Name: Ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej z wykorzystaniem wskaźnika fagocytozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować pani Mei Fang, pani Min Ma, pani Yu-Tong Meng oraz panu Quan-Kai Lei za ich początkowe zasługi. Badania te zostały częściowo finansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82270697), Projekt Planowania Nauki i Technologii prowincji Guangdong (2021B1212040016), Podstawową i Stosowaną Fundację Badań Podstawowych Guangdong (2023A1515012574), Prowincjonalną Jednostkę Kształcenia Dyscyplin Medycznych (JSDW202229) oraz Fundusz Innowacji Ekosystemowych Haihe (HH24KYZX0008), Chińską Fundację Przedsiębiorczości i Zatrudnienia Młodzieży – Inwaiers Public Welfare Fundusz (HH25KYHX0003).

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt przeprowadzono zgodnie z politykami i procedurami etycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jiangsu (UJS-IACUC) (Nr zatwierdzenia UJS-IACUC-2021090102). Badanie to zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Jiangsu. Wszystkie próbki zostały pobrane od pacjentów, którzy wyrazili świadomą zgodę. Usunięty supernatant należy umieścić w dedykowanym zbiorniku na ciecz i przekazać do szpitalnego oddziału chorób zakaźnych.
1. Izolacja makrofagów
<ol>
	<li>Przygotowanie: Przygotuj niezbędne materiały, w tym szczury eksperymentalne, pojemniki do znieczulenia, zlewki oraz izofluran jako środek znieczulający oraz wstępnie schładzaj wirówkę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Znieczulanie i uśpiewanie szczurów: Zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami, podczas eksperymentów znieczulaj zwierzęta inhalacją izofluranem, a po eksperymencie uśpień CO2 .</li>
	<li>Dezynfekcja alkoholowa i nacięcie: Dezynfekuj odwłok szczura etanolem i wykonaj niewielkie nacięcie w ścianie brzucha.</li>
	<li>Wstrzykiwanie i mieszanie płynu brzusznego: Wstrzyknąć 50 ml lodowato zimnego, sterylnego PBS do jamy brzusznej wzdłuż linii środkowej za pomocą strzykawki. Delikatnie potrząśnij szczurem i masuj ścianę brzucha palcami, aby zapewnić dokładne wymieszanie płynu w jamie brzusznej. Masaż trwa 2-3 minuty.</li>
	<li>Zbieranie płynu brzusznego: Lekko przechyl ciało i zasysaj płyn brzuszny strzykawką.</li>
	<li>Wirowanie: Wiruj zebrany płyn w 500 x g przez 5 minut w 4 °C, a następnie wyrzucaj supernatant.</li>
	<li>Liza krwinków: Dodaj 3-5 razy objętość osadu komórkowego buforu lizyjnego i delikatnie mieszaj przez 1-2 minuty. UWAGA: Na przykład, jeśli objętość granulek komórkowych wynosi 1 mL, dodaj 3-5 ml buforu lizy. Ten krok można wykonać w temperaturze pokojowej lub w 4 °C, po czym następuje wirowanie w 400-500 x g przez 5 minut. Bardziej efektywne jest wirowanie w temperaturze 4 °C. Z powodu ciśnienia osmotycznego antykrwinki ulgają lizie, a roztwór zmienia kolor na czerwony. Po wirowaniu usuń czerwony supernatant.<ol>
