ponownym obrazowaniem. IBEX zachowuje integralność tkanek, umożliwiając wiele rund obrazowania w celu wizualizacji teoretycznie nieograniczonej liczby markerów na tym samym przekroju tkanki. Obliczeniowe wyrównanie pozyskanych obrazów zapewnia charakteryzację na poziomie omiki w rozdzielczości pojedynczej komórki, jednocześnie zachowując dane przestrzenne, aby ujawnić nisze komórkowe. Dane te mogą również ujawnić domniemane interakcje komórkowe, choć należy je zweryfikować innymi technikami16. IBEX to otwartoźródłowa metoda kompatybilna z komercyjnie dostępnymi fluoroforami i wspierana przez międzynarodową społeczność badaczy, którzy zweryfikowali odczynniki i publicznie udostępniają dane, aby promować dostępność, szybkie wdrożenie oraz wysokiej jakości generowanie danych17,18.
W tej pracy opracowano zmodyfikowany protokół IBEX, aby pokonać dwa główne wyzwania tej techniki: autofluorescencję tkanek oraz niespecyficzne wiązanie sond przeciwciał sprzężonych z fluoroforem (łącznie określanych jako tło). Autofluorescencja powstaje, gdy wzbudzenie fluorescencjonujących cząsteczek endogennych dla tkanki emituje światło nakładające się na pożądany sygnał uzyskany z fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami19,20. Niedocelowe lub niespecyficzne wiązanie przeciwciał sprzężonych z fluoroforem skutkuje fluorescencją komórek lub struktur, które nie wyrażają docelowego białka21,22. Te artefakty mogą prowadzić do błędnego wniosku, że komórka wyraża marker, którego nie wyraża w rzeczywistości, co komplikuje analizy obliczeniowe i dokładne przypisywanie typów komórek. Łącząc neutralizację ładunku sygnału poza celem opartą na heparynie z pełnym spektralnym akwizycją i rozdzielaniem obliczeniowym, spektralny IBEX znacząco zmniejsza przepuszczanie sygnału do tła (SBR) i skraca czas nabycia na pocisk o połowę.

<table><tbody><tr><td>Roztwór kwasu siarkowego 2N (H2SO4)</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Zlewka 500 mL</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Płyta 6-dołkowa</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Bcl-6 - Alexa Fluor 647</td><td>BD Biosciences</td><td>561525</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do dyssekcii stołowej</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD11c - Alexa Fluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>561352</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD138/Syndecan-1 - PE</td><td>BioLegend</td><td>356503</td><td>Współczynnik rozcieńczania 1:200</td></tr><tr><td>CD20 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53020282</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD21 - Alexa Fluor 532</td><td>NovusBio</td><td>NBP2-60733AF532</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD23 - PE</td><td>BioLegend</td><td>338507</td><td>Współczynnik rozcieńczania 1:200</td></tr><tr><td>CD3 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>100320C0</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD31 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303134</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD34 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>103400C0</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD38 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303523</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD4 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>300520</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD45 - Alexa Fluor 532</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>58045942</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>353113</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Klej chromowo-żelatynowy</td><td>Dostawa dla nowicjuszy</td><td>1033A</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>NC9511236</td><td>Również numer katalogowy 50-465-347 dla większych próbek</td></tr><tr><td>Suwak kalibracyjny DAPI</td><td>Agar Scientific</td><td>AG2273</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DAPI, 1 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:3000</td></tr><tr><td>E-kadherin/CD324 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>147307</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594</td><td>BioLegend</td><td>324228</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Rury Eppendorf/Falcon</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>FoxP3 - eFluor 660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50577382</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe z matowym końcem</td><td>ChemScience</td><td>GEW45-2575-W</td><td></td></tr><tr><td>GL7 - Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53590282</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>10KU</td></tr><tr><td>HLA-DR - PE</td><td>NovusBio</td><td>NB100-77855PE</td><td>Współczynnik rozcieńczania 1:200</td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (Roztwór blokujący receptory Fc)</td><td>BioLegend</td><td>422302</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Komora wilgotności</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Wiadro na lód z pokrywką</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>IgD - Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>348215</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>IL4Ra/CD124 - PE</td><td>BioLegend</td><td>144803</td><td>Współczynnik rozcieńczania 1:200</td></tr><tr><td>Konwerter plików Imaris</td><td>Instrumenty OXFORD</td><td>Nie ma</td><td>Pokrywanie dowolnego formatu pliku obrazu do formatu .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)</td></tr><tr><td>Izopentan (2-metylobutan)</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Ki-67 - Alexa Fluor 488</td><td>BD Biosciences</td><td>558616</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne Wycieraczki Zadaniowe, 1-P</td><td>Nauka Kimtech</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Duże (czyli 25 cm długości) kleszcze</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Borowodnikiem litu (LiBH4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>222356</td><td></td></tr><tr><td>MECA-79 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53603680</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Szkło szkła szkła szkiełka mikroskopowego nr 1 22x50 mm</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Woda Milli-Q</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>MUC2 - Alexa Fluor 488</td><td>NovusBio</td><td>NB120-11197AF488</td><td>Współczynnik rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Komora Pokrywa Osłonowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Długopis PAP</td><td>abcam</td><td>AB2601</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fosforanowej z buforem fizjologicznym (PBS)</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Cokolwiek jest dostępne lub używane w laboratorium</td></tr><tr><td>Rozszerzenia SimpleITK Imaris</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Oprogramowanie używane do wyrównywania obrazów z różnych rund (https://github.com/niaid/imaris_extensions)</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980</td><td>Mikroskopia ZEISS</td><td>Nie ma</td><td>System obrazowania użyty w tym badaniu</td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>Mikroskopia ZEISS</td><td>Nie ma</td><td>Oprogramowanie używane do przetwarzania obrazu po akwizycji</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

