Name: Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ do mapowania receptorów insuliny IR-A i IR-B w splotach naczyniówkowych myszy. Technika ta umożliwia badanie izoformowych mechanizmów sygnałowych w mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Intramural Research Program/National Institute on Aging/National Institutes of Health.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez National Institute on Aging (NIA), który jest w pełni akredytowany przez American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Protokoły zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w ramach Programu Badań Wewnętrznych NIA (IRP/NIA). Myszy trzymano w obiekcie o kontrolowanej temperaturze w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, z dostępem ad libitum do wody i standardowej karmy, chyba że określono inaczej. Samce myszy C57BL/6J uzyskano z Jackson Laboratory i wykorzystano do eksperymentów w wieku 3-4 miesięcy.
1. Naprawiono przygotowanie zamrożonej próbki
<ol>
	<li>Spulchnij mysz świeżo przygotowanym 4% PFA w 1x PBS i umieść cały mózg w świeżo przygotowanym 4% PFA na 17-24 godziny w temperaturze 4 °C. UWAGA: Tkankę umieszczono w 4% PFA (10 ml na każdy mózg) na nie dłużej niż 24 godziny.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w 10% (10 ml) sacharozie w 1x PBS w temperaturze 4 °C, aż tkanka opadnie na dno pojemnika. Następnie sekwencyjnie przenieś tkankę do 20% sacharozy, a na końcu do 30% sacharozy, pozwalając jej zatonąć na każdym kroku. UWAGA: Czas potrzebny do zatonięcia tkanki różni się w zależności od rodzaju i rozmiaru tkanki. W przypadku tkanki mózgowej trwa to około 18 godzin.</li>
	<li>Tkankę należy zamrozić w pożywce do zatapiania OCT i przechowywać bloki tkanek w hermetycznym pojemniku w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zamrożone tkanki mózgowe utrwalone formaldehydem należy kroić koronnie na plastry o wielkości 10 μm i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. UWAGA: Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych; Inne rodzaje szkiełek mogą powodować utratę tkanek. Jeśli szkiełka nie zostaną natychmiast użyte, należy je przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
</ol>
2. Obróbka wstępna sekcji przed testem wykrywania dupleksu
<ol>
	<li>W dniu testu umyj szkiełka w 1x PBS przez 5 minut, delikatnie przesuwając stojak na szkiełka w górę iw dół, aby usunąć resztki OCT.</li>
	<li>Piecz szkiełka w temperaturze 60 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Po utrwaleniu szkiełek w wstępnie schłodzonym 4% PFA w 1x PBS przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś szkiełka sekwencyjnie przez serię EtOH: 50% EtOH przez 5 minut w RT, 70% EtOH przez 5 minut w RT, 100% EtOH przez 5 minut w RT, 100% EtOH ponownie przez 5 minut w RT.</li>
	<li>Suche na powietrzu zjeżdżalnie przez 5 minut w RT.</li>
	<li>Nałóż 2-4 krople nadtlenku wodoru na każdą sekcję i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Spłucz raz wodą destylowaną.</li>
	<li>Przygotuj 700 ml świeżego roztworu 1x Target Retrieval w zlewce. Przykryć folią i doprowadzić do równomiernego wrzenia (99–100 °C). UWAGA: Nie gotować dłużej niż 30 minut przed użyciem. W międzyczasie rozgrzej piekarnik (patrz Tabela Materiałów) do 40 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zanurzyć ruszt szkiełkowy we wrzącym roztworze do pobierania celu i inkubować przez 5 minut. Utrzymuj temperaturę w zakresie 98–102 °C i uważnie monitoruj. UWAGA: Może być konieczne dostosowanie czasu gotowania (5–15 min) w zależności od typu tkanki.</li>
	<li>Natychmiast przenieś gorący ruszt do szkiełka do naczynia z wodą destylowaną, przesuwając ruszt w górę iw dół 3–5 razy. Powtórz ze świeżą wodą destylowaną.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w świeżym 100% EtOH, przesuwając je w górę i w dół 3–5 razy. Szkiełka suche na powietrzu.</li>
	<li>Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby obrysować każdy fragment tkanki 2–3 razy. Poczekaj, aż bariera całkowicie wyschnie w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść szkiełka w tacy na szkiełka wsadowe. Dodaj proteazę (patrz tabela materiałów) do każdej sekcji, upewniając się, że tkanka jest całkowicie pokryta. Inkubować w piecu w temperaturze 40 °C przez 15 minut. UWAGA: Czas inkubacji proteazy może wymagać dostosowania w zależności od typu tkanki i genu docelowego.</li>
	<li>Wyjmij tackę przesuwną z piekarnika i umieść ją w wodzie destylowanej. Delikatnie umyj szkiełka, przesuwając je w górę i w dół przez 2 minuty, powtarzając ten krok 2x ze świeżą wodą destylowaną.</li>
</ol>
3. Test wykrywania dupleksu
<ol>
	<li>Sondy<ol>
		<li>Przygotuj dwie dodatkowe sekcje dla sond kontroli dodatniej i ujemnej.</li>
		<li>Wybierz sondy sterujące o takiej samej liczbie par ZZ jak sonda docelowa. Dla 1 pary ZZ należy zastosować kontrolę dodatnią i kontrolę ujemną (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przed użyciem należy wyrównać sondy w temperaturze 40 °C przez 10 minut i doprowadzić odczynniki AMP1-12 do RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja sondy<ol>
