ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wsparciu Providence Airway Center w Providence Health Care, którego wkład umożliwił ukończenie tego rękopisu. Prace te zostały sfinansowane przez MITACS (ID IT27789), we współpracy z Providence Airway Center (PAC) w Providence Health Care (PHC) oraz Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (IDs AWD-024378 i AWD-024440).

Wszystkie etapy wymagają techniki aseptycznej, materiałów sterylnych i odczynników, a wykonywane są w szafie bioasekuracyjnej, aby zmniejszyć narażenie personelu na materiały biologicznie niebezpieczne i zanieczyszczenie hodowli. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Hodowla komórkowa i zakładanie zapasów komórkowych
<ol>
	<li>Przed powstaniem organoidów hoduj komórki A549 i MRC-5 na standardowych plastikowych kolbach poddanych posiewce tkankowej (T75 cm2) do około 70%-80% konfluentności przy użyciu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego o 10% płodową surowicę bydła (FBS) i 1% penicylin-streptomycynę, dalej określaną jako "kompletny DMEM".</li>
	<li>Zarówno dla A549, jak i MRC-5, nasiona o objętości 2 x 104 komórek /cm 2, w całkowitej objętości 10 mL kompletnego DMEM. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5%CO2 w nawilżonym środowisku aż do osiągnięcia około 70%-80% konfluencji.</li>
	<li>Wymieniaj podłoże co 48 godzin, aby zapewnić optymalne warunki wzrostu.</li>
	<li>Subkultura: zasysanie wszystkich podłoży z kolby po zbiórce w 70%-80%, przemycie raz ciepłem solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie dodanie 4 mL trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Inkubuj w 37 °C przez 5 minut i wizualizuj kolby mikroskopem jasnym, aby zapewnić całkowite odłączenie. Neutralizuj, dodając 4 mL kompletnego DMEM.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą wybranej techniki, takiej jak liczenie wykluczeń trypanowego niebieskiego.</li>
	<li>Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Aspiruj supernatant, aby pozostawić osad komórkowy na dnie stożkowej rurki. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w odpowiedniej objętości kompletnego DMEM, delikatnie triturując.</li>
	<li>Do zamrażania należy ponownie zawiesnąć w kompletnym ośrodku zawierającym 10% DMSO, aby uzyskać 1 x10 6 komórek /mL. Do powstawania organoidów ponownie zawiesaj, aby uzyskać 1 x 106 komórek /mL.</li>
</ol>
2. Ustalenie i scharakteryzowanie dojrzewania trójwymiarowego modelu organoidu nadbłonkowego i włóknistego pęcherzyka włosowego
UWAGA: Matryca piwnicy powinna być rozmrażona na lodzie przez noc i przechowywana w lodzie podczas tych etapów. Wyższe temperatury mogą powodować zastygnięcie matrycy.
