System perfuzji normamicznej o otwartym kodzie źródłowym przeznaczony dla naukowców
18 lipca 2025
W tym miejscu przedstawiamy protokół dla otwartego, modyfikowalnego normotermicznego systemu perfuzji ex vivo , zaprojektowanego w celu przezwyciężenia wysokich kosztów i ograniczonej elastyczności istniejących platform, umożliwiając bardziej dostępne, opłacalne i iteracyjne wykorzystanie w przedklinicznych badaniach biomedycznych.
Mikrośrodowisko ludzkiego guza jest żywym, ewoluującym kompleksem, który reaguje na zaburzenia związane z lekami w sposób trudny do przewidzenia na poziomie komórkowym. Naszym celem było utrzymanie mikrośrodowiska ludzkiego guza ex vivo w warunkach zbliżonych do fizjologicznych w celu przeprowadzenia szczegółowych badań. Zaprezentowana tutaj maszyna rozwiązuje problem braku przystępnych cenowo normotermicznych systemów profuzji do zastosowań badawczych, umożliwiając iteracyjne badania dla dużej liczby pożądanych eksperymentalnych punktów końcowych.
Nasze laboratorium będzie kontynuować prace nad dalszym zmniejszeniem skali maszyny w celu uzyskania całkowicie autologicznej obfitości, umożliwiając system do badań immunoonkologicznych i terapii komórkowej. Aby rozpocząć, umieść lejek bębna po prawej stronie stacji roboczej tak, aby wylewka wystawała poza przednią krawędź stołu. Umieść okrągłą piankę z pamięcią kształtu tak, aby pasowała do podstawy bębna z membraną umieszczoną pod pianką.
Pozostaw czterocalową szczelinę w pobliżu wylewki na odpływ. Następnie umieść dwa koce grzewcze na wodzie na wierzchu wkładki piankowej z rurką łączącą skierowaną w lewy górny róg i włóż męski zadzior Luer 3/16 cala do każdej rurki. Weź złożoną, sterylną, cieplejszą zasłonę.
Odetnij dwa milimetry od rogu zagięcia, aby utworzyć otwór odpływowy i umieść go na bębnie. Następnie uzyskaj wydrukowane w 3D złącze wylotowe i włóż magnes do jego rowka. Umieść ten zespół pod zasłoną przez wylewkę odpływową i wyrównaj wycięty otwór z otworem w złączu i magnesem.
Podnieś nadmiar serwety, aby przykryć lejek bębna i zabezpiecz go gumkami lub elastycznymi opaskami. Złóż nadmiar zasłony na wierzchu, aby stworzyć sterylną barierę. Teraz umieść drugi płaszcz wodny na całkowicie złożonej zasłonie.
Następnie weź 30-calowy kawałek rurki 1/4 cala i podłącz bliższy koniec do wylotu u podstawy wylewki lejka bębna i spoczywaj w pobliżu uchwytu zbiornika, który zostanie podłączony później. Teraz umieść pompy na mobilnym wózku umieszczonym po lewej stronie stacji roboczej. Umieść stojak w dwóch zaciskach bezpośrednio za pompami, tak aby zaciski były podniesione sześć cali nad pompami.
Ponadto zaopatrz się w dwie głowice pomp i zamocuj każdą z nich w jednej z pomp. Umieść dwa dotleniacze w zaciskach na stojaku w orientacji poziomej. Następnie podłącz rurkę doprowadzającą gaz tętniczy i żylną 1/8 cala do prawego górnego dolnego złącza odpowiedniego natleniacza.
Teraz wyjmij wszystkie rurki z zestawu do hemodializy, z wyjątkiem przewodów prowadzących bezpośrednio do filtra. Umieść jedną dużą pompę rolkową bezpośrednio po prawej stronie filtra hemodializy w celu dopływu krwi. Następnie umieść dwie mniejsze pompy perystaltyczne po prawej stronie pompy rolkowej do krwi do dopływu i odpływu dializatu.
Zaopatrz się w dwie rurki perystaltyczne 1/8 cala i włóż je do białego zacisku pompy. Przymocuj żeński 1/8-calowy zadzior Luer do obu końców każdej rurki. Aby podłączyć worek dializatu do dopływu filtra, podłącz rurkę 1/8 cala do złącza Luer na worku.
Podłącz męski 1/8-calowy Luer do końca rurki i podłącz go do rurki pompy perystaltycznej dopływu. Podłącz obwody dopływu i odpływu do odpowiednich portów filtrów hemodializy. Umieść zbiornik wewnątrz uchwytu zbiornika tak, aby zewnętrzne oznaczenia pomiarowe i żółte złącze było skierowane na zewnątrz.
Następnie wytnij 36-calowy kawałek rurki 5/16 cala. Podłącz złącze Y do dystalnego końca tej rurki i podłącz proksymalny koniec do króćca odpływowego na dnie zbiornika. Wytnij dwa 4-calowe kawałki rurki 5/16 cala i przymocuj każdy z nich do końca złącza Y.
