Name: Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Poznaj metodę indukcji pełnej grubości ubytków osteochondralnych u owiec, zapewniającą cenny model do badań nad regeneracją chrząstki i odbudową funkcji stawów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Fundację Araucaria (grant numer PDT2020221000005). Dziękujemy całemu personelowi Instytutu Carlosa Chagasa oraz Programu Rozwoju Technologicznego w Narzędziach Zdrowotnych-RPT-FIOCRUZ za korzystanie z laboratorium mikroskopowego w FIOCRUZ/PR, Core of Cell Technology oraz Farmie Eksperymentalnej Uniwersytetu Katolickiego do Parana. Autorzy dziękują wsparciu finansowemu ze strony Programu de Estímulo à Pesquisa do Instituto Carlos Chagas – Fiocruz Paraná. Dziękujemy także Wagnerowi Nagibowi z Biura Komunikacji Instytutu Carlosa Chagasa za jego wkład w produkcję audiowizualną.

Badanie uzyskało zgodę Komitetu Etyki ds. Badań i zostało certyfikowane Certyfikatem Etycznej Prezentacji o numerze 6092250823/2023. W niniejszym badaniu wybrano dziewięć samic białego Suffolk w wieku 12 miesięcy. Wada powstała w obu przyśrodkowych kłykciach udowych każdego zwierzęcia. Puste defekty były używane jako kontrole. Każde zwierzę miało jedno kolano losowo przydzielone do leczenia GelMA, a drugie jako kontrolę. Ta strategia pozwoliła nam ocenić naturalną zdolność regeneracyjną i zmniejszyć wpływ indywidualnych wariantów, takich jak czynniki genetyczne czy dojrzałość szkieletowa. Zwierzęta były obserwowane przez 6 miesięcy w celu oceny powstawania chrząstki hejlinowej.
1. Zabieg znieczulający
<ol>
	<li>Pozbawić zwierzęta jedzenia i wody przez około 24 godziny przed zabiegiem chirurgicznym.</li>
	<li>Należy podawać domięśniową meperydynę 4 mg/kg w połączeniu z midazolamem 0,3 mg/kg.</li>
	<li>Napełnij waporyzator znieczulający dzień przed użyciem, gdy pomieszczenie jest puste, i noś rękawice ochronne, aby zminimalizować ryzyko narażenia zawodowego.</li>
	<li>Przed każdym zabiegiem sprawdź obwód znieczulający pod kątem nieszczelności i wykonuj wszystkie manipulacje w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa.</li>
	<li>Po 15 minutach kanuluj zwierzęta cewnikem 18 G i podawaj roztwór Ringera mlecznego z częstotliwością 10 mL∙kg-1∙h-1.</li>
	<li>Podawaj znieczulenie dożylne z użyciem 1% propofolu w dawce 4 mg/kg.</li>
	<li>Intubuj zwierzęta rurką endotracylną o długości 7,5-8,0 mm i utrzymuj je pod samoistą wentylacją za pomocą półzamkniętego, okrągłego systemu oddychania, który dostarcza tlen z FiO₂ 1,0 i przepływem 50 mL/kg.</li>
	<li>Stosuj technikę częściowej znieczulenia dożylnego (PIVA), utrzymuj propofol w ciągłej infuzji 0,1 mg∙kg-1 min-1 i dostosowuj stężenie izofluranu jedynie, aby uzyskać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego. Monitoruj głębokość znieczulenia przez cały czas zabiegu.</li>
	<li>Wykonaj blokady perineuralne nerwów udowych i rwy kulszowej, prowadzone przez lokalizator neurologiczny. Podawaj 0,2 mL/kg lidokainy 2% na każdą blokadę. UWAGA: Operacja powinna rozpocząć się dopiero po potwierdzeniu znieczulenia chirurgicznego (brak reakcji na mocne uszczypanie kopyta i brak napięcia szczęki).</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny in vivo
<ol>
	<li>Dezynfekuj ogolone kolano miejscowym środkiem antyseptykowym chlorheksydyną glukonianem i umieść zwierzę w pozycji grzbietowej dekubitu na sali operacyjnej.</li>
	<li>Zlokalizuj jamę stawową, dotykając kolana zwierzęcia, aby określić dokładne miejsce nacięcia. Wykonaj podwójnie zakrzywione nacięcie skórne (zaczynając dalej od bocznego nadkłykcia kości udowej, kończąc przyśrodkowo na poziomie guzowości piszczeli).</li>
	<li>Zidentyfikuj ścięgno rzepki, rzepkę, więzadło rzepkowe oraz przyśrodkową część torebki stawowej. Nacinaj torebkę, aby odsłonić kłykieć przyśrodkowy kości udowej. Nadmiernie rozciągnij kolano, aby zobaczyć najbardziej dalszy obszar chrząstki stawowej kłykciu.</li>
	<li>Wykonaj chirurgiczne nacięcie o długości około 3-5 cm w okolicy kłykcia zwierzęcia. Usuń warstwy tkanek pod skórą, aby uzyskać dostęp do kłykcia i utrzymuj miejsce nacięcia w czystości, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Zbieraj płyn maziowy za pomocą strzykawki i igły. Przenieś część próbki do probówki EDTA do analizy i wykorzystaj pozostały materiał do przygotowania szkiełek rozmazowych.</li>
	<li>Ustaw pchlery tak, aby całkowicie odsłonić powierzchnię kłykciu. Im bardziej odsłonięty jest kłykcik, tym łatwiej będzie wywołać uraz w kolejnym etapie. UWAGA: W tym momencie zwracaj uwagę na łapę zwierzęcia. Zgięcie lub wyprostowanie kolana może pomóc odsłonić kłykciu.</li>
	<li>Wierć defekt o średnicy 8 mm i głębokości 5 mm w centrum kłykcia przyśrodkowego kości udowej za pomocą wiertła ortopedycznego wyposażonego w wiertło trefinowe o średnicy 8 mm, zapewniając prawidłowe ustawienie i unikanie niezamierzonych wymiarów lub kształtów, oraz utrzymując kąt 0° względem najbardziej dalszego obszaru chrząstki stawowej. UWAGA: Trepanację wykonuj z najniższą możliwą prędkością, delikatnie obsługując sterowanie wiertłem i używając tylko tyle rotacji, by przeciąć chrząstkę i kość podchęstną, a także lokalnie chłodzić z 0,9% NaCl w temperaturze pokojowej, nawet przy niskiej prędkości.</li>
	<li>Wykonaj chirurgiczne usunięcie korka osteochondralnego za pomocą ortopedycznego młotka i osteotomu.</li>