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę 2:3 matrycy piwnicowej i zaawansowanego DMEM. Dodaj 300 μL tego roztworu do każdej dołki płyty z 24 dołkami, zapewniając równomierne pokrycie dna każdego dołku. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze przez 1 godzinę, aby matryca mogła się zastygnąć.</li>
	<li>Przygotuj 5% roztwór matrycy piwnicowej w pełnym DMEM, który będzie podłożem hodowlowym organoidów. Dla każdego otworu uzyskaj 1,2 mL tego roztworu, rozcieńczając 60 μL matrycy podstawowej w 1 140 μL pełnego DMEM.</li>
	<li>W czasie zastygania matrycy podstawowej wymieszaj 300 000 ogniw A549 z 30 000 ogniw MRC-5 w 200 μL 5% roztworu matrycy podstawowej przygotowanego w pełnym DMEM opisanym w kroku 2.2.</li>
	<li>Gdy mieszanina podstawowa 2:3 się zastygnie, pipetować 200 μL mieszaniny A549/MRC-5 na żelowaną matrycę, a następnie przywrócić płytę z 24 dołkami do inkubacji w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 21 dni, aby umożliwić wzrost i różnicowanie organoidów pęcherzykowych.</li>
	<li>Wizualizuj kultury pod mikroskopem świetlnym przez następne 48 godzin. Komórki powinny się agregować w tym czasie.</li>
	<li>Co 48 godzin wymień 5% roztwór matrycy piwnicowej/DMEM na 200 μL świeżego medium 5%. Aby nie zakłócać organoidów osadzonych w hydrożelu, delikatnie przechyl płytkę, aby stary roztwór gromadził się wzdłuż ścianki studni przed aspiracją.</li>
	<li>W dniach 3, 9 i 21 dojrzewania zrób zdjęcia organoidów z 10-krotnym obiektywnym powiększeniem i wykonaj cztery reprezentatywne obrazy lub pola widzenia każdego dołku. Reprezentatywne obrazy wczesnej morfologii organoidów w dniach 3, 9 i 21 przedstawione są na Rysunku 1.</li>
	<li>Dla każdego pola widzenia policz wszystkie organoidy większe niż 50 μm średnicy. Korzystając z znanego pola widzenia, ekstrapoluj średnią całkowitą liczbę organoidów na odwiert od średniej liczby na pole, zakładając powierzchnię płyty 24 dołków wynoszącą 1,9 cm². UWAGA: Analizy te można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, takiego jak Fiji13.</li>
	<li>Średnią średnicę i powierzchnię organoidów można również zmierzyć, aby uzyskać ilościowe informacje o cechach wzrostu organoidów w hodowli.</li>
</ol>
3. Pobór trójwymiarowych organoidów nabłonkowych i fibroblastowych nadrostów nadrostowych
UWAGA: Wszystkie etapy pobierania organoidów powinny być wykonywane na lodzie.
<ol>
	<li>Po 21 dniach dojrzewania zasysaj supernatant i delikatnie przepłucz około 1-2 mL lodowatego PBS.</li>
	<li>Dodaj 1-2 mL zimnego roztworu do pozyskiwania organoidów i inkubuj płytkę w temperaturze 2-8 °C przez 30-90 minut przy umiarkowanym potrząsaniu. UWAGA: Zatrzymaj inkubację, gdy organoidy unoszą się na dnie studni.</li>
	<li>Monitoruj dysocjację za pomocą mikroskopii jasnego pola. Dysocjacja jest uznawana za zakończoną, gdy matryca podstawowa na dnie studni przestaje być widoczna, a organoidy znajdują się w zawieszeniu. Skrobak komórek może być użyty do delikatnego przesuwania hydrożelu matrycy organoid-podłoża, aby przyspieszyć proces.</li>
	<li>Zgromadzić zawartość wszystkich odwiertów w stożkowej rurce o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	<li>Wirować w 500 × g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Aspiruj supernatant, myj pellet organoidalny 1-2 mL lodowatego PBS, a następnie ponownie wiruj, aby uzyskać granulat. Aspiruj PBS.</li>
</ol>
4. Ustalenie organoidów trójwymiarowych osadzonych w kolagenie oraz zastosowanie mechanicznych odkształceń
UWAGA: Używaj okrągłych płyt hodowlanych z piankowymi kotwicami kompatybilnymi z bioreaktorem rozciągającym komórki. Płytka hodowla używana w tym protokole ma powierzchnię wzrostu ~6,6 cm2.
