Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

Celowana terapia hipertermiczna jest nową metodą leczenia raka, mającą na celu selektywne podnoszenie temperatury guza przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń otaczających zdrowych tkanek. Metoda ta opisuje wysoce wydajny, mało zasobochłonny i powtarzalny sposób indukowania hipertermii za pośrednictwem nanoprętów złota w guzach litych. Zastosowanie bezpośredniego wstrzyknięcia doguzowego złotych nanoprętów, a następnie wystawienie na działanie światła bliskiej podczerwieni pozwala na precyzyjne, kontrolowane i wysoce zlokalizowane ogrzewanie guzów.

Powodzenie tego protokołu zależy od skutecznej aktywacji głębokich tkanek złota nanoprętów przy użyciu odpowiedniej długości fali światła bliskiej podczerwieni, a także dokładnego monitorowania wewnętrznej temperatury guza w czasie rzeczywistym przez cały czas trwania zabiegu. Rozpocznij codzienne pomiary guza, zaczynając około siódmego dnia, po wstrzyknięciu komórek rakowych lub za każdym razem, gdy guzy stają się wyczuwalne. Przed rozpoczęciem zabiegu zmierz szerokość, długość i wysokość guza, aby obliczyć całkowitą objętość guza.

Staraj się wykonać zabieg, gdy guzy osiągną przybliżoną objętość 50 milimetrów sześciennych. W przypadku naszego modelu ta objętość guza została osiągnięta między 10 a 12 dniem po wstrzyknięciu komórek rakowych. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj strzykawki o średnicy jednego miliona z igłą o rozmiarze 31, aby pobrać odpowiednią objętość złotych nanoprętów na podstawie każdej objętości guza.

Przed wstrzyknięciem nanoprętów złota znieczulij mysz za pomocą stożka nosowego dostarczającego 2% izofluranu z natężeniem przepływu 0,8 litra na minutę. Nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu i zminimalizować potencjalne uszkodzenia lasera. W razie potrzeby zgol nadmiar sierści wokół guza, aby zapewnić odsłonięcie powierzchni skóry i użyj etanolu do dezynfekcji powierzchni guza, wycierając wszelkie futro lub zanieczyszczenia.

Przed ekspozycją na laser należy wstrzyknąć domięśniowo złote nanopręty w stężeniu jednego mikrograma na milimetr sześcienny objętości guza. W razie potrzeby należy podzielić wstrzyknięcie między dwa miejsca wewnątrznowotworowe, aby zapewnić efektywną dystrybucję złotych nanoprętów wewnątrz guza. Upewnij się, że po wstrzyknięciu zetrzełeś nadmiar złotych nanoprętów z powierzchni skóry.

W przypadku myszy z grupy kontrolnej należy podać doguzowe wstrzyknięcie sterylnego PBS o równoważnej objętości stosowanej w grupach leczonych złotym nanoprętem. Przed włożeniem sondy temperatury wewnątrznowotworowej należy oczyścić ją etanolem. Delikatnie włóż sondę temperatury do środka masy guza.

Nałóż jednolitą warstwę żelu Aloe Vera o grubości około pięciu milimetrów na powierzchnię guza, aby zapobiec owrzodzeniu skóry i zminimalizować ryzyko urazu termicznego podczas leczenia. Dostosuj laser tak, aby ustawił się bezpośrednio nad środkiem guza. Skorzystaj z tabeli przeglądowej natężenia promieniowania, aby określić najlepszą wysokość lasera w oparciu o wymaganą średnicę wiązki laserowej, aby pokryć obszar guza.

Włącz laser i termoelektryczne źródło chłodzenia. Następnie podłącz system laserowy do źródła zasilania. Włącz termoelektryczne źródło chłodzenia.

Niebieska dioda LED włączy się i po 30 sekundach temperatura ustabilizuje się na poziomie 25 stopni Celsjusza. Opierając się na tabeli wyszukiwania natężenia promieniowania, dostosuj prąd wyjściowy lasera, aby osiągnąć docelowe natężenie promieniowania około jednego wata na centymetr kwadratowy. W naszym eksperymencie wysokość lasera wynosząca 1,5 centymetra, średnica wiązki 1,3 centymetra i prąd lasera wynoszący 1800 miliamperów dały wartość natężenia promieniowania wynoszącą 0,82 wata na centymetr kwadratowy, która została zoptymalizowana dla naszego modelu guza.

Od tego momentu upewnij się, że wszystkie osoby w sali operacyjnej lasera noszą certyfikowane laserowe okulary ochronne dla używanej długości fali światła. Ustaw kamerę termowizyjną przylegającą do platformy laserowej skierowaną na mysz, aby monitorować temperaturę powierzchni skóry podczas zabiegu laserowego. Rozpocznij rejestrację w oprogramowaniu do rejestrowania danych sprzężonych termicznie i upewnij się, że wykres wewnętrznej temperatury guza w funkcji czasu jest wyświetlany w czasie rzeczywistym.