		<li>Krótko odkręć sondę C2 i wymieszaj w stosunku 1:50 z sondą C1. Dodać tyle mieszanki z sondą (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję i inkubować szkiełka w piecu w temperaturze 40 °C przez 2 godziny. Myć szkiełka przez 2 x 2 minuty w 1x bufor do mycia w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP1<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP1 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP2<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP2 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Duplex AMP3 z zakresem podstawowym<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP3 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia. UWAGA: Nie należy przekraczać 15 minut inkubacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP4<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP4 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP5<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP5 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP6<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP6 (100–200 μL), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia. UWAGA: Podobnie jak w przypadku AMP3, nie należy przekraczać 15 minut inkubacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP7<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP7 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.<ol>
				<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia. UWAGA: Inkubować z AMP7 w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP8<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu płuczącego ze szkiełek i dodaj AMP8 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia. UWAGA: Inkubować z inkubacją AMP8 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Detekcja czerwonego sygnału (C2)<ol>
			<li>Krótko odkręć Fast Red-B i wymieszaj z Fast Red-A w proporcji 1:60.</li>
			<li>Nałożyć na każdą sekcję (100–200 μl), przykryć tackę i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
			<li>Umyj 2x w 1x bufor do mycia. UWAGA: Użyj zmieszanego roztworu Fast Red w ciągu 5 minut. Chronić przed światłem (słonecznym lub UV).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP9<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP9 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP10<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP10 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Ponownie włożyć do pieca i inkubować w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP11<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP11 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia. UWAGA: Inkubować z AMP11 w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aplikacja Base Scope Duplex AMP12<ol>
			<li>Usuń nadmiar buforu myjącego ze szkiełek i dodaj AMP12 (100–200 μl), aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
			<li>Umyć 2 x 2 min w 1x buforze do mycia. UWAGA: Nie należy przekraczać 15 minut inkubacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Detekcja zielonego sygnału (C1)<ol>
			<li>Krótko odkręć rurkę Fast Green-B i wymieszaj z Fast Green-A w proporcji 1:50.</li>
			<li>Nanieś ZIELONY roztwór na każdą sekcję (100–200 μl), przykryj tackę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze suchej masy.</li>
			<li>Myć przez 5 minut w 1x buforze do płukania i krótko spłukać w wodzie destylowanej. UWAGA: Użyj zmieszanego roztworu Fast Green w ciągu 5 minut. Chronić przed światłem. Stosunek koloru zielonego B do A wynosi 1:50. Zarówno podłoża CZERWONE, jak i ZIELONE są wrażliwe na alkohol. Nie używaj żadnych odczynników zawierających alkohol.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeciwplama
<ol>
	<li>Zanurz szkiełka w 50% roztworze barwiącym hematoksylinę na 1 minutę w temperaturze pokojowej, aż skrawki staną się fioletowe.</li>
	<li>Spłucz w wodzie z kranu 3–5 razy, poruszając się w górę i w dół. Powtarzaj ze świeżą wodą z kranu, aż tło się oczyści, ale sekcje pozostaną fioletowe.</li>
	<li>Zanurz ślizgi w 0,02% wodzie amoniakalnej w górę iw dół 3x, aż sekcje zmienią kolor na niebieski.</li>
	<li>Spłucz ponownie w wodzie z kranu 3–5 razy.</li>
</ol>
5. Montowanie
<ol>
	<li>Całkowicie suche zsuwa się w suchym piekarniku w temperaturze 60 °C przez ~15 min.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w świeżym ksylenie. UWAGA: Ponieważ podłoże montażowe jest dość lepkie, krótkie zanurzenie w ksylenie przed montażem ułatwia płynniejsze rozprowadzanie podłoża w całym przekroju tkanki i zmniejsza tworzenie się pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Nałożyć medium montażowe (patrz Tabela Materiałów) na szkiełko podstawowe i nakrywkowe, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Suszenie na powietrzu przez co najmniej 5 minut.</li>
</ol>
6. Oceń próbki
<ol>
	<li>Zobrazuj skrawki pod standardowym mikroskopem jasnego pola przy powiększeniu 20x lub 40x. (Rysunek 1). UWAGA: Kontrole pozytywne powinny pokazywać kropki interpunkcyjne w komórkach. Kontrole ujemne są dopuszczalne, jeżeli na 20 komórek przy 20-krotnym powiększeniu przypada nie więcej niż 1 kropka.</li>
</ol>
7. Punktacja (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazu (np. Halo lub QuPath), aby określić ilościowo kropki RNA na komórkę.</li>
</ol>