<ol>
	<li>Przygotuj działający roztwór żelu kolagenu I o stężeniu 2 mg/ml. Roztwór powinien zawierać 1× PBS, 11,4 mM NaOH oraz 2 mg/mL kolagenu I, a ostateczna objętość powinna być dostosowana za pomocą wody sterylnej. Przygotuj 2 ml tego roztworu kolagenu I na dołek okrągłej piankowej płytki z 6 dołkami.</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu kolagenu I 2 mg/mL do kotwic piankowych na obrzeżach płyty, zapewniając pełne nasycenie. UWAGA: Kotwy piankowe muszą być dokładnie nasączone roztworem kolagenu I, aby zapewnić prawidłową przyczepność. Niepełne nasycenie może prowadzić do odwarstwienia żelu kolagenowego podczas mechanicznej aplikacji, co prowadzi do zmniejszenia efektywnego odkształcenia w porównaniu do zamierzonego celu.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet organoidowy w 6 mL 2 mg/mL kolagenu z ogona szczura i pipetuj 1 mL zawiesiny do środka okrągłej płyty piankowej z 6 dołkami, zapewniając, że mieszanka kolagenu nasączona organoidami miesza się z początkowym kolagenem wolnym od organoidów dodanym do okrągłych kotwic piankowych. UWAGA: Unikaj generowania bąbelków przy dodawaniu zawiesiny organoidowej do każdego odwiertu.</li>
	<li>Polimeryzuj kolagen-I przez 1 godzinę, pozostawiając płytki w inkubatorze (37 °C, 5%CO2). Po polimeryzacji żel powinien wyglądać na mętny.</li>
	<li>Dodaj 2 mL kompletnego DMEM na organoidy A549/MRC5 z osadzonym w 3D kolagenem i zwróć płytkę do inkubatora na 24 godziny.</li>
	<li>Zamień podłoże hodowlane na DMEM + 1% FBS i inkubuj przez noc przed ekspozycją na odkształcenie mechaniczne.</li>
</ol>
5. Rozciąganie komórek w bioreaktorze i ekspozycja na naprężenia mechaniczne
<ol>
	<li>Wkładaj stacje załadunku do każdej studni płyty podstawowej. Zawierają one sześć słupów obciążających o średnicy 25 mm, które pozwalają na odkształcenie elastycznej błony płytek Tissue Train wokół nich i wystawienie hodowli 3D na naprężenia równoosiowe.</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę silikonowego smaru na górę słupków załadunkowych.</li>
	<li>Załóż czerwone uszczelki na dno każdej płytki z 6 dołkami.</li>
	<li>Włóż przygotowane płyty do płyty podstawowej na górze słupków załadunkowych.</li>
	<li>Przenieś to urządzenie do inkubatora nawilżonego o temperaturze 37 °C z zawartością 5%CO2 i podłączyć złączki szybkozłączne do płyty bazowej. Powtórz kroki od 5.1 do 5.6, pomijając połączenia, aby uzyskać kontrolę bez obciążeń. UWAGA: Opcjonalnie można zastosować zatyk uszczelniający rurkę, który zapobiega działaniu ciśnienia próżniowego na dnie pojedynczego odwiertu BioFlex, umożliwiając generowanie nienaprężonej kultury kontrolnej na tej samej płytce.</li>
	<li>Przykryj folią z pleksi i dodaj ~5-10 funtów ciężaru, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.</li>
	<li>Włącz sprężarkę powietrza i otwórz zawór wylotowy z kompresora.</li>
	<li>Włącz pompę ciśnieniową i otwórz zawór zbiornika ciśnieniowego podłączony do odpływu zbiornika próżniowego. Upewnij się, że ciśnienie podciśnienia wynosi około 90 kPa.</li>
	<li>Otwórz zawór dopływu powietrza ze sprężarki umieszczonej w pobliżu sterownika bioreaktora. Reguluj ciśnienie tak, aby nie przekraczało 15 PSI przy porcie wentylacyjnym.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie pokładowe i ustaw pożądane parametry cyklicznego odkształcenia mechanicznego. W tym badaniu zastosowano schemat o amplitudzie odkształcenia 18% przy 0,4 Hz przez 24 godziny. Aby to skonfigurować, stwórz nowy schemat, ustaw minimalne wydłużenie na 0%, maksymalne na 18% i rozpocznij protokół.</li>
	<li>Obserwuj płytę i błonę, aby upewnić się, że ruch jest widoczny przez całą sesję naprężania. Membrana powinna się deformować wokół słupów obciążeniowych.</li>
	<li>Regularnie sprawdzaj syfonę pod kątem wilgoci i obserwuj ekran komputera pod kątem czasu pracy, postępów oraz odpowiedniej morfologii schematu odszczepu.</li>
	<li>Po zakończeniu reżimu odkształcenia odłącz zespół płyty podstawowej i przywróć odcięte hodowle do inkubacji przez 24 godziny przed analizą charakteryzacji w dalszej fazie.</li>