		<li>Przepis buforu lizy czerwonych krwinek (RBC): Rozpuść 8,3 g NH4Cl, 1,0 g KHCO3 i 1,8 mL 5% EDTA w 800 mL destylowanegoH2O, a następnie przefiltrować przez filtr 0,2 μm, qs do 1000 mL z destylowanym H2O i dostosować pH 7,2~7,4. Jeśli czerwony osad jest nadal widoczny, powtarzaj ten krok, aż roztwór stanie się przezroczysty i przejrzysty. Zazwyczaj niewielka ilość resztkowych czerwonych krwinek nie wpływa na kolejne testy (jeśli w pelletcie jest niewiele, ten krok można pominąć).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie ogniw: Przemyj ogniwa dwukrotnie około 10 mL wcześniej schłodzonego medium RPMI 1640. Wiruj w 500 x g przez 5 minut w 4 °C i wyrzucaj supernatant.</li>
	<li>Rezawisja i liczenie komórek: Ponownie zawiesić komórki w podłożu wstępnie schłodzonym o RPMI 1640 + 1% FBS + 1% PS, liczyć komórki za pomocą barwienia Trypan Blue i oceniać żywotność komórek.</li>
	<li>Hodowla komórek: Jeśli hodowla jest konieczna, należy nasiewać komórki o gęstości 1× 106/mL na 24-dołkowej płytce hodowlowej, z 1 mL RPMI 1640-10% FBS-1% PS na dołek. Po 2 godzinach inkubacji wymień podłoże i przemyj doły 1-2 razy podłożem RPMI 1640, aby usunąć nieprzylegające komórki. UWAGA: Komórki przylegające tworzą monowarstwę makrofagów. Jeśli potrzebna jest ekstrakcja RNA, należy dodać 1 mL Trizolu do pelletu komórkowego, pipetować wielokrotnie, aby rozbić komórki, i przenieść mieszaninę do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL w celu natychmiastowej ekstrakcji RNA lub przechowywania w temperaturze -80 °C. Do analizy FACS dostosuj liczbę komórek do 1 × 106 na probówkę, dodaj 20 μL buforu FACS i przekonuj barwienie FACS. Bufor FACS: DPBS + 2% FBS, filtr sterylizowany przez filtr 0,22 μm, przechowywany w temperaturze 4 °C).</li>
</ol>
2. Zbieranie krwinek szczurów lub ludzi
<ol>
	<li>Przygotowanie: Przedpłucz 15 mL rurki do wirówek i 10 mL strzykawki z heparyną.</li>
	<li>Zbieranie krwi szczura z żyły ogonowej: Po znieczuleniu szczura, ostrożnie odetnij mały fragment ogona szczura nożyczkami i pobierz krew z żyły ogonowej. Na końcu eksperymentu uśpij szczuraCO2.</li>
	<li>Pobieranie ludzkiej krwi: Pobieranie ludzkiej krwi za pomocą techniki wenipunkcji.</li>
	<li>Mieszanie próbek krwi: Wymieszaj 1 mL PBS z 1 mL krwi żylnej lub szczurzej.</li>
	<li>Separacja gęstości Ficoll: Dodaj 1,5 mL roztworu Ficolla o gęstości 1,077 do probówki wirówki o pojemności 15 mL dla ludzkiej krwi obwodowej; do 15 mL wirówki na krew szczurów należy dodać 1,5 mL roztworu Ficoll o gęstości 1,084 litra.</li>
	<li>Warstwowanie próbek krwi: Powoli nakładaj rozcieńczone próbki krwi wzdłuż ściany rurki wirówki na odpowiedni roztwór gradientu gęstości.</li>
	<li>Wirowanie: Wirówka w 400 x g przez 30 minut w temperaturze 18-20 °C.</li>
	<li>Usunięcie warstw osocza i limfocytów: Usunięcie górnej warstwy osocza, warstwy limfocytów oraz warstwy roztworu Ficoll, pozostawiając jedynie dolną warstwę czerwonych krwinek.</li>
	<li>Płukanie czerwonych krwinek: Przemyj krwinki raz 10 mL PBS.</li>
	<li>Wirowanie i usuwanie supernatantu: Wirówka 400 x g przez 5 minut i odrzuć supernatant.</li>