High-plex Imaging using Spectral Confocal Microscopy to Minimize Non-specific Tissue Fluorescence

Silnie multipleksowane obrazowanie umożliwia badanie funkcjonalnie zróżnicowanych komórek i ich nisz w ich rodzimych środowiskach tkankowych. Iteracyjne Wybielanie Rozszerza Multipleksyjność (IBEX) to cykliczna technika immunoznakowania i inaktywacji fluoroforu, która pozwala na wizualizację wielu markerów na tym samym przekroju tkanki. Przechwycone obrazy można następnie analizować w celu uzyskania danych z pojedynczych komórek w celu zdefiniowania klastrów komórek, ich lokalizacji oraz sąsiednich typów komórek. Interpretacja tych danych opiera się na zdolności rozróżniania prawdziwych wyrażeń markerów od źródeł tła, które są inherentne dla mikroskopii fluorescencyjnej. Spectral IBEX, adaptacja protokołu IBEX, integruje spektralną konfokalną detekcję z obliczeniowym rozmieszaniem i wykorzystuje blokowanie heparyny, aby zmniejszyć wiązanie pozacelowe na podstawie ładunku. To połączenie poprawia stosunek sygnału do tła, tłumi autofluorescencję tkanek i minimalizuje przeciekanie, jednocześnie skracając czas akwizycji w porównaniu z konwencjonalnym wielotorowym obrazowaniem konfokalnym. Zastosowanie na ludzkiej tkance nosowej polipów, modelu charakteryzującego się wysoką zawartością eozynofilów i silną autofluorescencją, wykazało wiarygodne obrazowanie 26 markerów w przedziałach strukturalnych, immunologicznych i stanów komórkowych w sześciu cyklach obrazowania. Powstały w ten sposób workflow generuje wysokowymiarowe, przestrzennie rozdzielone informacje proteomiczne, które oddają złożoną architekturę tkanek i nisze komórkowe. To zoptymalizowane podejście razem zapewnia solidną i szeroko stosowalną strategię obrazowania multipleksowego, szczególnie odpowiednią dla tkanek, gdzie autofluorescencja i niespecyficzne barwienie ograniczają konwencjonalne podejścia.

Dwa podstawowe wyzwania związane z technikami obrazowania immunofluorescencyjnego to niespecyficzne wiązanie sond przeciwciał sprzężonych z fluoroforem oraz autofluorescencji tkankowej. Protokół ten został zaprojektowany, aby pomóc odróżnić prawdziwy sygnał od tła i zoptymalizować techniki multipleksowanej immunofluorescencji.
Blokowanie heparyny zmniejsza niespecyficzne wiązanie fluoroforów, jednocześnie zachowując sygn...

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Highly multiplexed imaging enables the study of functionally diverse cells and their niches within their native tissue environments. Iterative Bleaching ...