	<li>Wyłącz i rozmontuj system w odwrotnej kolejności od rozruchu: zamknij lub wyłącz zawór dopływu sprężarki powietrza, następnie zawór zbiornika ciśnieniowego, pompę ciśnieniową, zawór wylotowy sprężarki powietrza, a na końcu sprężarkę powietrza, w tej kolejności.</li>
	<li>Pobierz supernatant po 24 godzinach inkubacji po ekspozycji na obciążenia mechaniczne. Przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
6. Morfologiczna charakterystyka organoidów za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Umyj model żelu organoidalno-kolagenowego trzy razy PBS, delikatnie dodając 1 ml PBS, inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie zasysaj PBS i powtórz proces mycia łącznie trzy razy.</li>
	<li>Ustalić model, inkubując 2 mL paradehydu 4% przez godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myj modele trzy razy PBS, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby delikatnie przeciąć okrągłe piankowe kotwy w elastycznych wejściach z żelem kolagenowym i umieść je w szalce Petriego.</li>
	<li>Przepuszczają organoidy, inkubując z 2 mL 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myj modele trzy razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Blokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując modele 3 mL 5% albuminy surowicy bydłej (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń środek blokujący i przejdź do kolejnego kroku.</li>
	<li>Modele inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z koktajlem barwniczym zawierającym antyludzką zonula occludens-1 (ZO-1) sprzężoną z Alexa Fluor 594 w rozcieńczeniu 1:100, falloidyną sprzężoną z Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu 1:1000 w celu oceny F-aktyny oraz barwieniem jądrowym DAPI w rozcieńczeniu 1:4000. Rozcieńczalnik to 1 mL 1% BSA w PBS. Krawędzie płytki przyklej taśmą przed inkubacją w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zasysaj roztwór koktajlu barwiącego i myj modele trzy razy PBS.</li>
	<li>Obrazuj mikroskopem konfokalnym i wykonuj stosy Z o długości 5 μm reprezentatywnych organoidów przy powiększeniu obiektywnym 40x.</li>
	<li>Analizuj intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do analizy obrazów Fiji. Normalizuj średnią intensywność fluorescencji z powierzchnią organoidu, aby zapewnić dokładne porównanie w różnych warunkach środowiskowych.</li>
</ol>
7. Funkcjonalna charakterystyka organoidów za pomocą testu ELISA i cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
<ol>
	<li>Rozmroz supernatanty na lodzie i oceniaj wydzielanie interleukiny-6 (IL-6) oraz interleukiny-8 (IL-8) za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów ELISA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Ocena uwalniania LDH, markera cytotoksyczności, za pomocą komercyjnie dostępnego testu absorpcji LDH.</li>
	<li>Generuj standardową krzywą przy użyciu rekombinowanego białka LDH w stężeniach półlogaritmowych od 0,5 μg do 0,5 ng. Interpoluj stężenia LDH z każdej próbki za pomocą krzywej standardowej.</li>
</ol>
8. Opcjonalnie: Izolacja próbek do analiz RNA lub białek
<ol>
	<li>Zamiast dodawać 4% paraformaldehydu do barwienia immunofluorescencyjnego, dodaj przygotowany bufor RLT zawierający β-merkaptoetanol w ilości 10 μL na 1 mL RLT.</li>
	<li>Użyj 300 μL na model i pipetuj w górę i w dół, aby całkowicie odłączyć i zlikwidować komórki.</li>
	<li>Przelej lizat do mikrowirówki wolnej od RNazy i umieść rurki na suchym lodzie, aby szybko zamroziły. Przenieś do -80 °C na długoterminowe przechowywanie. UWAGA: Alternatywnie można użyć buforu RIPA do ekstrakcji białka, przygotowując: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40 lub Triton X-100; 0,5% deoksycholatan sodu; 0,1% SDS w wodzie zdejonizowanej. Dostępny jest również gotowy bufor RIPA.</li>
	<li>Dodaj 200 μL na model, kamień na lodzie przez 5 minut, a następnie pobierz lizat.</li>
	<li>Rotuj w 15 000 x g przez 10 minut w 4 °C, aby uzyskać zanieczyszczenia z pelletami, a następnie przenieść do -80 °C do długoterminowego przechowywania.</li>
</ol>

<ol><li>Knudsen, L., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micromechanics+of+lung+alveoli%3A+structure+and+function+of+surfactant+and+tissue+components%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The micromechanics of lung alveoli: structure and function of surfactant and tissue components.</a> Histochem Cell Biol. 150 (6), 661-676 (2018).</li>