	<li>Oczyść przedłużenie rany sterylną gazą, upewniając się, że wnętrze zmiany jest wolne od krwi i zanieczyszczeń tkanek.</li>
	<li>Nałóż 200 μL płynnej formuły GelMA o stężeniu 20% (w/v), zawierającej 0,25% (w/v) litowofenyl-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian (LAP) jako inicjator fotoinicjatora do wnętrza urazu, aż dotrze do powierzchni.</li>
	<li>Foto-krzyżowanie hydrożelu GelMA pod diodą LED 395-405 nm (łączna moc 9 W) umieszczoną około 5 cm od próbki przez 180 s. W tych warunkach szacowana ilość naświetlenia na powierzchni wynosi ~10 mW/cm², co daje łączną energię ekspozycji około 1,8 J/cm². UWAGA: Używaj ochronnych okularów podczas korzystania ze światła ultrafioletowego.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij rozciągacze.</li>
	<li>Zamknąć zmianę za pomocą niezależnych szwów w różnych warstwach tkanek, aby zapobiec powstawaniu seromów. Liczba potrzebnych szwów zależy od zakresu nacięcia chirurgicznego.</li>
	<li>Załóż sterylny bandaż na szwy, aby zapobiec infekcjom.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Monitoruj zwierzęta podczas rekonwalescencji po znieczuleniu, w tym parametry życiowe, takie jak tętno (70-90 uderzeń/min), częstość oddechu (12-20 oddechów/min), temperatura ciała (39 °C do 40,5 °C) oraz prawidłowe błony śluzowe z czasem uzupełnienia przez kapilary 1-2 s. Regularnie palpuj tętnice twarzowe i udowe, aby sprawdzić, czy puls jest łatwo wyczuwalny. UWAGA: Odzyskiwanie znieczulenia powinno odbywać się w cichym, czystym, ciepłym, wyściełanym środowisku, przy minimalnym oświetleniu i niskim poziomie hałasu.</li>
	<li>Wykonaj opatrunki na miejscu operacji z użyciem miejscowej penicyliny (benzathine penicylina G: 1 250 000 IU; prokaina penicylina G: 1 250 000 IU; dihydrostreptomycyna: 1,25 g; mocznik: 2,50 g) raz dziennie przez 10 dni.</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzęta pozostają w pozycji czworonożnej zaraz po przebudzeniu z narkozy, opierają się na operowanej kończynie i nie wykazują żadnych oznak dyskomfortu.</li>
	<li>Pooperacyjne leczenie obejmowało meloksykam (0,4 mg/kg co 24 godziny) oraz tramadol (2 mg/kg co 12 godzin) przez 5 dni. Dodatkową dawkę tramadolu podano, gdy mimika związana z bólem została zidentyfikowana za pomocą Sheep Grimace Scale41, zweryfikowanego narzędzia opartego na konkretnych jednostkach ruchu twarzy (w tym zaciskaniu oczodołu, reakcji flehmena, pozycji ucha i pozycji głowy) do oceny bólu i dyskomfortu pooperacyjnego u owiec.</li>
</ol>
4. Analiza histologiczna
<ol>
	<li>Sześć miesięcy po zabiegu operacyjnym przeprowadź eutanazję. Aby osiągnąć głęboką sedację przed podaniem środka eutanazji, należy podawać zwierzętom dożylnie ketaminę (10 mg/kg) i ksylazynę (1 mg/kg), stosując dawki celowo wyższe niż zwykle zalecane w procedurach klinicznych, aby zapewnić szybkie począcie głębokiej sedacji, zgodnie z przyjętymi protokołami eutanazji. Następnie podaj propofol, aby wywołać śpiączkę znieczuloną. Następnie podawaj chlorek potasu w dawce 2 mEq/kg dożylnie, aż do zatrzymania oddechu i sercowo-naczyniowego zatrzymania się, a wszelkie odruchy ochronne znikną.</li>
	<li>Przeciąć dalszą epifię kości udowej, aby usunąć obszar kłykciów. Utrwal rozcięte stawy kolanowe w 10% neutralno-buforowanej formalinie i odwapniał w 5% EDTA (kwas etylendiaminetetraoctowy) w temperaturze 34 °C, zmieniając roztwór EDTA co 3 dni.</li>
	<li>Materiał osadzić w parafinie i pociąć na sekcje o wymiarach 4 μm. Usuń parafinę ze szkiełek, mocząc je w ksylenie w 65 °C przez 3 x 5 minut. Nawadnij się 10-20 razy zanurzając w etanolu (99%, 95%, 70%), a następnie przez 5 minut i42 minuty w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>W barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E) barw przekroje hematoksyliną Harrisa i kontrbarw eozyną, skanuj z powiększeniem 20× za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu szkiełkowego i analizuj za pomocą powiązanego oprogramowania.</li>
	<li>Ocena zmiany według inicjatywy histopatologicznej Osteoarthritis Research Society International (OARSI)43: wynik 0 wskazuje na prawidłową chrząstkę; wynik 1 oznacza migotanie powierzchowne bez utraty chrząstki; wynik 2 odpowiada pionowym szczelinom sięgającym warstwy bezpośrednio pod strefą powierzchniową, którym towarzyszy częściowa utrata warstwy powierzchniowej; wynik 3 wskazuje na pionowe szczeliny lub erozję, które rozciągają się na zwapniałą chrząstkę i dotykają mniej niż 25% powierzchni stawowej; Wyniki 4, 5 i 6 oznaczają pionowe szczeliny lub erozję, które sięgają zwapniałej chrząstki i obejmują odpowiednio 25-50%, 50-75% oraz ponad 75% powierzchni stawowej. UWAGA: W tym badaniu zmiany z pionowymi szczelinami lub erozjami sięgającymi w zwapniałą chrząstkę i obejmujące ponad 25% powierzchni stawowej otrzymały wynik 4.</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Aby pokonać wyzwania w terapii chrząstki, takie jak niewystarczająca różnicacja chondrogenowa i dojrzewanie ECM, pozostają niezbędne badania niekliniczne do oceny strategii terapeutycznych. Metody nieklinicznych modeli uszkodzonej tkanki chrząstki zostały wcześniej opisane przy użyciu różnych technik45. Jednak literatura wciąż nie zawiera szczegółowych raportów ani ustandaryzowanych procedur wywoływania ostrego urazu kości kostczonioralnej u kolan dużych zwierząt, co powoduje znaczne zróżnicowanie...