	<li>Resuspension i liczenie: Dodaj 1 mL podłoża RPMI 1640 do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, wymieszaj z odpowiednią ilością pelletu czerwonych krwinek i przeprowadź liczenie komórek.</li>
</ol>
3. Test fagocytozy in vitro
<ol>
	<li>Izolacja i hodowla makrofagów: Izoluj makrofagi i zasiewaj je z gęstością 1× 106 komórek /dołek na płytce hodowli z 12 dołkami. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 2 godziny, aby komórki mogły się przykleić.</li>
	<li>Usuwanie komórek nieprzywierających: Po 2 godzinach inkubacji ostrożnie usuń komórki nieprzywierające i delikatnie przemyj go w podłożu RPMI 1640.</li>
	<li>Kontynuacja hodowli: Kontynuuj hodowlę przylegających makrofagów przez maksymalnie 2 godziny, aby zapewnić całkowite przyleganie do dolnej części płytki.</li>
	<li>Leczenie głodzeniem: Po 2 godzinach zastąpić podłoże bezsurowicowym RPMI 1640 i inkubować w warunkach głodzenia przez 2 godziny, aby zwiększyć aktywność fagocytów makrofagów.</li>
	<li>Dodawanie ludzkich komórek: Dodaj ludzkie komórki wstępnie zabarwione DeepRed do płytki hodowlowej i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 2 godziny, aby makrofagi mogły fagocytozować ludzkie komórki.</li>
	<li>Podsumowanie i analiza: Po badaniu fagocytozy obserwuj aktywność fagocytów pod mikroskopem lub ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej (FACS).</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek: Trawić komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i zatrzymać trawienie za pomocą podłoża RPMI 1640 zawierającego 10% FBS. Wirówka komórek, odrzuć supernatant, ponownie zawiesić komórki w buforze FACS i liczyć je. Przygotuj 1 × 106 komórek na probówkę w dwóch probówkach. Dodatkowo przygotuj jedną probówkę ludzkich czerwonych krwinek i jedną tubkę z krwinkami szczurów.</li>
	<li>Przygotowanie probówki z pojedynczym barwnikiem: Dodaj przeciwciało CD163 przeciw myszy do jednej probówki, przeciwciało antyludzkie CD235a u myszy do rurki z czerwonymi krwinkami u człowieka oraz DeepRed do rurki krwinek szczura.<ol>
		<li>Inkubuj te rurki na lodzie, chronione przed światłem, przez 30 minut, mieszając co 10 minut. Dodaj 1 mL buforu FACS, aby zmyć niezwiązane przeciwciała, przewijdź w wirówkę i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesijcie komórki w 500 μL buforu FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki: Dodaj mys-anty-rat CD163, mys-anty-human CD235a oraz DeepRed do probówek. Inkubuj na lodzie, chronionym przed światłem, przez 30 minut, mieszając co 10 minut. Dodaj 1 mL buforu FACS do każdej probówki, aby zmyć niezwiązane przeciwciała, wiruj i usuwaj supernatant. Ponownie zawiesijcie komórki w 500 μL buforu FACS.</li>
	<li>Analiza: Wykluczenie adhezji komórek poprzez gatowanie FSC-H w porównaniu z FSC-A. Użyj lamp z pojedynczym barwnikiem, aby dostosować odpowiednie napięcie i ustawienia kompensacji przed analizą próbek (Rysunek 1). Analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo v10.8.1. UWAGA: Do ustawienia kompensacji użyto pojedynczych kontrolek CD163-FITC i PI z barwionymi barwami.</li>
</ol>