Przekręć klucz bezpieczeństwa lasera, aby włączyć wyjście źródła. Rozpocznij podawanie lasera, naciskając pedał nożny W czasie uruchamiania lasera wewnętrzna temperatura guza zacznie rosnąć, potrzebując około 15 sekund do dwóch minut, aby wejść w docelowy zakres hipertermiczny od 42 do 48 stopni. Jeśli wewnętrzna temperatura guza zbliży się do 48 stopni, zdejmij nogę z pedału, pozwalając temperaturze ponownie spaść.

Ten spadek temperatury powinien być widoczny w czasie rzeczywistym na wykresie wyświetlania temperatury w funkcji czasu. Gdy wewnętrzna temperatura guza spadnie do około 43 stopni, ponownie włącz podawanie lasera za pomocą pedału nożnego. Temperatura powinna zacząć ponownie rosnąć, nie wychodząc poza zakres hipertermii.

Kontynuuj to po wyłączeniu lasera, aby upewnić się, że guz pozostaje w zakresie hipertermicznym. Wykres wyświetlania temperatury w funkcji czasu powinien zacząć odzwierciedlać ten wzorzec wyłączania cyklu lasera. Przez cały okres utrzymywania hipertermii nowotworowej należy stale monitorować temperaturę powierzchni skóry, aby upewnić się, że pozostaje poniżej 50 stopni Celsjusza.

Po pięciu minutach utrzymywania hipertermii zwolnij pedał nożny, aby zatrzymać podawanie lasera i pozwól, aby wewnętrzna temperatura guza spadła z powrotem do około 37 stopni Celsjusza. Gdy guz powróci do normalnej temperatury, wyjmij sondę monitorującą temperaturę i zetrzyj nadmiar żelu Aloe Vera z powierzchni guza. Wyjmij mysz ze znieczulenia stożka nosowego i monitoruj pobudzenie zwierzęcia przed powrotem do klatki W celu rekonwalescencji po zabiegu umieść klatkę częściowo na poduszce grzewczej, jak pokazano tutaj.

Upewnij się, że myszy powróciły do normalnego zachowania przed powrotem do ich obiektu mieszkalnego. Ta tabela zawiera wartości natężenia promieniowania w watach na centymetr kwadratowy dla różnych ustawień prądu wyjściowego lasera w miliamperach i odległości roboczych w centymetrach. Tabela ta służy do określenia odpowiedniej wysokości lasera w oparciu o wymaganą średnicę wiązki, aby pokryć powierzchnię guza i osiągnąć docelowe natężenie promieniowania około jednego wata na centymetr kwadratowy.

Podświetlone na zielono wartości w tej tabeli wskazują optymalne poziomy natężenia promieniowania w pobliżu jednego wata na centymetr kwadratowy. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne profile temperatury guza wewnętrznego w czasie w milisekundach zarejestrowane przez wewnętrzną sondę temperatury guza podczas ekspozycji guza na światło bliskiej podczerwieni. Rysunek A przedstawia wzorzec cyklu włączania i wyłączania lasera u myszy z wstrzyknięciem złotego nanopręta, wymagany do utrzymania wewnętrznej temperatury guza w zakresie hipertermicznym.

Podkreśla znaczenie ścisłego monitorowania wewnętrznej temperatury guza i cyklicznego podawania lasera w celu utrzymania zakresu hipertermii przez cały czas trwania zabiegu. Rycina B pokazuje średnią różnicę w wewnętrznej temperaturze guza między myszami, którym wstrzyknięto złoto nanarod i myszy, którym wstrzyknięto złoto, lub myszy z wstrzyknięciem PBS w ciągu pięciominutowej ekspozycji na światło bliskiej podczerwieni. Bez wstrzyknięcia złotych nanoprętów guzy wystawione na działanie światła bliskiej podczerwieni nie nagrzeją się do łagodnego zakresu hipertermicznego.

Guzy wstrzyknięte PBS utrzymują się na poziomie około 39 do 40 stopni Celsjusza, w przeciwieństwie do guzów wstrzykniętych złotym nanoprętem, które osiągają temperaturę hipertermiczną od 42 do 48 stopni. Nasza ukierunkowana terapia hipertermiczna za pośrednictwem nanoprętów złota indukuje zmniejszanie objętości guza w wielu lustrzanych modelach raka w ciągu 48 do 72 godzin po leczeniu. Rycina A przedstawia pomiary objętości guza w 4T1, modelu raka piersi po celowanej terapii hipertermicznej za pośrednictwem złotego nanopręta.

Rysunek B przedstawia B16 F10, model czerniaka, a rysunek C przedstawia CT26, model raka jelita grubego. Zmniejszenie lub spowolnienie wzrostu objętości guza w ciągu 48 do 72 godzin po leczeniu wskazuje na pozytywny wynik. Podczas wykonywania tego protokołu dokładne monitorowanie wewnętrznej temperatury guza w czasie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia osiągnięcia łagodnego zakresu hipertermii i konsekwentnego leczenia.

Po tej procedurze należy wykonywać codzienne pomiary objętości guza, aby zarejestrować zmiany objętości guza. Regresja guza w ciągu dwóch do trzech dni jest pozytywnym wskaźnikiem sukcesu leczenia.