Chrząstka jest niezbędna do zachowania mechanicznej kompetencji układu szkieletowego poprzez zapewnienie beztarciowej powierzchni między kośćmi w stawach dwuskładnikowych, zapobiegając tym samym erozji powierzchni stawowej1. Zdolność chrząstki do wykonywania tych wymagających funkcji mechanicznych w dużej mierze zależy od unikalnego składu i organizacji jej macierzy zewnątrzkomórkowej – szczególnie od wyjątkowo wysokiej zawartości wody. Woda odgrywa kluczową rolę w budowie i funkcji chrząstki stawowej, stanowiąc około 70-80% jej składu. Woda jest głównym pierwiastkiem odpowiedzialnym za noszenie podczas ściskania. Zdolność tkanki do opierania się siłom ściskającym zależy od tego, jak woda jest zbudowana i ograniczona w macierzy. Taka organizacja jest możliwa dzięki interakcji wody z głównymi makrocząsteczkami chrząstki, takimi jak kolagen i proteoglikany, zwłaszcza agregaty związane kwasem hialuronowym1. Działają one jak struktury zabezpieczające, które regulują i ograniczają przepływ wody. Ta interakcja zapewnia tkance nie tylko sztywność, ale także odporność i zdolność do regeneracji po deformacji. Interakcja między wodą wolną, związaną wodą i macierzą makrocząsteczkową stanowi rdzeń biomechanicznego zachowania chrząstki2.
Pomimo niezwykłej zdolności do podtrzymywania i rozkładania obciążeń fizycznych i mechanicznych docierającej do stawów, po uszkodzeniu chrząstka stawowa (AC) ma ograniczony potencjał do samoistnej naprawy z powodu niskiej aktywności mitotycznej chondrocytów i słabej unaczynienia tkanek2. Uszkodzenie stawów zwykle wiąże się z postępującą utratą cząsteczek i białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które stanowią 95% tkanki i nadają AC3 cechy biomechaniczne. Nierównowaga między syntezą a degradacją komponentów ECM, przesuwająca się w kierunku procesów katabolicznych, może prowadzić do choroby zwyrodnieniowej stawów (OA), najpowszechniejszej choroby zwyrodnieniowej stawów na świecie. Choroba zwyrodnieniowa stawów dotyka około 10-12% dorosłych osób, powodując ból, ograniczając mobilność i znacząco ograniczając autonomię pacjentów4. Choroba zwyrodnieniowa stawów jest częściej występująca w starszych populacjach ze względu na kumulacyjne uszkodzenia stawu przez całe życie; Jednak z początkiem klinicznego stanu wiążą się różne czynniki ryzyka, takie jak płeć, predyspozycje genetyczne, otyłość oraz codzienne nawyki4. Do tej pory podejścia terapeutyczne do leczenia OA polegały na klinicznym leczeniu objawów oraz całkowitej zamiennicy stawu w najcięższych przypadkach5. Bez solidnej, powtarzalnej i niezawodnej strategii terapeutycznej skutecznego leczenia OA badane są innowacyjne podejścia do zrozumienia i rozwiązania problemów związanych z uszkodzeniem chrząstki stawowej.
Aby naprawić, zregenerować i poprawić ruchomość stawów w stawach artretycznych, postęp w medycynie regeneracyjnej stał się nową nadzieją na przywrócenie uszkodzonego AC 6,7. Wykorzystanie autologicznych chondrocytów w połączeniu z implantacją ECM i intraartykularnym wstrzykiwaniem komórek macierzystych stanowi obecny stan wiedzy w tej dziedzinie 8,9,10. Głównym wyzwaniem tych podejść jest zapewnienie odpowiedniej różnicacji i funkcjonalnej syntezy ECM przez wszczepione komórki. Chondrocyty autologiczne mają tendencję do tworzenia włóknistości chrząstki lub przechodzenia do stanu przerostu, tworząc nową dysfunkcyjną tkankę, która nie odzwierciedla fizjologicznych cech AC, prowadząc do niepełnego powrotu do zdrowia i często późnego pogorszeniastanu stanu 11. Biomateriały mogą być wykorzystywane do kierowania zachowaniem komórek podczas regeneracji tkanek, zapewniając tymczasową konstrukcję, dzięki której komórki mogą się przyklejać i syntetyzować nową, naturalną i funkcjonalną macierz zewnątrzkomórkową 12,13,14. Idealny biomateriał do inżynierii chrząstki musi zapewnić silną integrację z otaczającymi tkankami, zwłaszcza z kością podchrząstkową, ponieważ awaria na tym styku zagraża długoterminowej naprawie. Jednak słabe wiązanie między warstwami chrząstki i kości rusztowania kostnego oraz słaba integracja z tkanką gospodarza pozostają poważnym wyzwaniem15. Chociaż rusztowania próbują naśladować rodzimą architekturę osteochondralną, odtworzenie złożonej mikrostruktury interfejsu nadal jest trudne. Podkreśla to znaczenie badań i rozwoju rusztowań o właściwościach biologicznych, które jednocześnie wspierają regenerację chrząstki i kości, zachowując stabilność interfejsu16. Żelatyna, pochodząca z kolagenu – kluczowego składnika tkanki chrząstki – posiada właściwości takie jak motywy wiążące komórki i biodegradowalność, co sugeruje jej potencjał jako biomateriału wspierającego w połączeniu z czynnikami regeneracyjnymi w leczeniu zmian kostchondralnych. Po chemicznej modyfikacji bezwodnikem metakrylu w celu powstania metakryloylu żelatynowego (GelMA), staje się on fotosieciowalny, umożliwiając iniekcję i fotopolimeryzację in situ, co zwiększa stabilność mechaniczną w zastosowaniach w medycynie regeneracyjnej17.
Zmiany osteochondralne mają ograniczoną zdolność regeneracyjną, co stanowi wyzwanie kliniczne. Badania przedkliniczne wykorzystujące modele urazów stawu kolanowego na dużych zwierzętach są niezbędne dla badań translacyjnych, ponieważ umożliwiają systematyczną ocenę zmiennych wpływających na mechanizmy choroby i efekty terapeutyczne. Najczęściej stosowane gatunki to świnie, kozy, psy, konie i owce, z których każdy ma specyficzne zalety i ograniczenia, które należy uwzględnić przy projektowaniu eksperymentów. Co więcej, wszystkie te gatunki wykazują ograniczoną endogenną naprawę defektów chondralnych i osteochondralnych, co zaobserwowano u ludzi18. Aby zapewnić, że modele te są przewidywalne dla wyników ludzkich, muszą odtwarzać istotne parametry, takie jak anatomia, fizjologia i właściwości biomechaniczne18. Dla porównania, grubość ludzkiej chrząstki stawowej w kłykciach udowych wynosi od 1,8 do 2 mm19, a średnica zmian chrząstki wymagających leczenia to 10 mm lubwiększa 20.
