Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek
28 października 2025
Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.
Optymalizujemy workflow IBEX, który łączy blokowanie heparyny i detekcję spektralną, aby stłumić tło w tkankach ludzkich bogatych w eozynofile. Autofluorescencja i wiązanie eozynofilowych granulek zaciemniają prawdziwy sygnał. Celujemy w oba, aby umożliwić czyste mapy High Plex.
Na początek narysuj okrąg na szklanym szkiełku wokół zamontowanej chusteczki za pomocą cytologii, aby stworzyć barierę hydrofobową. Do każdej tkanki dodaj około 100 mikrolitrów PBS, aby je nawilżyć, i inkubuj preparat przez około dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zmyć związek o temperaturze strzyżenia. Aspiruj PBS wokół tkanki za pomocą pipety Pasteura z szkła ssącego.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu blokującego do każdej tkanki i inkubuj w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności przez godzinę. Teraz zasysaj bufor blokujący pipetą. Dodaj 100 mikrolitrów barwienia wymieszanego do każdej tkanki i inkubuj szkiełko w zakrytej komorze wilgotności wewnątrz lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Podobnie przygotować przekroj barwiony tylko jednym fluoroforem oraz negatywną kontrolę bez barwienia, aby zdefiniować widmo fluoroforów i autofluorescencję tkankową. Po aspiracji mieszanki barwiącej myj tkankę trzykrotnie PBS, a po każdym myciu wdysaj płyn. Zamontuj próbkę na mikroskopie do obrazowania.
Skup się na próbce za pomocą trybu kontrastu jasnego pola lub różnicy interferencyjnej. Następnie przełącz się w tryb fluorescencji i konfiguruje parametry akwizycji widmowej zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Przypisz odpowiednie lasery do fluoroforów używanych w eksperymencie.
Wybierz rozdzielacz wiązki odpowiadający wybranym liniom laserowym. Umożliwić wszystkim detektorom rejestrowanie pełnego spektrum emisji i dostosować rozdzielczość akwizycji obrazu do jednej z wcześniej zdefiniowanych rozdzielczości. Albo wybierz maksymalną rozdzielczość.
Dostosuj rozmiar otworu do jednej jednostki powierzchni, aby uzyskać optymalne przekroje optyczne. Zoptymalizuj ustawienia lasera przed akwizycją. Używając sekcji barwionej wszystkimi markerami, rozpocznij tryb ciągłego skanowania przy niskiej mocy lasera.
Dostosuj wzmocnienie główne każdego detektora oraz intensywność lasera, aż wszystkie markery będą rozpoznawalne z dobrym stosunkiem sygnału do tła. Precyzyjnie dostosowuj intensywność lasera i iteracyjnie przełączaj pojedyncze przekroje barwienia i wielobarwne, aż wszystkie sygnały fluoroforowe będą widoczne bez przesycenia. Włącz funkcję kafelków w oprogramowaniu do akwizycji i zdefiniuj obszar akwizycji wokół tkanki, aby zapewnić pełne pokrycie obrazu.
Optymalizuj ostrość dla obszaru pozyskiwania kafelków w centrum tkanki. Zidentyfikuj unikalną cechę strukturalną, taką jak wyraźny zestaw komórek w rozpoznawalnym układzie, aby służyć jako odniesienie do wyrównania w kolejnych rundach obrazowania. Teraz włącz funkcję Z-stack i przejdź do zakładki Z-stack.
W zakładce środkowej ustaw liczbę kawałków na co najmniej sześć, z odstępem co najmniej jednego mikrometra między kawałkami. Kliknij przycisk środkowy, aby ustawić aktualny punkt ostrości określony w poprzednim kroku jako środkowy fragment stosu. Kliknij przycisk start eksperymentu, aby rozpocząć akwizycję obrazu.
Po zakończeniu akwizycji kliknij prawym przyciskiem myszy na miniaturę obrazu, wybierz Zapisz jako. Wybierz lokalizację pliku i nazwij obraz. Zrób kopię zapasową danych obrazowych na bezpieczne miejsce. Rozmieszaj obraz, używając tych samych zoptymalizowanych ustawień, które zastosowano podczas akwizycji obszarów kafelkowanych.