Optymalizujemy workflow IBEX, który łączy blokowanie heparyny i detekcję spektralną, aby stłumić tło w tkankach ludzkich bogatych w eozynofile. Autofluorescencja i wiązanie eozynofilowych granulek zaciemniają prawdziwy sygnał. Celujemy w oba, aby umożliwić czyste mapy High Plex.Na początek narysuj okrąg na szklanym szkiełku wokół zamontowanej chusteczki za pomocą cytologii, aby stworzyć barierę hydrofobową. Do każdej tkanki dodaj około 100 mikrolitrów PBS, aby je nawilżyć, i inkubuj preparat przez około dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zmyć związek o temperaturze strzyżenia. Aspiruj PBS wokół tkanki za pomocą pipety Pasteura z szkła ssącego.Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu blokującego do każdej tkanki i inkubuj w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności przez godzinę. Teraz zasysaj bufor blokujący pipetą. Dodaj 100 mikrolitrów barwienia wymieszanego do każdej tkanki i inkubuj szkiełko w zakrytej komorze wilgotności wewnątrz lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Podobnie przygotować przekroj barwiony tylko jednym fluoroforem oraz negatywną kontrolę bez barwienia, aby zdefiniować widmo fluoroforów i autofluorescencję tkankową. Po aspiracji mieszanki barwiącej myj tkankę trzykrotnie PBS, a po każdym myciu wdysaj płyn. Zamontuj próbkę na mikroskopie do obrazowania.Skup się na próbce za pomocą trybu kontrastu jasnego pola lub różnicy interferencyjnej. Następnie przełącz się w tryb fluorescencji i konfiguruje parametry akwizycji widmowej zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Przypisz odpowiednie lasery do fluoroforów używanych w eksperymencie.Wybierz rozdzielacz wiązki odpowiadający wybranym liniom laserowym. Umożliwić wszystkim detektorom rejestrowanie pełnego spektrum emisji i dostosować rozdzielczość akwizycji obrazu do jednej z wcześniej zdefiniowanych rozdzielczości. Albo wybierz maksymalną rozdzielczość.Dostosuj rozmiar otworu do jednej jednostki powierzchni, aby uzyskać optymalne przekroje optyczne. Zoptymalizuj ustawienia lasera przed akwizycją. Używając sekcji barwionej wszystkimi markerami, rozpocznij tryb ciągłego skanowania przy niskiej mocy lasera.Dostosuj wzmocnienie główne każdego detektora oraz intensywność lasera, aż wszystkie markery będą rozpoznawalne z dobrym stosunkiem sygnału do tła. Precyzyjnie dostosowuj intensywność lasera i iteracyjnie przełączaj pojedyncze przekroje barwienia i wielobarwne, aż wszystkie sygnały fluoroforowe będą widoczne bez przesycenia. Włącz funkcję kafelków w oprogramowaniu do akwizycji i zdefiniuj obszar akwizycji wokół tkanki, aby zapewnić pełne pokrycie obrazu.Optymalizuj ostrość dla obszaru pozyskiwania kafelków w centrum tkanki. Zidentyfikuj unikalną cechę strukturalną, taką jak wyraźny zestaw komórek w rozpoznawalnym układzie, aby służyć jako odniesienie do wyrównania w kolejnych rundach obrazowania. Teraz włącz funkcję Z-stack i przejdź do zakładki Z-stack.W zakładce środkowej ustaw liczbę kawałków na co najmniej sześć, z odstępem co najmniej jednego mikrometra między kawałkami. Kliknij przycisk środkowy, aby ustawić aktualny punkt ostrości określony w poprzednim kroku jako środkowy fragment stosu. Kliknij przycisk start eksperymentu, aby rozpocząć akwizycję obrazu.Po zakończeniu akwizycji kliknij prawym przyciskiem myszy na miniaturę obrazu, wybierz Zapisz jako. Wybierz lokalizację pliku i nazwij obraz. Zrób kopię zapasową danych obrazowych na bezpieczne miejsce. Rozmieszaj obraz, używając tych samych zoptymalizowanych ustawień, które zastosowano podczas akwizycji obszarów kafelkowanych.Uchwyć zatrzask z każdego pojedynczo barwionego kontrolera, aby uzyskać prawdziwe widmo sygnału, a z niebarwionego kontrolera, aby uchwycić tło lub autofluorescencję. Używaj tych obrazów wyłącznie do rozmieszania spektralnego. Potwierdź, że wybrany obszar stanowi prawdziwy sygnał, sprawdzając, czy intensywność i morfologia są nieobecne lub równoważne poziomom tła w niebarwionej kontroli, a lokalizacja markerów odpowiada oczekiwanemu wzorcowi komórkowemu, takim jak błona, jądrowa, cytoplazmatyczna lub wydzielana dystrybucja.Otwórz obraz snap w oprogramowaniu. Kliknij zakładkę rozłączania i wybierz jedno z narzędzi wyboru regionów w zakładce narzędzia niemieszane, rysuj obszar zainteresowania lub ROI wokół dodatniego sygnału, aby wygenerować widmo tego obszaru. Porównaj każde wygenerowane widmo z teoretycznym widmem emisji odpowiadającego fluoroforu.Upewnij się, że