<ol><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2FGAMMAC%28null%29+mouse%3A+An+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/GAMMAC(null) mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Szpirer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+of+human+diseases+and+related+phenotypes%3A+A+novel+inventory+of+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Rat models of human diseases and related phenotypes: A novel inventory of causative genes.</a> Mamm Genome. 33 (1), 88-90 (2022).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival-assured+liver+injury+preconditioning+%28SALIC%29+enables+robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah+Rag2%28-%2F-%29+IL2rg%28-%2F-%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Survival-assured liver injury preconditioning (SALIC) enables robust expansion of human hepatocytes in Fah Rag2(-/-) IL2rg(-/-) rats.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (19), e2101188(2021).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nat Biotechnol. 35 (12), 1211(2017).</li>
<li>Furuya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evidence+of+a+macrophage+barrier+in+the+xenotransplantation+of+human+hematopoietic+stem+cells+to+severely+immunodeficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">The evidence of a macrophage barrier in the xenotransplantation of human hematopoietic stem cells to severely immunodeficient rats.</a> Xenotransplantation. 28 (4), e12702(2021).</li>
<li>Barclay, A. N., Van den Berg, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+signal+regulatory+protein+alpha+%28SIRP%CE%B1%29+and+CD47%3A+Structure%2C+function%2C+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47: Structure, function, and therapeutic target.</a> Annu Rev Immunol. 32, 25-50 (2014).</li>
<li>Ide, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+CD47-SIRPalpha+signaling+in+xenograft+rejection+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role for CD47-SIRPalpha signaling in xenograft rejection by macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5062-5066 (2007).</li>
<li>Matlung, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD47-SIRP%CE%B1+signaling+axis+as+an+innate+immune+checkpoint+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The CD47-SIRPα signaling axis as an innate immune checkpoint in cancer.</a> Immunol Rev. 276 (1), 145-164 (2017).</li>
<li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li>
<li>Gu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+measuring+innate+phagocytosis+by+human+monocytes+using+real-time+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry.</a> Cytometry A. 85 (4), 313-321 (2014).</li>
<li>Joffe, A. M., Bakalar, M. H., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phagocytosis+assay+with+reconstituted+target+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Macrophage phagocytosis assay with reconstituted target particles.</a> Nat Protoc. 15 (7), 2230-2246 (2020).</li>
</ol>