Model wieprzowy oferuje zalety w badaniach regeneracji chrząstki i kości kostnodźndralnej, ponieważ rozmiar stawów, grubość chrząstki oraz wymagania dotyczące obciążenia są bardzo podobne do tych obserwowanych u ludzi18. Niektóre miniaturowe rasy świń, takie jak miniświnia z Getyngi, są łatwe w obsłudze i osiągają dojrzałość szkieletową między 18 a 22 miesiącami życia21 lat. Grubość chrząstki waha się od 1 do 2 mm, a defekty 6 do 8 mm mogą powstać18 mm. Cechy kości, takie jak grubość trawek, szybkość aportacji kości oraz organizacja włókien kolagenowych, są porównywalne z cechami u ludzi22. Jednak model wieprzowy ma również ograniczenia: nawet u miniaturowych ras staw kolanowy (kolenowy) jest mniejszy niż u ludzi, co ogranicza powstawanie dużych wad eksperymentalnych. Ponadto większość badań wykorzystuje zwierzęta szkieletowo niedojrzałe ze względu na związane z tym koszty utrzymania, które mogą przeszacować potencjał naprawy23.
Kozy wykazują anatomię stawów, biomechanikę i grubość chrząstki podobne do ludzkiej24. Nie wymagają specjalistycznych udogodnień, są łatwe w obsłudze i stosunkowo niedrogie25. Grubość chrząstki koziej wynosi od 0,8 do 2,0 mm, a najczęściej zgłaszany krytyczny defekt to 6 mm26. Jednak istnieje znaczna różnica w grubości chrząstki między rasami, rozmiarami i płciami, co może prowadzić do niespójnych wyników27. Stosunek kości chrząstki do kości podchonidrowej oraz struktura kości trawekowej są również porównywalne z tymi u ludzi. Dojrzałość szkieletu następuje stosunkowo późno, między 24. a 36. miesiącem życia29 lat. Z biomechanicznego punktu widzenia kolano kozy doświadcza nacisków stawowych i obciążeń cyklicznych podobnych do ludzkich25, choć zgięcie kolana podczas chodu jest większe (50°-70° u kóz w porównaniu do <30° u ludzi), co skutkuje wyraźnymi obszarami kontaktu30. Ta różnica, w połączeniu z wyższym ciśnieniem szczytowym, może przyczyniać się do mniej efektywnej naprawy chrząstki30.
Wśród modeli dużych zwierząt psy wyróżniają się zdolnością do tolerowania rehabilitacji, unieruchamiania stawów oraz treningu do chodzenia na bieżni, pływania i kontrolowanych ćwiczeń obciążających18. Grubość chrząstki stawowej waha się od 0,9 do 1,3 mm, a krytyczny rozmiar defektu to około 4 mm, co ogranicza bezpośrednie porównanie do ludzkiego modelu25. Dojrzałość szkieletu występuje między 8,5 a 13,7 miesiąca życia31 lat. Anatomicznie kolano psa różni się od ludzkiego, a różnice w biomechanice, wzorcach obciążenia i dojrzałości między rasami komplikują ekstrapolację wyników32. Pomimo tych różnic anatomicznych i niewielkiego rozmiaru defektu, model psa pozostaje cenny w badaniach takich jak protokoły rehabilitacyjne lub spontaniczne patologie chrząstki podobne do tych u ludzi. Jednak jego zastosowanie eksperymentalne jest ograniczone przez względy etyczne29.
Model konia jest największym dostępnym modelem zwierzęcym do badań nad naprawą chrząstki i naturalnie rozwija zmiany chondralne związane z wiekiem lub urazami oraz chorobę zwyrodnieniową stawów podobną do tych u ludzi. Konie wykazują cechy anatomiczne i biomechaniczne porównywalne do ludzkich, takie jak wyprostowany staw kolanowy, duży rozmiar stawu, grubość chrząstki od 2 do 3 mm bliższa ludzkiemu – pełne wyprostowanie kolana podczas chodu oraz porównywalną gęstość mineralną kości34. Dojrzałość szkieletu występuje między 24 a 48 miesiącami, a rozmiary defektów powszechnie badanych wahają się od 6 do 20 mm32,33. Ograniczenia obejmują wysokie pionowe obciążenie stawu końskiego podczas poruszania się, które naraża implanty na większe siły niż u ludzi i utrudnia długotrwałe gojenie35. Ponadto koszty zakupu i utrzymania są wysokie, a specjalistyczne obiektysą wymagane 36.
Owce są szeroko wykorzystywane jako wzór w badaniach nad naprawą chrząstki ze względu na dostępność, łagodny temperament, dobrą tolerancję na operacje stawów oraz łatwość manipulacji37. Dojrzałość szkieletowa u owiec zwykle osiąga się około 2-3 lat w wieku25 lat. Ponadto kolano owcze wykazuje anatomiczne i biomechaniczne podobieństwa do ludzkiego stawukolanowego 38. Grubość chrząstki w kłykciu przyśrodkowym kości udowej waha się od 0,7 do 1,7 mm, a gęstość mineralna kości i ciśnienie kontaktowe są również porównywalne, choć frakcja objętości kości jest wyższa u owiec39. Ze względu na zmniejszoną grubość chrząstki, indukowane defekty często sięgają kości podchrząstki, co czyni ten model bardziej odpowiednim do badań wad osteochondralnych32. Zmiany o średnicy od 6 do 8 mm zwykle powstają w miejscach takich jak kłykcia udowe i krętka32. Ponadto model owiec oferuje zalety dla badań dwustronnych, umożliwiając porównywanie miejsc leczenia i kontroli w obrębie tego samego zwierzęcia, co zmniejsza zmienność związaną z gospodarzem, poprawia spójność i powtarzalność oraz minimalizuje liczbę zwierząt wymaganych40. Każdy model wykazuje różne stopnie podobieństwa do fizjologii i biomechaniki człowieka. Dlatego wybór modelu powinien równoważyć znaczenie biologiczne, praktyczną wykonalność oraz względy etyczne. W niniejszym badaniu uwzględniono samice owiec o zerowych zerwaczkach w wieku 12 miesięcy, oceniane w okresie sezonowego roztrusia.
Badanie miało na celu opracowanie skutecznego protokołu generowania ostrych defektów osteochondralnych u dużych zwierząt. Protokół polega na stworzeniu pełnogrubej zmiany kościowej w kości, aby stworzyć model odpowiedni do badań medycyny regeneracyjnej. Dodatkowo badane jest zastosowanie hydrożelu GelMA jako przewodnika do gojenia tkanek oraz jako prospektywnej metody dostarczania regeneracyjnych cząsteczek i komórek. Protokół określa procedurę chirurgiczną powstania zmian osteochondralnych w chrząstce stawowej kolan owcy. Jest adaptowalny do różnych zastosowań inżynierii tkankowej, w tym do indukcji podobnych urazów w innych modelach dużych zwierząt w medycynie regeneracyjnej.