<ol><li>Häring, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+receptor%3A+signalling+mechanism+and+contribution+to+the+pathogenesis+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The insulin receptor: signalling mechanism and contribution to the pathogenesis of insulin resistance.</a> Diabetologia. 34 (12), 848-861 (1991).</li>
<li>Benecke, H., Flier, J. S., Moller, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+variants+of+the+insulin+receptor+protein%3A+expression+in+normal+and+diabetic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced variants of the insulin receptor protein: expression in normal and diabetic human tissues.</a> J Clin Invest. 89 (6), 2066-2070 (1992).</li>
<li>Vella, V., Malaguarnera, R., Nicolosi, M. L., Morrione, A., Belfiore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FIGF+signalling+and+discoidin+domain+receptors%3A+an+emerging+functional+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin/IGF signalling and discoidin domain receptors: an emerging functional connection.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (11), 118522(2019).</li>
<li>Galal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+isoforms+and+insulin+growth+factor-like+receptors%3A+implications+in+cell+signaling%2C+carcinogenesis%2C+and+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor isoforms and insulin growth factor-like receptors: implications in cell signaling, carcinogenesis, and chemoresistance.</a> Int J Mol Sci. 24 (19), 15006(2023).</li>
<li>Starks, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+higher+cerebrospinal+fluid+tau+levels+in+asymptomatic+APOE%C9%9B4+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with higher cerebrospinal fluid tau levels in asymptomatic APOEɛ4 carriers.</a> J Alzheimers Dis. 46 (2), 525-533 (2015).</li>
<li>Belfiore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+isoforms+in+physiology+and+disease%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor isoforms in physiology and disease: an updated view.</a> Endocr Rev. 38 (5), 379-431 (2017).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>BaseScope assays. , Advanced Cell Diagnostics, Inc. 
 <a target="_blank" href="https://acdbio.com/basescope-duplex-assay">https://acdbio.com/basescope-duplex-assay</a> (2025).</li>
<li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074.e21 (2021).</li>
<li>Schulingkamp, R. J., Pagano, T. C., Hung, D., Raffa, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptors+and+insulin+action+in+the+brain%3A+review+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications.</a> Neurosci Biobehav Rev. 24 (8), 855-872 (2000).</li>
<li>Milstein, J. L., Ferris, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+as+an+insulin-sensitive+metabolic+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">The brain as an insulin-sensitive metabolic organ.</a> Mol Metab. 52, 101234(2021).</li>
<li>Moruzzi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+insulin+receptor+isoforms+in+obesity%2Ftype+2+diabetes+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of insulin receptor isoforms in obesity/type 2 diabetes mouse models.</a> J Cell Mol Med. 25 (10), 4800-4813 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W mózgu ekspresja receptorów insuliny (IR) jest niejednorodna, z dużą gęstością obserwowaną w obszarach takich jak opuszka węchowa, podwzgórze, hipokamp i splot naczyniówkowy10. Kompleksowa charakterystyka wariantowych wzorców ekspresji w określonych regionach mózgu i typach komórek dostarczyłaby kluczowych informacji, umożliwiając nam badanie i zrozumienie specyficznych ról insuliny i sygnalizacji IGF-II w plastyczności synaptycznej, uczeniu sięi pamięci. Dodatkowo dałoby ...