JYG jest doradcą naukowym Prometheus RegMed Tech Ltd. Autorzy z lewicy nie deklarują potencjalnego konfliktu interesów.

Badanie to ustanowiło solidny i powtarzalny test in vitro do oceny fagocytozy pośredniczonej przez makrofagi zarówno ksenogenetycznych, jak i allogenicznych czerwonych krwinek. W tym badaniu ludzkie czerwone krwinki zostały oznaczone CD235a-BV421, natomiast u szczurów barwione barwnikiem DeepRed. Gdy makrofagi fagocytują oznakowane czerwone krwinki, sprzężone przeciwciała (CD235a-BV421) lub barwnik (DeepRed) są internalizowane razem. W rezultacie same makrofagi wykazują odpowiadającą fluorescencję. W tych warunk...

Wykorzystanie ksenogenicznych przeszczepów komórek, szczególnie wszczepianie ludzkich komórek do modeli zwierzęcych, jest kluczową strategią w badaniach biomedycznych1. Umożliwia ocenę przeżycia komórek, przeszczepu oraz odpowiedzi immunologicznych w kontrolowanym środowisku in vivo . Chociaż modele myszy historycznie dominowały w tej dziedzinie ze względu na dobrze scharakteryzowaną genetykę i łatwość manipulacji, ich niewielki rozmiar stanowi istotne ograniczenie w badaniach wymagających dużych objętości krwi lub wysokiej wydajności komórek. Natomiast szczury oferują kilka zalet, w tym większą masę ciała, lepszą istotność fizjologiczną dla ludzkich organizmów oraz wyższą produkcję próbek biologicznych, takich jak makrofagi krwi lub otrzewnowne2. W konsekwencji modele szczurów są coraz częściej wykorzystywane w badaniach nad hematopoezą i układem odpornościowym3.
Jednym z głównych wyzwań w transplantacji ksenogenicznej jest odrzucenie immunologiczne. Nawet w modelach niedoborczych immunonie, gdzie komórki T, B lub NK są genetycznie ablacowane, pozostałe komórki odporności wrodzonej, szczególnie makrofagi, pozostają aktywne4. Makrofagi pełnią rolę obrońców pierwszego wyboru układu odpornościowego gospodarza, rozpoznając i eliminując obce komórki poprzez fagocytozę5. Proces ten jest częściowo regulowany przez interakcję między białkiem regulatorem sygnału alfa (SIRPα) na makrofagach a CD47, sygnałem "nie jedz mnie" wyrażanym w większości typów komórek. Gdy CD47 z ludzkich komórek nie jest rozpoznawany przez gryzonia SIRPα, to niedopasowanie może prowadzić do zwiększonej fagocytozy. Nawet u tych permisywnych zwierząt o niedoborze odporności zjawisko to również występuje 6,7.
Ilościowe określenie fagocytozy podsycanej przez makrofagi w tym kontekście jest kluczowe dla oceny prawdopodobieństwa przeżycia komórek oraz optymalizacji strategii transplantacji8. Chociaż opracowano różne metody in vivo i ex vivo do oceny odrzucenia odpornościowego, standaryzowane testy in vitro na fagocytozę makrofagów pozostają ograniczone. Tradycyjne metody oparte na mikroskopii są często pracochłonne i pozbawione ilościowej rzetelności. Cytometria przepływowa, w przeciwieństwie do tego, oferuje analizę opartą na pojedynczych komórkach oraz platformę ilościową zdolną do precyzyjnego rozróżniania typów komórek oraz pomiaru pobierania fagocytów poprzez wykrywanie markerów powierzchniowych.
W tym artykule opracowaliśmy standaryzowany test in vitro , aby ocenić różnicową fagocytozę ludzkich i szczurzych czerwonych krwinek przez makrofagi otrzewnowe szczurów. Krwinki służą jako idealny model do testów fagocytozy ze względu na swoją prostą strukturę i ekspresję CD47, która działa jako "własny" sygnał hamujący klirens wywołany przez makrofagi9. W tym protokole makrofagi otrzewnej szczurów są pobierane przez płukanie otrzewnej, hodowane in vitro i wystawiane na działanie ludzkich krwinek lub allogenicznych krwinków szczurów oznaczonych DeepRed. Po współinkubacji cytometria przepływowa jest wykorzystywana do oceny internalizacji czerwonych krwinków przez makrofagi. Makrofagi identyfikowane są ekspresją CD163, ludzkie cyrtromby CD235a, a u szczurów fluorescencja DeepRed. Martwe komórki są wykluczane przez barwienie PI, co zapewnia, że analizowane są tylko żywotne makrofagi.
Takie podejście umożliwia dokładną, ilościową ocenę fagocytarnej aktywności allogenicznych i ksenogenicznych RBC in vitro, dostarczając wglądu w zakres immunologicznego oczyszczania pośredniczonego przez makrofagi. W naszych eksperymentach makrofagi szczurów wykazały istotnie wyższą fagocytozę ludzkich czerwonych krwinek (5,08%) w porównaniu do cyrocytozy szczurów (1,59%), co dało względny wskaźnik fagocytozy 3,21. Wyniki te podkreślają znaczenie wrodzonych mechanizmów odpornościowych w środowiskach ksenogenicznych oraz podkreślają wartość tego testu w walidacji modeli przedklinicznych.
Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół oferuje powtarzalną i efektywną metodę pomiaru fagocytozy makrofagów in vitro. Jest szczególnie przydatna dla badaczy pracujących w dziedzinach ksenotransplantacji, badań nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi oraz testów zgodności immunologicznej. Dzięki zapewnieniu ustandaryzowanych ram do ilościowej identyfikacji fagocytozy, ten test może przyczynić się do poprawy eksperymentalnej powtarzalności oraz lepszego zrozumienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelach przeszczepów międzygatunkowych.

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Deep Red Cell Tracker</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; C34565</td><td>Proszek (15 &mu; g) został rozwiązany w DMSO (20 &mu; L)</td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>C10010500BT</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>Cytiva</td><td>17544602</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało antyludzkie CD235a BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562938</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-rat CD163 FITC</td><td>BIO-RAD</td><td>MCA342F</td><td></td></tr><tr><td>Białko K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>11875093</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro

A Quantitative Assessment of the Phagocytosis of Allogeneic and Xenogeneic Erythrocytes by Rat Macrophages In Vitro