<table><tbody><tr><td>25 nici szwów poliglekaprinowych, nr 2-0</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Nitka sza do ogólnego zamknięcia tkanek miękkich była używana do zszywania torebki stawowej i tkanki komórkowej podskórnej.</td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciw-beta;-Tubulina</td><td>Invitrogen</td><td>PA516863</td><td>Przeciwciała przeciwko &beta;-tubulinie, czyli dwóm podjednostkom (&alfa;/&beta;) tworzącym mikrotubule cytoszkieletu</td></tr><tr><td>Urządzenie znieczulające</td><td>HB hospitalar</td><td></td><td>Sprzęt do znieczulenia inhalacyjnego</td></tr><tr><td>Axio Scan Z1</td><td>Zeiss, Monachium, Niemcy</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Benzatyna penicylina G</td><td>Ourofino</td><td></td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Cewnik 18 G&nbsp;</td><td>Solidor</td><td></td><td>Cewnik dożylny</td></tr><tr><td>Cefaleksyna</td><td>Virbac</td><td></td><td>Terapia przeciwdrobnoustrojowa</td></tr><tr><td>Roztwór wodny diglukonianu chlorheksydiny</td><td>RIOQU &Iacute; MICA</td><td></td><td>Środek antyseptyczny stosowany w leczeniu przeciwsepsy skóry</td></tr><tr><td>Skrzynka endotchawicowa 7,5 i zaciśnięta; 8,0 mm</td><td>Solidor</td><td></td><td>Skrzyniona rurka endotchealna z mankietami</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td> Medium hodowlane komórek</td></tr><tr><td>Siarczan dihydrostreptomycyny</td><td>Ourofino</td><td></td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Rurka EDTA</td><td>Becton Dickinson</td><td>362788</td><td>Rurka zbiorcza</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Neon</td><td>1795</td><td>Barwnik używany do wizualizacji morfologii komórek, barwienia &nbsp; cytoplazma.</td></tr><tr><td>Kwas etylendiaminetetraoctowy</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Sprzyja stopniowej demineralizacji tkanki kostnej</td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>Suplement do hodowli komórkowej z czynnikami wzrostu</td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>Zachowanie morfologii tkanek</td></tr><tr><td>GelMA Liofilizowany</td><td>TissueLabs</td><td>GLMA-LYO-1</td><td>Hydrożel fotokrzyżowy</td></tr><tr><td>Harris hematoksylina &nbsp;</td><td>Laborclin</td><td>620503</td><td>Barwnik używany do wizualizacji morfologii komórek, barwienia jąder.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Crist&aacute; Lia</td><td></td><td>Utrzymanie znieczulenia</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>VETNIL</td><td></td><td>Procedura eutanazji</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Ringera z laktacją</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Terapia płynami</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Aminokwas niezbędny do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Lidokaina chlorowodorek&nbsp;</td><td>Crist&aacute; Lia</td><td></td><td>Znieczulenie miejscowe</td></tr><tr><td>Zestaw żywotności/żywotności ŻYWYCH/MARTWYCH</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Zestaw do testowania fluorescencyjnego do oceny żywotności komórek</td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>Ouro fino</td><td></td><td>Przeciwzapalne i przeciwbólowe w okresie pooperacyjnym</td></tr><tr><td>Chlorowodorek midazolamu</td><td>Crist&aacute; Lia</td><td></td><td>Leki preanestezjowe</td></tr><tr><td>Nić do szwów mononylonowych, nr 3-0</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Szew stosowany do zamykania skóry</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Cristalia</td><td></td><td>Roztwór soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Lokalizator neuro</td><td>Neurolocalizador DL 250 DeltaLife</td><td></td><td>Znieczulenie miejscowe prowadzone przez neurolokalizator i elektrostymulator nerwów obwodowych.</td></tr><tr><td>Ortopedyczne ćwiczenia</td><td>Kanulowany Mini Ortopedyczny Wiertar (delikatny) - chromowany mandrel - marka Makita</td><td></td><td>Stosowane w operacjach ortopedycznych.</td></tr><tr><td>Młotek ortopedyczny &nbsp;</td><td>Edlo</td><td>Hammer Neufield (10-3155)</td><td>Ogólne cechy: 20 cm długości i 560 gr wagi; materiał: wysokiej jakości stal nierdzewna; Zastosowanie: Wskazane do zabiegów traumatologicznych i ortopedycznych wymagających kontrolowanego uderzenia. Certyfikaty: produkty posiadają certyfikaty jakości, takie jak ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjną): 13485:2016, z europejskimi standardami zgodności i dobrych praktyk produkcyjnych.</td></tr><tr><td>Osteotom lambotte</td><td>Edlo</td><td>Osteotom lambotte (10-0749)</td><td>Osteotom Lambotte (6 mm x 17 cm / 6 3/4") to precyzyjny instrument chirurgiczny stosowany głównie w chirurgii ortopedycznej oraz procedurach neurochirurgicznych związanych z manipulacją kośćmi. Z końcówką o szerokości 6 mm jest idealny do delikatnych cięć, przekształcania oraz usuwania zwartej chrząstki i kości podchrząstki.</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyk o szerokim spektrum szeroko stosowany w hodowli komórek</td></tr><tr><td>chlorowodorek petydyny&nbsp;</td><td>Crist&aacute; Lia</td><td></td><td>Leki preanestezjowe</td></tr><tr><td>Chlorek potasu 19,1%</td><td>Samtekowie</td><td></td><td>Procedura eutanazji</td></tr><tr><td>Prokaina penicylina G</td><td>Ourofino</td><td></td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Crist&aacute; Lia</td><td></td><td>Indukcja i utrzymanie znieczulenia</td></tr><tr><td>Mleczan Ringera</td><td>Crist&aacute; Lia</td><td></td><td>Terapia płynami</td></tr><tr><td>Półzamknięty system oddychania kołowego;</td><td>HB hospitalar</td><td></td><td>Obwód oddechowy w znieczuleniu</td></tr><tr><td>Sterylny plaster z krepy</td><td>Cremer</td><td></td><td>Sterylny opatrunek z krepy, używany do zakrycia dalszych końców kończyn poddawanych operacji.</td></tr><tr><td>Stimuplex D, 22 Ga. x 2 cale. (50 mm) Igła izolowana z zestawem przedłużającym 30 stopni; Faza (STIMD2250/30)</td><td>BBRAUN</td><td></td><td>Znieczulenie miejscowe w obwodzie nerwowym</td></tr><tr><td>Chlorek tramadolu</td><td>Crist&aacute; Lia</td><td></td><td>Analgezja pooperacyjna</td></tr><tr><td>Trephine Drill</td><td>Bone Trephine Drill, średnica mm & ndash; model: Contra-angle, marka: chirurgiczny WF</td><td></td><td>Wiertło Trephine do zbierania kości 8,0 mm; produkowany ze stali chirurgicznej; stosowane w operacjach przeszczepów kości; Służy do usunięcia bloku kostnego na potrzeby analizy histologicznej lub autograftu.</td></tr><tr><td>Xylazyna 10%</td><td>VETNIL</td><td></td><td>Procedura eutanazji</td></tr></tbody></table>

ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Establishment and Evaluation of a Sheep Model of Full-thickness Osteochondral Defect

Starzenie się, trauma, predyspozycje genetyczne i styl życia wpływają na degradację chrząstki organizmu. Po urazie ciągłe obelgi wynikające z codziennych czynności mogą wywołać choroby patologiczne, takie jak choroba zwyrodnieniowa stawów, będąca główną przyczyną niepełnosprawności i strat społeczno-ekonomicznych na całym świecie. Głównym celem wszystkich ortopedów leczących urazy chrząstki stawowej jest zmniejszenie anatomicznego rozległości zmiany, naprawa powierzchni chrząstki oraz przywrócenie stabilności stawu. Modele zwierzęce są niezbędne do rozwoju leków terapeutycznych, ale obecne modele defektów chrząstki są niezadowalające. Zmiany kościowe u owiec są cennym modelem do testowania nowych terapii i biomateriałów, które mogą wspomagać regenerację chrząstki i kości w środowisku stawów ludzkich. Badanie to ustanowiło efektywny protokół indukowania ostrych defektów osteochondralnych u dużych zwierząt. W obu przyśrodkowych kłykciach kości udowej powstała ustandaryzowana zmiana. Jedno kolano zostało losowo przypisane do leczenia żelatyno-metacryloilem, natomiast przeciwległe kolano pełniło funkcję kontroli. Sześć miesięcy po zabiegu usunięto obszar kłykcia udowego, rozcięte stawy kolanowe zostały odwapnięte, osadzone w parafinie i pocięte na fragmenty, które barwione były hematoksyliną i eozyną. Do oceny zmiany użyto wyników. Ta metoda pozwala na natychmiastową obserwację makroskopową po indukcji urazu. Dodatkowo model ten skutecznie odtwarza kliniczne wady chrząstki, stanowiąc cenny model do badania ich patologii i opracowywania innowacyjnych metod terapeutycznych.