Podłącz drugie końce tych rurek do poziomych zębów głowic pompy. Następnie odetnij dwa 4-calowe kawałki rurki 1/4 cala i podłącz po jednym do każdego pionowego zadzioru na głowicach pompy. Przymocuj drugi koniec do lewego dolnego bolca każdego dotleniacza.
Teraz weź 30-calowy segment rurki 5/16 cala. Przetnij rurkę na pół i umieść łącznik Y 5/16 cala na dystalnym końcu odcięcia. Przymocuj proksymalny koniec do króćca odpływowego dotleniacza żylnego.
Ponownie przymocuj drugą połowę do górnego zadzioru łącznika Y. W przypadku bocznego obwodu próbkowania wytnij 2-calowy kawałek rurki 1/4 cala. I za pomocą wkrętaka igłowego rozciągnij bliższy koniec.
Przymocuj tę rozciągliwą rurkę do pozostałego zadzioru łącznika Y 5/16 cala. Po podłączeniu czujnika bocznikowego kuwety podłącz poziomą część żeńskiego złącza T do rurki 1/8 cala wyposażonej w męski Luer. Przymocuj klaster do pobierania próbek do prostopadłego aspektu łącznika T.
Na koniec podłącz męski Luer 1/8 cala do drugiej poziomej strony złącza T. Następnie odetnij rurkę o długości 12 cali 1/8 cala i podłącz proksymalny koniec do klawu do pobierania próbek. Podłącz męski 1/8-calowy Luer do dystalnego końca i podłącz go do drugiego żeńskiego złącza T.
Po jednej stronie tego złącza T przymocuj męski Luer 1/4 cala i użyj dwucalowego kawałka rurki 1/4 cala, aby podłączyć go do króćca dopływu do zbiornika. Na dystalnym końcu rurki 5/16 cala podłącz kolejne złącze Y 5/16 cala. Zaopatrz się w około 55-calową rurkę 1/4 cala i podłącz ją do górnego zadzioru złącza Y.
W przypadku obwodu krwi do hemodializy podłącz męski Luer 1/4 cala do dystalnego końca rurki 1/4 cala. Przeciągnij tę rurkę przez dużą pompę rolkową i podłącz ją do portu dopływu krwi w górnej części filtra hemodializy, oznaczonego czerwoną rurką. Następnie weź 24-calowy kawałek rurki 1/4 cala i przymocuj męski Luer do bliższego końca.
Podłącz tę rurkę do wyłożonego na niebiesko portu odpływu krwi filtra do hemodializy. Następnie przymocuj dystalny koniec do króćca dopływowego zbiornika. Weź 36-calowy kawałek rurki 1/4 cala i rozciągnij go, aby bezpiecznie pasował do zadzioru złącza Y 5/16 cala.
Następnie zaopatrz się w trzy czterodrogowe kurki i połącz je w kolejności liniowej. Podłącz ten zespół do prostopadłego portu żeńskiego złącza T. Włóż ten element 12 cali od lewej strony rurki 1/4 cala.
Następnie podłącz zewnętrzne czujniki przepływu do rurki 1/4 cala bezpośrednio za miejscem infuzji leku. Wykonaj cięcie dwa cale dystalnie do czujników przepływu i włóż czujniki ciśnienia z kolczastymi końcami do rurki 1/4 cala. Umieść dystalną część rurki na środku lejka bębna.
Następnie przetnij rurkę o długości 30 cali 5/16 cala i podłącz jej proksymalny koniec do prawego króćca odpływowego dotleniacza tętniczego. Przetnij tę rurkę w punkcie środkowym i włóż złącze Y 5/16 cala. Następnie wytnij 36-calowy odcinek rurki 1/4 cala i podłącz go do zadzioru łącznika Y 5/16 cala.
Ponownie podłącz zewnętrzny czujnik przepływu. Wykonaj cięcie dwa cale za przelotem i podłącz czujniki ciśnienia do końcówki rurki umieszczonej w środku lejka bębna w celu dopływu tętnicy. Następnie wytnij 30-calowy kawałek rurki 1/4 cala i przymocuj 1/4-calowego samca Luer do bliższego końca, aby ostatecznie połączyć się z odpływem żyły głównej dolnej próbki.
Wytnij tę rurkę 6 cali od zbiornika i przymocuj 1/4 cala męskiego Luera do obu końców. Włóż żeńskie złącze T z klawem do pobierania próbek na prostopadłym porcie. Wprowadzić perfuzat do obwodu zgodnie z wcześniej opisaną metodą.
Ponownie podgrzej i połącz próbkę i rozpocznij perfuzję. W ciągu pierwszych 24 godzin perfuzji wątroby świni przepływ w tętnicy wątrobowej i żyle wrotnej wynosił średnio odpowiednio 107 i 501 mililitrów na minutę, przy stabilnym ciśnieniu dopływu 80 i 7,1 milimetra słupa rtęci. Wysycenie tlenem tętnic, wrotnym i żylnym w wątrobach świń wynosiło średnio 95%85% i 74%, przy pH zbliżonym do 7,2.