Uchwyć zatrzask z każdego pojedynczo barwionego kontrolera, aby uzyskać prawdziwe widmo sygnału, a z niebarwionego kontrolera, aby uchwycić tło lub autofluorescencję. Używaj tych obrazów wyłącznie do rozmieszania spektralnego. Potwierdź, że wybrany obszar stanowi prawdziwy sygnał, sprawdzając, czy intensywność i morfologia są nieobecne lub równoważne poziomom tła w niebarwionej kontroli, a lokalizacja markerów odpowiada oczekiwanemu wzorcowi komórkowemu, takim jak błona, jądrowa, cytoplazmatyczna lub wydzielana dystrybucja.
Otwórz obraz snap w oprogramowaniu. Kliknij zakładkę rozłączania i wybierz jedno z narzędzi wyboru regionów w zakładce narzędzia niemieszane, rysuj obszar zainteresowania lub ROI wokół dodatniego sygnału, aby wygenerować widmo tego obszaru. Porównaj każde wygenerowane widmo z teoretycznym widmem emisji odpowiadającego fluoroforu.
Upewnij się, że region dokładnie odzwierciedla prawdziwy sygnał. Nazwij każde widmo zgodnie z tożsamością fluoroforu i zapisz je w bazie danych widmowych. Następnie załaduj kafelkowy obraz i otwórz narzędzie do rozmieszania.
Użyj przycisku plus, aby dodać widma odniesienia dla każdego fluoroforu do listy do rozmieszania. Kliknij przycisk liniowego rozmieszania, aby oddzielić sygnały spektralne i zapisać obraz niezmieszany. Przygotuj roztwór wybielający w okapie oparowym.
Za pomocą mikrołopatki zważ 10 miligramów borowodniku litu bezpośrednio do suchej zlewki. Ostrożnie dodaj do zlewki 10 mililitrów ultraczystej wody i mieszaj, aż związek całkowicie się rozpuści. Dodaj około 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielającego do każdej sekcji tkanki za pomocą szklanej pipety Pasteura i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut wewnątrz okapu oparowego.
Jeśli wybielający jaskrawy fiolet umiera, ostrożnie przenieś szkiełko do mikroskopu epifluorescencyjnego i wybierz filtr dappy. Skup próbkę i oświetl ją na pełną moc. Teraz użyj obiektywu 5X, aby uzyskać większe pole oświetlenia i całkowicie obniżyć scenę, aby zapobiec jakimkolwiek kontaktom między zamkiem a obiektywem lub obudową.
Na koniec przelej roztwór borowodniku litu z każdego odwiertu za pomocą szklanej pipety Pasteura i zwróć go do oryginalnej zlewki roztworu wybielającego. Płucz szkiełka trzy razy buforem rozcieńczającym i inkubuj przez około trzy minuty podczas każdego mycia. Dodaj mieszankę przeciwciał i zabarw próbkę, jak pokazano wcześniej.
W nieleczonych polipach nosa barwienia tkanek CD3, CD4 i CD20 wykazały intensywną, niespecyficzną fluorescencję ziarnistą w obszarach bogatych w eozynofile. Podczas gdy prawdziwy sygnał lokalizowany błonowy występował przy niższej intensywności. Wstępne traktowanie mlekiem odtłuszczonym 5% nie zablokowało całkowicie niespecyficznej fluorescencji, a także zmniejszyło intensywność sygnału dla fluoroforu, takiego jak AF 532.
Przedzabieg dab zmniejszył niespecyficzną fluorescencję z CD20, CD3 i CD4, ale także zmniejszył prawdziwą intensywność sygnału na wielu kanałach, w tym DAPI i AF532. Wstępne leczenie heparyną skutecznie blokowało niespecyficzne wiązanie, jednocześnie utrzymując wysoką intensywność sygnału dla CD3, CD4, CD20 i DAPI. Heparyna blokowała sygnał niespecyficzny w sposób zależny od stężenia, z całkowitym zahamowaniem osiągniętym przy 10 jednostkach i bez zaobserwowanych szkodliwych efektów przy wyższych stężeniach.
Trójścieżkowy system obrazowania skrócił czas przechwytu, ale wprowadził przesłuchy, w tym przenikanie AF 594 do kanału PE oraz zwiększone autofluorescencje tkanek dzięki wielokrotnym wzbudzeniom laserowym. Obrazowanie spektralne wyeliminowało niemal całkowicie tło i przesłuchy, jednocześnie skracając czas akwizycji i poprawiając stosunek sygnału do tła. Spektralne obrazowanie IBEX ludzkiego polipa nosowego wykazało struktury nabłonkowe oznaczone metodą EpCAM.
komórki odpornościowe, takie jak limfocyty pozytywne na CD3 i CD20, oraz naczynia ekspresyjne na CD31 i CD34. Leczenie heparyną eliminowało wiązanie granulek bez redukcji sygnału, utrzymując silne tłumienie tła we wszystkich cyklach IBEX. Rozmieszanie spektralne minimalizuje przenikanie, a autofluorescencja zwiększa sygnał do tła i znacząco przyspiesza akwizycję wielopanelową w porównaniu do wielościeżkowego konfokalu.