Transplantacja komórek ksenogenicznych często spotyka się ze znacznym odrzuceniem immunologicznym, nawet w modelach zwierzęcych o niedoborze odporności. Wśród pozostałych składników odpornościowych makrofagi mogą aktywnie fagocytozować przeszczepione ludzkie komórki, co stanowi wyzwanie dla długoterminowego przeszczepienia. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy standaryzowany test in vitro do ilościowego określenia fagocytozy ludzkiej i szczurskiej krwinki (RBC) pośredniczonej przez makrofagi. Makrofagi otrzewnowe szczurów zostały wyizolowane, hodowane i wystawione na działanie ludzkich lub szczurzych krwinek krwinkowych. Ludzkie krwinki zidentyfikowano za pomocą CD235a, natomiast u szczurów wirusy zostały wcześniej oznaczone DeepRed. Analiza cytometrii przepływowej została przeprowadzona przy użyciu CD163 w celu identyfikacji makrofagów i wykluczenia jodu propidium (PI) do komórek żywych bram. Wyniki wykazały istotną różnicę w aktywności fagocytycznej: 5,08% makrofagów pochłonęło ludzkie cyrbki, podczas gdy tylko 1,59% fagocytowało cyrbki szczurów, co daje względny wskaźnik fagocytozy 3,21. Protokół ten pozwala na ilościową ocenę zgodności immunologicznej i oferuje powtarzalną metodę oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w ksenotransplantacji. Ma potencjał do doskonalenia selekcji dawców i biorców oraz kierowania strategiami immunosupresyjnymi w badaniach translacyjnych.

Dzięki analizie cytometrii przepływowej możemy wywnioskować wskaźnik fagocytozy makrofagów szczurów wobec ludzkich i szczurzych krwinek. Martwe komórki są najpierw wykluczane za pomocą PI. Makrofagi z CD163-dodatnimi ekspresją CD235a wskazują na fagocytozę ludzkich czerwonych krwinek. Odsetek makrofagów posiadających fagocytozowane hRBC definiuje się jako wskaźnik fagocytozy makrofagów szczurów wobec ludzkich czerwonych krwinek. Podobnie obliczono odsetek fagocytozy w czerwonych krwinkach szczurów. Komórki podwójnie doda...

Praca ta opisuje ustandaryzowany protokół in vitro służący do ilościowego określenia i porównania wskaźników fagocytozy ksenogenicznych (ludzkich) i allogenicznych (szczurów) czerwonych krwinek przez izolowane makrofagi szczurów.

Ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro

Xenogeneic cell transplantation often faces significant immune rejection, even in immunodeficient animal models. Among residual immune components, ...