<li>Novak, C., Ballinger, M. N., Ghadiali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+pulmonary+diseases%3A+a+review+of+engineering+tools+to+understand+lung+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of pulmonary diseases: a review of engineering tools to understand lung mechanotransduction.</a> J Biomech Eng. 143 (11), 110801(2021).</li>
<li>Shiraishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+forces+mediated+by+respiration+maintain+lung+alveolar+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate.</a> Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).</li>
<li>Hogg, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+small-airway+obstruction+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 350 (26), 2645-2653 (2004).</li>
<li>Bidan, C. M., Veldsink, A. C., Meurs, H., Gosens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+and+extracellular+matrix+mechanics+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Airway and extracellular matrix mechanics in COPD.</a> Front Physiol. 6, 346(2015).</li>
<li>Burgess, J. K., Gosens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+extracellular+matrix%3A+key+drivers+of+lung+pathologies+and+drug+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the extracellular matrix: key drivers of lung pathologies and drug responsiveness.</a> Biochem Pharmacol. 228, 116255(2024).</li>
<li>Harris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+investigation+of+the+inflammatory+response+to+the+strain+amplitudes+which+occur+during+high+frequency+oscillation+ventilation+and+conventional+mechanical+ventilation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">An in vitro investigation of the inflammatory response to the strain amplitudes which occur during high frequency oscillation ventilation and conventional mechanical ventilation.</a> J Biomech. 88, 186-189 (2019).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+analysis+in+patients+at+high+risk+for+COPD+using+four-dimensional+dynamic-ventilation+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Chron+Obstruct+Pulmon+Dis%22%5BJournal%5D)">Strain analysis in patients at high risk for COPD using four-dimensional dynamic-ventilation CT.</a> Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 17, 1121-1130 (2022).</li>
<li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li>
<li>Al Yazeedi, S., Guo, T. J. F., Sohd, J., Abokor, F. A., Osei, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+stimulation+of+alveolar+epithelial-fibroblast+models+using+the+Flexcell+tension+system+to+study+lung+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical stimulation of alveolar epithelial-fibroblast models using the Flexcell tension system to study lung disease mechanisms.</a> Front Med. 12, 1552803(2025).</li>
<li>Guo, T. J. F., Faiz, A., Osei, E. T., Pouwels, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Next+generation+in+vitro+models+to+study+chronic+pulmonary+diseases%2C+volume+II%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Editorial: Next generation in vitro models to study chronic pulmonary diseases, volume II.</a> Front Med. 12, 1683514(2025).</li>
<li>Lim, M. J., Kim, S. J., Jo, A., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+application+potential+of+alveolar+organoids+through+epithelial+and+niche+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Enhanced application potential of alveolar organoids through epithelial and niche cell interactions.</a> Sci Rep. 15 (1), 17538(2025).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Purev, E., Bahmed, K., Kosmider, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+organoids+in+lung+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Alveolar organoids in lung disease modeling.</a> Biomolecules. 14 (1), 115(2024).</li>