region dokładnie odzwierciedla prawdziwy sygnał. Nazwij każde widmo zgodnie z tożsamością fluoroforu i zapisz je w bazie danych widmowych. Następnie załaduj kafelkowy obraz i otwórz narzędzie do rozmieszania.Użyj przycisku plus, aby dodać widma odniesienia dla każdego fluoroforu do listy do rozmieszania. Kliknij przycisk liniowego rozmieszania, aby oddzielić sygnały spektralne i zapisać obraz niezmieszany. Przygotuj roztwór wybielający w okapie oparowym.Za pomocą mikrołopatki zważ 10 miligramów borowodniku litu bezpośrednio do suchej zlewki. Ostrożnie dodaj do zlewki 10 mililitrów ultraczystej wody i mieszaj, aż związek całkowicie się rozpuści. Dodaj około 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielającego do każdej sekcji tkanki za pomocą szklanej pipety Pasteura i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut wewnątrz okapu oparowego.Jeśli wybielający jaskrawy fiolet umiera, ostrożnie przenieś szkiełko do mikroskopu epifluorescencyjnego i wybierz filtr dappy. Skup próbkę i oświetl ją na pełną moc. Teraz użyj obiektywu 5X, aby uzyskać większe pole oświetlenia i całkowicie obniżyć scenę, aby zapobiec jakimkolwiek kontaktom między zamkiem a obiektywem lub obudową.Na koniec przelej roztwór borowodniku litu z każdego odwiertu za pomocą szklanej pipety Pasteura i zwróć go do oryginalnej zlewki roztworu wybielającego. Płucz szkiełka trzy razy buforem rozcieńczającym i inkubuj przez około trzy minuty podczas każdego mycia. Dodaj mieszankę przeciwciał i zabarw próbkę, jak pokazano wcześniej.W nieleczonych polipach nosa barwienia tkanek CD3, CD4 i CD20 wykazały intensywną, niespecyficzną fluorescencję ziarnistą w obszarach bogatych w eozynofile. Podczas gdy prawdziwy sygnał lokalizowany błonowy występował przy niższej intensywności. Wstępne traktowanie mlekiem odtłuszczonym 5% nie zablokowało całkowicie niespecyficznej fluorescencji, a także zmniejszyło intensywność sygnału dla fluoroforu, takiego jak AF 532.Przedzabieg dab zmniejszył niespecyficzną fluorescencję z CD20, CD3 i CD4, ale także zmniejszył prawdziwą intensywność sygnału na wielu kanałach, w tym DAPI i AF532. Wstępne leczenie heparyną skutecznie blokowało niespecyficzne wiązanie, jednocześnie utrzymując wysoką intensywność sygnału dla CD3, CD4, CD20 i DAPI. Heparyna blokowała sygnał niespecyficzny w sposób zależny od stężenia, z całkowitym zahamowaniem osiągniętym przy 10 jednostkach i bez zaobserwowanych szkodliwych efektów przy wyższych stężeniach.Trójścieżkowy system obrazowania skrócił czas przechwytu, ale wprowadził przesłuchy, w tym przenikanie AF 594 do kanału PE oraz zwiększone autofluorescencje tkanek dzięki wielokrotnym wzbudzeniom laserowym. Obrazowanie spektralne wyeliminowało niemal całkowicie tło i przesłuchy, jednocześnie skracając czas akwizycji i poprawiając stosunek sygnału do tła. Spektralne obrazowanie IBEX ludzkiego polipa nosowego wykazało struktury nabłonkowe oznaczone metodą EpCAM.komórki odpornościowe, takie jak limfocyty pozytywne na CD3 i CD20, oraz naczynia ekspresyjne na CD31 i CD34. Leczenie heparyną eliminowało wiązanie granulek bez redukcji sygnału, utrzymując silne tłumienie tła we wszystkich cyklach IBEX. Rozmieszanie spektralne minimalizuje przenikanie, a autofluorescencja zwiększa sygnał do tła i znacząco przyspiesza akwizycję wielopanelową w porównaniu do wielościeżkowego konfokalu.Umożliwia to solidną proteomikę przestrzenną oraz wymagające tkanki, wspierające dokładne mapowanie stanu komórek i analizę na poziomie sąsiedztwa.

high-plex-imaging-using-spectral-confocal-microscopy-to-minimize-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Obrazowanie spektralne stało się niezawodnym rozwiązaniem do identyfikacji i separacji wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce i może łatwo odróżnić interesujące sygnały od tła lub autofluorescencji. Obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia ulepsza tę technikę, skracając niezbędny czas akwizycji obrazu przy jednoczesnym zwiększeniu stosunku sygnału do szumu.

Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.

Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj zoptymalizowany protokół IBEX z blokowaniem heparynowym i detekcją spektralną do obrazowania wysoko-plexowego tkanek z obfitością eozynofilów. Metoda eliminuje autofluorescencję i niespecyficzne wiązanie, umożliwiając precyzyjną analizę przestrzenną proteomiki.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Przeglądaj więcej filmów