Nasze badania mają na celu opracowanie nowej strategii ilościowej oceny wskaźnika fagocytozy in vitro komórek ksenogenicznych przez makrofagi. Zaprojektowaliśmy system współinkubacji, w którym mikrofagi jednocześnie fagocytują zarówno komórki allogeniczne, jak i ksenogeniczne. Obliczając względny indeks fagocytozy, skutecznie wyeliminowaliśmy wpływ zmienności poszczególnych osób.Opracowaliśmy metodę oceny odpowiedzi odrzutowej makrofagów wobec komórek ksenogenicznych, która oferuje istotną przewagę, w tym szeroką zastosowalność, prostotę operacyjną oraz mierzalne wyniki. Makrofagi fagocytozą komórek ksenogenicznych przekraczają trzy razy szybciej niż komórki allogeniczne. Otwiera to nowe kierunki rozwoju strategii ksenofagocytozy, co zwiększa stabilność ksenotransplantacji.Nasze laboratorium skupi się na opracowaniu strategii redukcji fagocytozy komórek ksenogenicznych za pośrednictwem makrofagów oraz przezwyciężeniu odrzucenia odporności po przeszczepie, z ostatecznym celem budowy stabilnych, humanizowanych modeli zwierzęcych. Na początek dezynfekuj odwłok uśpionego szczura etanolem i wykonaj niewielkie nacięcie w ścianie brzucha. Za pomocą strzykawki wstrzyknij 50 mililitrów lodowatego, sterylnego PBS do jamy brzusznej wzdłuż linii środkowej.Delikatnie potrząśnij szczurem i masuj ścianę brzucha palcami, aby dokładnie wymieszać płyn w jamie brzusznej przez dwie do trzech minut. Następnie lekko przechyl ciało szczura, aby zebrać płyn brzuszny i zasysać go strzykawką. Wiruj zebraną ciecz w 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie odrzuć supernatant, dodaj trzy do pięciu razy większą objętość osadu buforu lizy czerwonych krwinek i delikatnie mieszaj przez jedną do dwóch minut. Po odwirowaniu rurki usuń czerwony supernatant. Aby przygotować bufor do lizy czerwonych krwinek, wymieszaj składniki pokazane tutaj i dostosuj objętość do 1000 mililitrów z wodą destylowaną.Używając filtra 0,2 mikrometra, sterylizuj roztwór, a następnie dwukrotnie myj komórki przy użyciu około 10 mililitrów wcześniej schłodzonego medium RPMI-1640. Wiruj za każdym razem na 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesz komórki w podłożu wstępnie schłodzonym zawierającym RPMI-1640 z 1% FBS i 1% penicylin-streptomycyny.Użyj barwienia trypanowego niebieskiego, aby policzyć komórki i ocenić żywotność komórek. Jeśli konieczne jest hodowlanie, należy zasiać komórki na 24-dołkowej płycie hodowlowej z użyciem jednego mililitra podłoża RPMI-1640 zawierającego 10% FBS i 1% penicylin-streptomycyny na dołek. Po dwugodzinnej inkubacji wymień podłoże i przemyj doły raz do dwóch razy medium RPMI-1640, aby usunąć nieprzywierające komórki.Przed płukaniem probówek do wirówek 15 mililitrów i strzykawek 10 mililitrów z heparyną, aby zapobiec krzepkowaniu. Po znieczuleniu i uśpieniu szczura, użyj nożyczek, aby ostrożnie odciąć mały fragment jego ogona. Pobieraj krew podczas kapiącej z żyły ogonowej za pomocą heparynizowanej strzykawki lub rurki.Pobierz ludzką krew techniką nakłucia żył. Wymieszaj jeden mililitr PBS z jednym mililitrem ludzkiej lub szczurjej krwi w probówce wirówkowej. Dla ludzkiej krwi obwodowej dodaj 1,5 mililitra roztworu Ficoll o gęstości 1,077 do rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów.Powoli warstwuj rozcieńczone próbki krwi wzdłuż ściany rurek wirówek zawierających roztwór Ficoll, aby uniknąć mieszania. Wirówka warstwowych próbek w 400 g przez 30 minut w temperaturze od 18 do 20 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie usuń górną warstwę osocza, warstwę limfocytów oraz roztwór Ficolla, pozostawiając jedynie warstwę czerwonych krwinek na dole.Umyj czerwone krwinki raz 10 mililitrami PBS. Następnie wiruj czerwone krwinki w dawce 400 g przez pięć minut i wyrzucaj supernatant. Dodaj jeden mililitr medium RPMI-1640 do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Przed liczeniem komórek wymieszaj z odpowiednią ilością pelletu czerwonych krwinek. Izoluj makrofagi i zasiewaj je z gęstością 1 miliona komórek na dołek w 12-dołkowej płycie hodowlarskiej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny, aby umożliwić przyczepność komórek.Po dwóch godzinach ostrożnie usuń nieprzylegające komórki i delikatnie przepłucz każdą jamkę podłożem RPMI-1640. Zamień pożywkę na RPMI-1640 bez surowicy i inkubuj komórki przez dwie godziny w warunkach głodzenia, aby zwiększyć aktywność fagocytów. Następnie dodaj ludzkie komórki wstępnie barwione barwnikiem Deep Red do płytki hodowlowej i inkubuj tak, jak pokazano wcześniej, aby umożliwić fagocytozę makrofagów.Trawić komórki przy użyciu 0,05% trypsyny-EDTA i zatrzymać trawienie, dodając podłoże RPMI-1640 zawierające 10% FBS. Następnie odwidź ogniwa. Usuń supernatant i ponownie zawiesz pellet w buforze FACS.Następnie przygotuj po 1 milion komórek na probówkę w dwóch oddzielnych probówkach oraz dodatkowo po jednej probówce z krwinkami czerwonymi u ludzi i szczurów. Następnie dodaj myszą anty-szczurzą przeciwciało CD163 do jednej z probówek. Dodaj mysie przeciwciało CD235a do ludzkiej rurki krwinek i dodaj Deep Red do rurki z czerwonymi krwinkami szczura.Wszystkie oznaczone probówki inkubuj na lodzie, chronione przed światłem przez 30 minut, mieszając co 10 minut. Dodaj jeden mililitr buforu FACS, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Po odwirowaniu rurek ponownie zawieś granulki komórkowe w 500 mikrolitrach buforu FACS.Wyłącz agregaty komórek poprzez ograniczenie wysokości rozproszenia w kierunku przód względem obszaru rozpraszania w kierunku przednim. Użyj rur z pojedynczym barwieniem do regulacji napięcia i ustawień kompensacji na cytometrze przepływowym. Analiza cytometrii przepływowej zidentyfikowała makrofagi szczurów z wynikiem CD163 o średniej częstotliwości 4,78% po wykluczeniu martwych komórek.Wskaźnik fagocytozy makrofagów szczurów wobec ludzkich czerwonych krwinek wynosił 5,08%, co było wyższe niż odsetek u szczurów – 1,59%