Umożliwia to solidną proteomikę przestrzenną oraz wymagające tkanki, wspierające dokładne mapowanie stanu komórek i analizę na poziomie sąsiedztwa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie optymalizuje przepływ pracy IBEX poprzez integrację blokowania heparyną i detekcji spektrańskiej w celu poprawy czytelności sygnału w tkankach ludzkich bogatych w eozynofile. Podejście ma na celu tłumienie autofluorescencji i wiązania niespecyficznego, co ułatwia przeprowadzanie analiz proteomicznych przestrzennych z wieloma parametrami.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuroscience
- Biology
- Proteomics
Tło
- Technika IBEX jest przeznaczona do obrazowania z wieloma parametrami.
- Blokowanie heparyną minimalizuje wiązanie niespecyficzne.
- Autofluorescencja może zaciemniać prawdziwe sygnały w obrazowaniu.
- Optymalizacja przepływów pracy jest kluczowa dla dokładnej proteomiki przestrzennej.
Cel badania
- Wzmacnianie techniki IBEX w celu uzyskania jaśniejszych wyników obrazowania.
- Redukcja szumu tła w tkankach bogatych w eozynofile.
- Umożliwienie solidnych analiz proteomicznych przestrzennych w wielu rundach.
Wykorzystane metody
- Blokowanie heparyną w celu zminimalizowania wiązania niespecyficznego.
- Detekcja spektrańska z odseparowaniem obliczeniowym.
- Przygotowanie próbek tkankowych z PBS w celu rehydracji.
- Wykorzystanie barier hydrofobowych do izolacji próbek tkankowych.
Główne wyniki
- Pomyślne tłumienie autofluorescencji w obrazowaniu.
- Poprawiona czytelność map proteomicznych przestrzennych z wieloma parametrami.
- Przyspieszone procesy akwizycji obrazów.
- Wykazano odporność zoptymalizowanego przepływu pracy IBEX.
Wnioski
- Zoptymalizowana technika IBEX znacząco poprawia jakość obrazowania.
- Blokowanie heparyną skutecznie redukuje wiązanie niespecyficzne.
- Metody detekcji spektrańskiej poprawiają dokładność analiz proteomicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-plex spectral confocal imaging with IBEX enables robust spatial proteomics in tissue environments where autofluorescence and non-specific staining have previously limited data quality. By integrating heparin blocking and spectral unmixing, this workflow delivers high-dimensional, single-cell resolution maps critical for target validation and mechanistic de-risking in complex human tissues. The approach accelerates early discovery and supports confident advancement decisions in translational and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise mapping of cell clusters and their microenvironments for functional target validation.
- Reduces biological ambiguity by distinguishing true marker expression from background fluorescence.
- Supports mechanistic de-risking through high-content, spatially resolved proteomic data.
- Facilitates portfolio triage by providing robust evidence of target engagement in native tissue contexts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream multiplexed imaging workflows.
- Standardizes assay conditions to minimize bleed-through and non-specific signal.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput screening platforms.
- Enables reliable evaluation of compound effects on diverse cell populations within intact tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomic readouts with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Supports biomarker discovery and validation in challenging, autofluorescent tissues.
- Provides risk-adjusted data for preclinical advancement decisions.
- Enhances predictive confidence in tissue-level pharmacodynamics and mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized spectral IBEX workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling high-content, spatially resolved analysis in complex tissue systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving true marker localization at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-dimensional, spatially resolved proteomic data for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery through preclinical validation in disease-relevant tissue models.
- Enterprise Reuse: Establishes a broadly applicable imaging capability for diverse tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based studies.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows, improves reproducibility, and accelerates acquisition time.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust spatial data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spectral confocal microscopy and computational unmixing.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and secure data storage infrastructure.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptation may be necessary for tissues with unique autofluorescence or binding properties.
- Practical limitations include the need for validated controls and careful optimization of blocking and acquisition parameters.
