Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Badania mają na celu optymalizację tworzenia korzeni komórek komórkowych 3D w celu badania metabolizmu energetycznego przy użyciu technologii Seahorse, koncentrując się na behawioralnej aktywności metabolicznej komórek i reakcjach na leki w naszym klinicznie istotnym modelu. Odkrycia te udoskonalą modele odlewania leków, zapewniając dokładniejsze odwzorowanie guzów mózgu, poprawiając ocenę terapii i analizę metaboliczną w celu uzyskania lepszych strategii leczenia. Wyniki utorowały drogę do zbadania, w jaki sposób zmienia się metabolizm energetyczny w sferoidalnych modelach 3D, w jaki sposób leki wpływają na szlaki metaboliczne oraz mechanizmy, dzięki którym zmiany metaboliczne przyczyniają się do rozwoju oporności guza na terapię.

Po ponownym wymieszaniu zebranych komórek U87 w DMEM, podgrzej niewykorzystane podłoże do 37 stopni Celsjusza. Utrzymuj zawiesiny komórek w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Na podstawie początkowej liczby komórek rozcieńczyć zawiesinę komórek DMEM zawierającym 10% FBS do końcowej objętości 20 mililitrów, zapewniając około 200 000 komórek.

Dokładnie wymieszać końcową zawiesinę komórkową przez wielokrotne odwrócenie. Powoli dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny wzdłuż krawędzi każdej studzienki do przezroczystej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem o bardzo niskim mocowaniu, a następnie szczelnie uszczelnij płytkę Parafilmem, aby zapobiec wyciekom podczas wirowania. Umieścić szczelnie zamkniętą płytkę w wirówce i pracować z ciśnieniem 200 G przez dwie minuty, aby osadzać komórki na dnie każdej studzienki.

Wyjmij płytkę z wirówki. Ostrożnie usuń Parafilm i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Aby przygotować roztwór powlekający, rozpuść pięć miligramów poli-D-lizyny w 50 mililitrach sterylnej wody i dokładnie wymieszaj roztwór, aż do całkowitego rozpuszczenia.

Dodać 30 mikrolitrów roztworu powlekającego do każdego dołka płytki do oznaczania metabolizmu. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków, delikatnie potrząsając płytką lub zasysając nadmiar roztworu. Inkubować płytkę z pokrywą przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie odessać roztwór powlekający i dwukrotnie umyć studzienki 200 mikrolitrami sterylnej wody.

Suszyć płytkę na powietrzu przez co najmniej 30 minut, a następnie podgrzewać ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla przez 30 minut, aby ustabilizować powłokę. Następnie dodaj 175 mikrolitrów podgrzanego podłoża do każdej studzienki. Utrzymuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze niezawierającym dwutlenku węgla, aż będzie gotowa do przeniesienia sferoidów komórkowych.

Po pięciu dniach hodowli przenieś płytki sferoidalne do systemu obrazowania o wysokiej zawartości. Aby skonfigurować parametry obrazowania, ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a poziom dwutlenku węgla na 5%Dostosuj typ płyty, kanały i zakres ostrości w ustawieniach systemu. Następnie uzyskaj obrazy sferoidalne za pomocą mikroskopu konfokalnego z 10-krotnymi obiektywami i oprogramowaniem do obrazowania, a następnie zidentyfikuj studzienki zawierające nienaruszone sferoidy i zarejestruj ich położenie do transferu.

Przypisz nienaruszone sferoidy do dwóch grup, grupy kontrolnej z sześcioma dostojnikami replikowanymi i grupy leczonej z sześcioma dołkami replikowanymi do leczenia fenofibratem. Przygotować roztwór roboczy fenofibratu w świeżym, wstępnie ciepłym podłożu o optymalnym stężeniu. Ostrożnie wyjmij sferoidę zawierającą płytkę o niskim mocowaniu z systemu obrazowania i umieść ją na sterylnej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Umieść płytkę testową pokrytą poli-D-lizyną obok niej w celu przeniesienia, a następnie przytnij końcówkę pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby umożliwić delikatne zassanie sferoid komórek bez powodowania uszkodzeń. Za pomocą przyciętej końcówki pipety delikatnie zassaj każdą nienaruszoną sferoidę z dna studzienki. Przenieś każdą sferoidę do odpowiedniego dołka pokrytej płytki i pozwól jej osiąść przez 20 sekund.

Przenieś płytki testowe sferoidalne 3D do systemu obrazowania o wysokiej zawartości. Aby przeanalizować dane morfologiczne, zastosuj moduł regionu tekstury, aby zgrubnie oddzielić sferoidy 3D od tła, dzieląc zawartość obrazu na trzy klastry na podstawie cech tekstury. Zastosuj moduł wyszukiwania regionu obrazu, aby uściślić separację preizolowanych sferoid 3D przy użyciu charakterystyki rozmiaru opartej na objętości, zapewniając usunięcie zanieczyszczeń i zachowanie nienaruszonych sferoid.

Zmierz parametry morfologiczne sferoid 3D za pomocą modułu właściwości morfologicznych. Zastosuj moduł wyboru populacji, aby przefiltrować i zachować tylko oryginalne sferoidy komórek 3D, a następnie wyeksportuj wyniki danych morfologicznych. Sferoidy uformowały się widocznie w piątym dniu hodowli, zachowując jednolitą morfologię sferyczną we wszystkich obserwowanych próbkach.

Zdezintegrowaną sferoidę z widocznie zaburzoną integralnością strukturalną zaobserwowano również w piątym dniu. Analiza po transferze wykazała, że zarówno sferoidy 3D w grupie kontrolnej, jak i leczone fenofibratem pozostały nienaruszone w większości przypadków, ale niektóre sferoidy traktowane fenofibratem uległy dezintegracji. Tempo zużycia tlenu było znacznie zmniejszone w sferoidach leczonych fenofibratem we wszystkich punktach czasowych w porównaniu z grupą kontrolną.