Receptor insuliny (IR) jest jednoprzebiegowym transbłonowym receptorem enzymatycznym, który pośredniczy w różnych fizjologicznych efektach insuliny. Funkcjonuje jako białko dimeryczne, przy czym każdy monomer składa się z dwóch łańcuchów peptydowych połączonych wiązaniem dwusiarczkowym: zewnątrzkomórkową podjednostką α, która zawiera domenę wiążącą ligand, oraz podjednostką transbłonową β, której sekwencja wewnątrzkomórkowa posiada wewnętrzną aktywność kinazy tyrozynowej1. Poprzez alternatywny splicing eksonu 11, transkrypcja genu IR powoduje powstanie dwóch wariantów mRNA IR. IR-A nie ma eksonu 11, podczas gdy IR-B go zachowuje. W związku z tym IR-A i IR-B różnią się sekwencją 12-aminokwasową w pobliżu C-końca podjednostki α, co skutkuje wyraźnym wiązaniem czynników wzrostu oprócz dojrzałej insuliny i różnymi właściwościami sygnalizacyjnymi. Podczas gdy oba warianty wykazują podobne powinowactwo do insuliny, IR-A ma większe powinowactwo do insulinopodobnego czynnika wzrostu-II (IGF-II) i proinsuliny w porównaniu z IR-B. Wzorce ekspresji IR-A i IR-B różnią się w zależności od typu tkanki i komórki oraz stanu choroby2.
Ich zróżnicowana ekspresja w tkankach i chorobach podkreśla ich wyjątkowy wkład w fizjologię i patologię. Splot naczyniówkowy (CP), wyspecjalizowana struktura, która wytwarza płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i stanowi część bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, odgrywa kluczową rolę w transporcie składników odżywczych, usuwaniu odpadów i neuroprotekcji, zwłaszcza podczas stanu zapalnego. Obie izoformy IR ulegają ekspresji w CP, gdzie prawdopodobnie regulują objętość i skład płynu mózgowo-rdzeniowego. IR-A, poprzez wiązanie o wysokim powinowactwie przez IGF-II, prawdopodobnie sprzyja proliferacji komórkowej i naprawie tkanek w nabłonku CP. Z drugiej strony IR-B bierze udział w transporcie insuliny przez barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, wspierając dostępność insuliny w mózgu dla astrocytów, neuronów, gleju i homeostazy glukozy 3,4.
Przedcukrzycowy poziom IR wiąże się z podwyższonym poziomem tau w płynie mózgowo-rdzeniowym u bezobjawowych osób z genetycznym ryzykiem choroby Alzheimera (AD)5, a zmiany w stosunku IR-A / IR-B są związane z insulinoopornością, starzeniem się i zwiększonymi czynnikami aktywności proliferacyjnej, które mogą przyczyniać się do raka i innych patologii6. Identyfikacja specyficznych dla izoform wzorców ekspresji IR-A i IR-B stanowi kluczowy krok w kierunku opracowania nowych strategii terapeutycznych dla złożonych zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego. Jednak obecne podejścia, takie jak barwienie immunologiczne i qPCR, są ograniczone: nie wszystkie białka mogą być wiarygodnie znakowane immunologicznie z powodu braku zwalidowanych przeciwciał i chociaż qPCR jest wysoce specyficzny, brakuje mu rozdzielczości przestrzennej.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy hybrydyzację in situ Duplex (ISH), zaawansowaną technologię wykrywania RNA opartą na platformie RNAscope BaseScope. Test ten wykorzystuje unikalną konstrukcję sondy z podwójnym Z, która wymaga tandemowego wiązania z docelowym RNA, co zapewnia wysoką specyficzność i czułość, nawet w przypadku transkryptów o niskiej liczebności. Sygnał fluorescencyjny lub chromogenny jest wzmacniany przez wiele zdarzeń wiązania sondy, co poprawia wykrywalność i redukuje tło7. W przeciwieństwie do standardowego RNAscope, ten test jest zoptymalizowany do wykrywania krótkich sekwencji RNA (50-300 zasad), dzięki czemu jest szczególnie odpowiedni do identyfikacji alternatywnych zdarzeń splicingu, wariantów pojedynczego nukleotydu i rzadkich transkryptów w złożonych tkankach, takich jak mózg8.
Test ten wizualizuje cele jednocześnie jako wyraźne zielone (C1) i czerwone (C2) sygnały chromogenne w jasnym polu. Zapewnia sukces przy użyciu tkanek utrwalonych w 4% paraformaldehydzie (PFA) lub 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF) i poddanych do sekcji w ilości 5 μm-15 μm (zamrożone/FFPE), zawierających RNA o niskiej lub wysokiej obfitości. Ze względu na wrażliwość na degradację RNA, nadmierną fiksację i błędy sondy, musimy zoptymalizować obróbkę wstępną, konstrukcję sondy i kontrole, aby zmaksymalizować specyficzność i zminimalizować tło. Tutaj zastosowaliśmy ten test Duplex ISH do scharakteryzowania wzorców ekspresji IR-A i IR-B w mysim CP, oferując nowy wgląd w biologię przestrzenną izoform IR i ich możliwe role w zdrowiu i chorobie mózgu.