Indukcja defektu kości krążeniowej
Celem tego badania było opracowanie efektywnego protokołu indukującego ostre defekty osteochondralne u dużych zwierząt. Urazy powstały mechanicznie podczas zabiegu chirurgicznego, co skutkowało uszkodzeniem o średnicy około 8 mm i głębokości 5 mm (Rysunek 1). Biorąc pod uwagę wyniki ustalone przez International Cartilage Regeneration & Condition Preservation Society, ten typ urazu stanowi zmianę stopnia 4, defini...

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Aging, trauma, genetic predisposition, and lifestyle impact the human body&#180;s cartilage degradation. Once injured, continuous insults resulting from ...

Chrząstka odgrywa kluczową rolę w zachowaniu mechanicznej sprawności układu szkieletowego, zapewniając gładką i nasmarowaną powierzchnię w stawach dwuskładnikowych, zapobiegając erozji powierzchni stawowej. Pomimo niezwykłej zdolności do wspierania i rozkładania obciążeń fizycznych i mechanicznych w stawach, w przypadku urazu chrząstka stawowa ma ograniczoną zdolność do wewnętrznego gojenia i naprawy. Nagromadzenie napięcia w chrząstce stawowej może prowadzić do choroby patologicznej znanej jako choroba zwyrodnieniowa stawów, najczęstszej na świecie formy zwyrodnieniowej choroby stawów, która dotyka prawie 10 do 12% dorosłej populacji na świecie.Regeneracja chrząstki i przywrócenie funkcji stawów artretycznych stanowią istotne postępy w medycynie regeneracyjnej. Obiecujące podejście obejmuje wykorzystanie autologicznych chondrocytów i komórek macierzystych w połączeniu z biomateriałami. Aby zweryfikować te strategie, niezbędne są odpowiednie modele zwierzęce, podczas gdy mniejsze zwierzęta, takie jak szczury i króliki, są przydatne do badań wstępnych, natomiast duże zwierzęta, takie jak owce, są bardziej odpowiednie ze względu na ich anatomiczne i biomechaniczne podobieństwa do stawów ludzkich.Następnie przedstawiamy efektywny protokół indukowania defektów osteochondralnych u dużych zwierząt, który stanowi idealny model dla badań w medycynie regeneracyjnej. Po dezynfekcji ogolonego kolana na sali operacyjnej umieść zwierzę w pozycji grzbietowej dekubitus. Aby określić dokładne miejsce chirurgicznego cięcia, dotknij kolana zwierzęcia, aby znaleźć jamę stawową.Wykonaj chirurgiczne cięcie o rozmiarze około trzech do pięciu centymetrów. Upewnij się, że nacięcie jest wykonywane w okolicy kłykcia zwierzęcia. Usuń warstwy tkanek pod skórą, aby uzyskać dostęp do kłykciu.Utrzymuj miejsce nacięcia w czystości, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia i zapewnić dobrą widoczność podczas zabiegu. Pobieranie płynu maziowego wykonuj za pomocą strzykawki i igły. Ustaw pchlery tak, aby całkowicie odsłonić powierzchnię kłykciu.Im bardziej odsłonięty jest kłykcik, tym łatwiej będzie wywołać uraz w kolejnym etapie. Użyj ortopedycznego wiertła podłączonego do ośmiomilimetrowego wiertła trephinu, aby wywołać uraz kłykcia zwierzęcia. Przed rozpoczęciem wiercenia upewnij się, że trephina jest prawidłowo umieszczona w centrum kłykciu, aby uniknąć niepożądanych urazów.Do chirurgicznego usunięcia korka kostnego użyj młotka ortopedycznego i osteotomu. Oczyść przedłużenie rany sterylną gazą, upewniając się, że wnętrze zmiany jest wolne od krwi i zanieczyszczeń tkanek. Ostrożnie nałóż 200 mikrolitrów płynnej formuły gelMA na wnętrze urazu, aż dotrze do powierzchni.Skieruj światło UV na uraz przez trzy minuty w odległości około pięciu centymetrów, co pozwala na sieć gelMA. Ostrożnie wyjmij retraktory. Zamknąć zmianę za pomocą niezależnych szwów dla każdej warstwy tkanki, aby zapobiec powstawaniu seroma.Liczba szwów, które należy wykonać, zależy od wielkości nacięcia chirurgicznego. Załóż plaster na szwy, aby zapobiec infekcjom. Po siedmiu dniach operacji owce nadal będą miały trudności z poruszaniem się.Trudności te potwierdzają ruchy obrotowe obserwowane podczas oceny chodzenia zwierzęcia. Ta obserwacja pokazuje, że nasz protokół skutecznie wywołał uraz osteochondralny w stawie zwierzęcia. Przez cztery dni, w zależności od sposobu leczenia