Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Zakres naszych badań polega na zrozumieniu mierników chorób mitochondrialnych oraz znalezieniu leków do ich leczenia. Wyzwaniem jest utrzymanie zdolności do testów o wysokiej przepustowości, nawet jeśli technika ta zawiera tworzenie organoidów. Na początek usuń pożywkę z indukowanych pluripotentnych płytek hodowli komórek macierzystych, gdy są one w stanie około 70 do 80% się zbiórki.

Przemyj komórki PBS. Dodaj do komórek 350 mikrolitrów roztworu enzymów i inkubuj. Dodaj 800 mikrolitrów medium do dopasowania łodygi, aby zatrzymać reakcję.

Po przelaniu zawiesiny do świeżej rurki wiruj ją w 190G przez pięć minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesz granulkę w jednym mililitrze medium różnicowego. Po przeliczeniu komórek zasiej 3000 komórek w 100 mikrolitrach do każdej dołki płytki o niskim przyczepie w kształcie litery U o 96 dołkach.

Inkubuj przez sześć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z stężeniem 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji użyj pipety o szerokim przekształceniu, aby przenieść organoidy z płyty 96 dołków do naczynia o średnicy 10 centymetrów. Pipeta podaj 50 mikrolitrów uzupełnionego medium DMEM/F12 do każdej studni nowej płyty o pojemności 96 dołków.

Zbierz organoidy do rurek o dwóch mililitrach. Delikatnie usuń podłoże, nie zasysając organoidów, i dodaj 1,5 mililitra podłoża z dodatkiem DMEM/F12. Po ostatnim pipetowaniu dodaj 500 mikrolitrów świeżego medium.

Następnie przenieś organoidy do naczynia o średnicy 10 centymetrów. Dodaj pięć mililitrów medium, aby ułatwić wyskubanie każdego organoidu. Przenieś wszystkie organoidy do każdego dołku płyty 96-dołkowej za pomocą mikropipety ustawionej na 50 mikrolitrów i inkubuj przez trzy dni.

Dziewiątego dnia zbierz organoidy do rurek o dwóch mililitrach i myj trzy razy DMEM/F12. Następnie ponownie zawiesić organoidy w ośrodku różnicującym. Przełóż około 10 organoidów na odwiert do płyty sześciodołowej i dostosuj końcową objętość medium w każdym dołku do dwóch mililitrów.

Hoduj płytkę statycznie przez sześć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Na 15. dzień zbierz organoidy do rurek o masie 15 milimetrów. Po osadzeniu się w tubach dodaj świeże medium różnicujące z dodatkiem B27 i witaminy A po pipetowaniu supernatantu.

Przenieś około 10 organoidów na odwiert do płyty sześciodołowej. Hodować organoid statycznie przez 15 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Posmaruj płytki hodowlane rozcieńczonym roztworem poli-L-Ornityny.

Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia myj studnie trzy razy po pięć minut za pomocą PBS. Teraz dodaj rozcieńczony roztwór lamininy do studni.

Inkubuj płytki przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez całą noc. Wiruj zawiesinę organoidową z częstotliwością 200G przez pięć minut. Usuń supernatant i dodaj jeden mililitr roztworu enzymatycznego.

Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut przed wirówką. Po usunięciu supernatantu i dodaniu jednego mililitra roztworu dyspersyjnego, ostrożnie ułóż warstwę roztworu izolacyjnego pod zawiesiną. Następnie wiruj zawiesina w 200G przez pięć minut.

Teraz podaj do rurki jeden mililitr pożywki neuronalnej. Wymieszaj roztwór i przepuszczaj zawieszenie przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do rurki o średnicy 50 milimetrów. Po zliczeniu komórek zasiać zawiesinę komórkową o gęstości 100 000 komórek na centymetr kwadratowy na płytkach pokrytych poli-L-ornityną i lamininą.

Wymieniaj medium co cztery do siedmiu dni, aż do 60. dnia. Aby utrwalić organoidy pod kątem immunofluorescencji, najpierw pobierz je do mikrorurek. Przepłucz organoidy PBS, a następnie utrwal organoidy w 4% paradehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu myj utrwalone organoidy trzy razy PBS. Przechowuj organoidy w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. 30 dni po wysiewaniu do 2D kultury neuronalnej usuń podłoże hodowlane z płytek.

Następnie myj komórki PBS. Utrwalaj komórki 4% paradehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń paradehyd pipetą, a następnie przepłucz komórki PBS trzy razy.

Przechowywać stałe ogniwa w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby zebrać organoidy do RTQPCR, przenieś je do mikrorurek. Pipetą włóż PBS do rurek, aby umyć organoidy.

Następnie dodaj 350 mikrolitrów buforu lizycznego do organoidów, a następnie zamroz je w ciekłym azocie. Przechowuj rurki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Organoidy mózgowe zawierające neurony FOXG1 pozytywne zostały pomyślnie indukowane z zdrowej kontrolnej linii IPSC 414C2 w 30. dniu, a 2D hodowlane sieci neuronowe uzyskano w 60. dniu.

Poziomy heteroplazmy wariantu M.3243A do G zostały potwierdzone przez QPCR. Linia od drugiej do ósmej miała niską heteroplazmę, a od drugiej do szóstej o wysokiej heteroplazmy. Organoidy mózgowe pochodzące z linii o niskiej heteroplazmie od dwóch do ośmiu wykazywały rozmiary i morfologie podobne do tych u zdrowych kontroli.

Organoidy wygenerowane z linii o wysokiej heteroplazmie od dwóch do sześciu wykazywały zmniejszony rozmiar 0,3 milimetra kwadratowego oraz nieregularną morfologię o wartości kołowej 0,82. Większość neuronów indukowanych z linii 414C2 oraz linii od 2 do 8 była dodatnia na FOXG1 w dniach 30 i 60. Neurony FOXG1 pozytywne rzadko wykrywano w organoidach lub neuronach hodowanych 2D pochodzących z linii od dwóch do sześciu.

Nasze wyniki sugerują, że modele organoidów oparte na IPSC, pochodzące od pacjentów, stanowią użyteczną platformę do badania luster, mechanizmów oraz badań przesiewowych leków. Nasze konwencjonalne metody z krótkim czasem hodowli i opłacalnością oferują praktyczne narzędzia do badania patofizjologii MELIS. Chcielibyśmy w przyszłości poszukiwać potencjalnych leków na MELIS, stosując związki z pacjentami zorganizowanymi w przyszłości.