a-quantitative-assessment-phagocytosis-allogeneic-xenogeneic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Źródło: Nagre, N. i inni. Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i usuwanie bakterii u myszy. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje ocenę fagocytozy pośredniczonej przez receptory komplementacyjne przy użyciu czerwonych krwinek owiec opsonowanych IgM i dopełniakiem, a następnie ich przyjmowania przez mysie makrofagi. Zakres fagocytozy mierzy się poprzez pomiar niebieskiego produktu chromogenicznego powstałego w wyniku katalyzowanej przez hemoglobinę utleniania diaminofluorenu.

Modelowanie fagocytozy podleganej komplementem za pomocą opsonizowanych czerwonych krwinek in vitro

Ten film demonstruje test do monitorowania niezależnych zdarzeń fagocytozy krwinek czerwonych (RBC) za pośrednictwem makrofagów. Mysie immunoglobuliny G (IgG) opsonizowane ludzkie erytrocyty są inkubowane z mysimi makrofagami i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Erytrocyty są pochłaniane przez makrofagi poprzez tworzenie miseczki fagocytarnej i ukierunkowane na degradację lizosomalną.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Ten film demonstruje test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej, obejmujący znakowane i opsonizowane erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum przez monocyty. Cytometria przepływowa identyfikuje fluorescencję w monocytach, potwierdzając pomyślną identyfikację opsonizowanych erytrocytów poprzez fagocytozę.

Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Ten film prezentuje jednowarstwowy test monocytów wykorzystujący pierwotne monocyty z krwi obwodowej do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ z opsonizowanymi przeciwciałami poli D czerwonych krwinek R2R2.

Test do badania fagocytozy sterowanej receptorem fcγ w monowarstwach monocytów

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Test monocytów (MMA) to test in vitro, który wykorzystuje izolowane pierwotne monocyty uzyskane z pełnej krwi obwodowej ssaków do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR).

Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Tutaj prezentujemy protokół oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy przy użyciu wzmocnionej zielonej fluorescencji wyrażającej białko Escherichia coli.

Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

Tutaj przedstawiamy powszechne metody analizy funkcji fagocytarnej mysich makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego z płuc. Metody te badają fagocytozę in vitro kulek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz fagocytozę in vivo białka zielonej fluorescencji Pseudomonas aeruginosa.  Opisujemy również metodę usuwania P. aeruginosa u myszy.

Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Opracowaliśmy ulepszenia i zaktualizowane metody dla istniejącego testu monocytytowo-monowarstwowego (MMA), w którym makrofagi są używane do lepszego przewidywania klinicznego znaczenia alloprzeciwciał krwinek czerwonych w medycynie transfuzjologicznej i immunologii. Ten test nazywa się testem monocytów-makrofagów (M-MA).

Przewidywanie znaczenia przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym za pomocą testu monocytów-makrofagów

Poznaj metodę ilościowej oceny fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej z wykorzystaniem wskaźnika fagocytozy.

Ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro

Przeglądaj więcej filmów