<table><tbody><tr><td>Woda amonowa</td><td>Nauka o mikroskopie elektronowym&nbsp;</td><td>26754-4A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do wykrywania BaseScope Dulplex</td><td>Życiorys ACD</td><td>323810</td><td></td></tr><tr><td>Sonda kontroli pozytywnej BaseScope Dulplex Duplex - Mysz (mm) -C1-PPIB-1ZZ/C2-Polr2A-1ZZ</td><td>Życiorys ACD</td><td>700121</td><td></td></tr><tr><td>Sonda kontroli pozytywnej BaseScope Dulplex Duplex-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZ</td><td>Życiorys ACD</td><td>700141</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Gilla I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32731 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ PIEKARNIK, taca, ruszt i taca do mycia</td><td>Życiorys ACD</td><td>321721, 310012, 321716, 321717</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy</td><td>Laboratorium Wektorowe</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Sondy izoformy A i B INSR: BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2</td><td>Życiorys ACD</td><td>717411, 717421-C2</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko receptorowi insuliny</td><td>Sygnalizacja komórkowa&nbsp;</td><td>23413</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 10x Tarcza do pomiaru</td><td>Życiorys ACD</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Nadtlenek wodoru, proteaza Plus</td><td>Życiorys ACD</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczno-sodowo-cytrynian (SSC) 20x</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP1325-1</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice SuperFrost Plus</td><td>Fisher Naukowy</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount Medium do montażu stałego</td><td>Laboratorium Wektorowe</td><td>H-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny a i b w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji rna in situ