Poziom glukozy stale spadał. Hematokryt i hemoglobina pozostały stabilne, a poziom potasu nieznacznie spadł. Wątroby świń wytwarzały 41 mililitrów żółci i wykazywały umiarkowane zwiększenie poziomu mleczanu w ludzkiej perfuzji.
Napływy tętnicze i żylne wynosiły średnio 113 i 317 mililitrów na minutę, a saturacja tlenem sięgała 98%92%i 86% w żyłach tętniczych, wrotnych i wątrobowych. Ludzka wątroba utrzymywała fizjologiczne pH, stabilny hematokryt i hemoglobinę oraz wykazywała spadek glukozy i wzrost mleczanu przy produkcji żółci wynoszącej średnio 1,4 mililitra na godzinę. Badania histologiczne potwierdziły żywotny miąższ wątroby i morfologię guza po perfuzji.
Mobilna konfiguracja umożliwiła obrazowanie tomografii komputerowej perfundowanych wątrob, uzyskując jakość radiologiczną porównywalną ze skanami in vivo. System wspomagał również perfuzję nerek i trzustki z zachowanymi kłębuszkami nerkowymi i wyspami Langerhansa.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół otwartoźródłowego, modyfikowalnego systemu normothermicznej perfuzji ex vivo. System został zaprojektowany, aby poprawić dostępność i efektywność kosztową w przedklinicznych badaniach biomedycznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria biomedyczna
- Onkologia
- Badania ex vivo
Tło
- Środowisko nowotworowe człowieka jest złożone i reaguje na leczenie farmakologiczne.
- Obecne systemy normothermicznej perfuzji są często drogie i nieelastyczne.
- Istnieje potrzeba przystępnych cenowo systemów, które umożliwiają przeprowadzanie iteracyjnych badań.
- Celem tego badania jest utrzymanie środowiska nowotworowego ex vivo dla szczegółowej analizy.
Cel badania
- Rozwój niedrogiego systemu normothermicznej perfuzji.
- Możliwość przeprowadzania iteracyjnych badań w różnych punktach końcowych eksperymentu.
- Ułatwienie badań w dziedzinie immuno-onkologii i terapii komórkowej.
Zastosowane metody
- Złożenie systemu perfuzji przy użyciu elementów drukowanych 3D.
- Wykorzystanie koców grzewczych do regulacji temperatury.
- Podłączenie pomp i tlenozatoc do dynamiki płynów.
- Zastosowanie sterylnych barier w celu zachowania integralności systemu.
Główne wyniki
- System pozwala na utrzymanie perfuzji środowiska nowotworu ludzkiego.
- Daje elastyczną platformę dla różnych ustawień eksperymentu.
- Wstępne testy wykazują wykonalność systemu dla zastosowań badawczych.
- Przyszłe prace mają na celu optymalizację systemu dla perfuzji autologous.
Wnioski
- Opracowany system perfuzji radzi sobie z ograniczeniami istniejących platform.
- Poprawia dostępność dla badaczy w tej dziedzinie.
- Ciągły rozwój będzie skupiać się na skalowalności dla specyficznych potrzeb badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Open-source normothermic perfusion systems enable authentic interrogation of intact human and animal organs, supporting translational research and mechanistic de-risking in early discovery. By lowering cost and increasing experimental flexibility, this platform expands access to physiologically relevant preclinical models for target validation and functional studies. The system's modularity and data-rich outputs position it as a reusable asset for enterprise R&D pipelines seeking predictive confidence and portfolio agility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct study of human and porcine organ pathophysiology under controlled, near-physiologic conditions.
- Supports mechanistic de-risking by allowing iterative perturbation and monitoring of complex tissue responses.
- Facilitates functional target validation in a multicellular organ context, improving predictive confidence.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, modifiable platform for quantitative measurement of perfusion parameters and metabolic outputs.
- Supports assay standardization and reproducibility through open-source hardware and software control.
- Enables preparation of disease-relevant organ systems for downstream compound evaluation and screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by preserving tissue architecture and function during ex vivo studies.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting imaging and histological analysis.
- Reduces translational risk by enabling direct comparison of drug effects in human and animal tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This modular perfusion system bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling hypothesis testing and functional assessment in intact organs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of cellular and tissue-level responses to perturbations.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as flow rates, oxygenation, and metabolic markers for assay development.
- Analytics: Integrates with imaging and histology workflows for comprehensive endpoint analysis.
- Translational Research: Preserves disease-relevant features for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Open-source design enables adaptation across research teams and evolving project needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organ-level studies.
- Operational Value: Lowers barriers to entry with cost-effective, scalable, and reproducible system design.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust preclinical models.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with improved biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organ handling, perfusion setup, and physiological monitoring.
- Needs access to standard laboratory instrumentation and analytical infrastructure for data collection.
- Demands cross-team standardization of protocols and data analysis for reproducibility.
- Adaptable to various organ systems and research applications due to modular, open-source design.
- Practical limitations include specimen availability and the need for sterile technique during assembly and operation.