zmiany, ruch chodu zwierzęcia zostaje przywrócony i zaczyna prawidłowo chodzić.Ocena histologiczna z barwieniem hematoksylynowym i eozynowym została przeprowadzona sześć miesięcy po zabiegu chirurgicznym. Zmiany te pojawiły się jako całkowite pionowe rozszczepy, odpowiadające czwartemu punktowi w skali oceny Osteoarthritis Research Society International. U niektórych próbek zaobserwowano łagodną hiperplazję maziową oraz zastąpienie chrząstki tkanką włókniętą.Wyniki histologiczne wykazały znaczną zmienność zarówno w naturalnym postępie, jak i grupach leczonych gelMA, a analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic między leczeniami. Ponieważ jest to eksperyment na zwierzętach połączony z inwazyjnym zabiegiem chirurgicznym, zwierzęta mogą wykazywać różnice w zachowaniu i rekonwalescencie. Nasze badania wykazały skuteczny protokół indukcji urazów kościowo-chrząstowych u dużych zwierząt bez wystąpienia długotrwałych infekcji bakteryjnych.

establishment-evaluation-sheep-model-full-thickness-osteochondral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano eksperymentalną technikę leczenia uszkodzeń chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Implantacja autologicznych chondrocytów osadzonych na macierzy jest powszechnie akceptowaną metodą przebudowy i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej, zapewniającą satysfakcjonujące długoterminowe wyniki. Transplantacja autologicznych chondrocytów wspomagana macierzą (MACT) oferuje zstandaryzowaną i klinicznie uznaną metodę implantacji.

Przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację i hodowlę eksplantatów chrząstek z kolan bydlęcych. Metoda ta stanowi łatwe i przystępne narzędzie do opisywania zmian w tkankach w odpowiedzi na bodźce biologiczne lub nowatorskie terapie ukierunkowane na staw.

Model hodowli tkankowej ex vivo przebudowy chrząstki w eksplantatach bydlęcego kolana

Tutaj prezentujemy model uszkodzenia chrząstki śródstawowej w kolanie szczura wywołany cyklicznym obciążeniem, generowany przez 60 cyklicznych uciśnięć powyżej 20 N, skutkujących uszkodzeniem chrząstki kłykciowej kości udowej u szczurów.

Nieinwazyjna metoda generowania modelu uszkodzenia chrząstki stawowej w kolanie szczura wywołanego cyklicznym obciążeniem

Obecny protokół opisuje kontrolowane zadrapania mikroostrza na powierzchni chrząstki stawowej po destabilizacji kolana myszy poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła minipiszczelowego. Ten model zwierzęcy przedstawia przyspieszoną postać choroby zwyrodnieniowej stawów (OA) odpowiednią do badania tworzenia osteofitów, osteosklerozy i bólu we wczesnym stadium.

Destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów

Model otwartego wpływu kłykcia kości udowej przyśrodkowej u królików jest wiarygodny do badania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) i nowych strategii terapeutycznych mających na celu złagodzenie progresji PTOA. Protokół ten generuje izolowany ubytek chrząstki tylnego przyśrodkowego kłykcia kości udowej u królików za pomocą wieży zrzutowej opartej na wózku z głowicą impaktora.

Powtarzalny model wpływu chrząstki w celu wygenerowania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów u królika

Ten protokół ustanawia model pełnogrubych wad chrząstki (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów i mierzenie późniejszego zachowania bólowego i zmian histopatologicznych.

Opracowanie i ocena szczurzego modelu ubytków chrząstki pełnej grubości

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Aby lepiej zrozumieć reakcję chondrocytów na mechaniczne przeciążenie chrząstki, protokół opisuje rozwój modelu wpływu chrząstki ex vivo, który był subletalny przez 24 godziny.

In vitro Model wpływu do generowania subletalnego uszkodzenia chondrocytów w eksplantatach chrząstki bydlęcej

Poznaj metodę indukcji pełnej grubości ubytków osteochondralnych u owiec, zapewniającą cenny model do badań nad regeneracją chrząstki i odbudową funkcji stawów.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Przeglądaj więcej filmów