Precise Visualization of Insulin Receptors A and B in Murine Brain with an RNA In Situ Hybridization Assay

Receptory insuliny (IR) ulegają szerokiej ekspresji we wszystkich tkankach i wszystkich typach komórek. Występuje w dwóch funkcjonalnie odrębnych izoformach - IR-A i IR-B - różniących się 12 aminokwasami ze względu na alternatywny splicing eksonu 11. Izoformy te wykazują specyficzne dla tkanek i komórek wzorce ekspresji, a ich względna obfitość zmienia się w trakcie rozwoju, starzenia się i choroby. Ze względu na duże podobieństwo sekwencji, rozróżnienie między IR-A i IR-B przy użyciu tradycyjnych metod immunologicznych było wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy nowatorski test hybrydyzacji in situ (ISH) Duplex, który umożliwia wizualizację ekspresji IR-A i IR-B w tkance. Stosując to podejście, po raz pierwszy wykazujemy, że podczas gdy obie izoformy ulegają ekspresji w mysim splocie naczyniówkowym, dominuje IR-A. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania przestrzennego rozmieszczenia izoform receptora insuliny in situ w różnych tkankach. Podczas gdy qPCR w czasie rzeczywistym może wykrywać transkrypty IR-A i IR-B w jednokomórkowych kulturach in vitro , brakuje mu zdolności do lokalizacji przestrzennej w złożonych tkankach, co podkreśla potrzebę i użyteczność techniki Duplex ISH.

Receptor insulinowy (IR) jest transbłonowym receptorem kinazy tyrozynowej składającym się z dwóch zewnątrzkomórkowych podjednostek α i dwóch transbłonowych podjednostek β, tworzących funkcjonalny heterotetramer. Podjednostki α pośredniczą w wiązaniu insuliny, podczas gdy podjednostki β mają wewnętrzną aktywność kinazy tyrozynowej, która inicjuje dalszą sygnalizację. Alternatywny splicing eksonu 11 mRNA IR generuje dwie izoformy IR, IR-A i IR-B. W związku z tym IR-B zawiera 12-aminokwasowy...

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Insulin receptors (IRs) are widely expressed across all tissues and all cell types. It exists in two functionally distinct isoforms -- IR-A and IR-B -- ...

precise-visualization-insulin-receptors-b-murine-brain-with-an-rna

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Ten film demonstruje wykrywanie syntezy RNA receptora serotoninowego za pomocą sond oligonukleotydowych w tkance mózgowej szczura dotkniętej zespołem serotoninowym. Protokół obejmuje wstępną obróbkę tkanek, hybrydyzację sondy i detekcję enzymatyczną w celu wizualizacji i ilościowego określenia ekspresji RNA receptora serotoninowego pod mikroskopem.

Hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych do badania ekspresji RNA w skrawkach mózgu szczura

Źródło: Baleriola, J.,  et. al., Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w sekcjach mózgu przy użyciu hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości.  J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje wykrywanie mRNA w aksonach cholinergicznych w utrwalonych mysich wycinkach hipokampa przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przestrzenną lokalizację znakowanych sondą mRNA i acetylotransferazy choliny w neuronach cholinergicznych.

Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ do mapowania receptorów insuliny IR-A i IR-B w splotach naczyniówkowych myszy. Technika ta umożliwia badanie izoformowych mechanizmów sygnałowych w mózgu.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Przeglądaj więcej filmów