<li>Manuyakorn, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+causes+adaptive+change+in+bronchial+fibroblasts+enhancing+profibrotic+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain causes adaptive change in bronchial fibroblasts enhancing profibrotic and inflammatory responses.</a> PLoS One. 11 (4), e0153926(2016).</li>
<li>Kılıç, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+induce+an+asthma+gene+signature+in+healthy+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces induce an asthma gene signature in healthy airway epithelial cells.</a> Sci Rep. 10 (1), 966(2020).</li>
<li>Tam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+as+a+therapeutic+target+for+airway+remodeling+and+inflammation+in+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling as a therapeutic target for airway remodeling and inflammation in allergic asthma.</a> Cells. 11 (19), 3016(2022).</li>
<li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function%3A+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> J Allergy Clin Immunol. 134 (3), 509-520 (2014).</li>
<li>Ivanov, A. I., Parkos, C. A., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+regulation+of+epithelial+barrier+function+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal regulation of epithelial barrier function during inflammation.</a> Am J Pathol. 177 (2), 512-524 (2010).</li>
<li>Barnett, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial-immune+circuit+amplifies+inflammasome+and+IL-6+responses+to+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">An epithelial-immune circuit amplifies inflammasome and IL-6 responses to SARS-CoV-2.</a> Cell Host Microbe. 31 (2), 243-259.e6 (2023).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF-induced+IL-8+secretion+from+airway+epithelium+leads+to+lung+fibroblast+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulm+Med%22%5BJournal%5D)">HB-EGF-induced IL-8 secretion from airway epithelium leads to lung fibroblast proliferation and migration.</a> BMC Pulm Med. 21 (1), 347(2021).</li>
<li>Guo, T. J. F., Singhera, G. K., Leung, J. M., Dorscheid, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial-derived+immune+mediators+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial-derived immune mediators in COVID-19.</a> Viruses. 15 (8), 1655(2023).</li>
<li>Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+engineered+organoids+for+cardiovascular+models%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular and engineered organoids for cardiovascular models.</a> Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).</li>
<li>Li, K., He, Y., Jin, X., Jin, K., Qian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+extracellular+matrices+for+tumor+organoid+culture%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Reproducible extracellular matrices for tumor organoid culture: challenges and opportunities.</a> J Transl Med. 23 (1), 497(2025).</li>
<li>Vande Geest, J. P., Di Martino, E. S., Vorp, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+complete+strain+field+within+Flexercell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes.</a> J Biomech. 37 (12), 1923-1928 (2004).</li>
<li>Mondoñedo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Front Physiol. 11, 566(2020).</li>
</ol>

Autorzy twierdzą, że badania przeprowadzono w braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.

Trójwymiarowe (3D) organoidy nabłonkowo-włókniowe nadrostowe stanowią wysoce fizjologicznie istotną platformę do modelowania struktury i funkcjonowania płuc pod obciążeniem mechanicznym. W przeciwieństwie do systemów współkultury 2D czy nawet 3D, organoidy zachowują kluczowe cechy mikrośrodowiska płuc in vivo, w tym organizację przestrzenną, przekrzyki nabłonkowo-mezenchymalneoraz interakcje macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Obciążenie mechaniczne odgrywa kluczową rolę w przebudowie dróg...

<a href="https://app.jove.com/t/6700">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/69447">10.3791/69447</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/69447">Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor</a>.&#160;

Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor

Pęcherzyki płucne to pęcherzyki końcowe układu oddechowego i służą jako główne miejsce wymiany gazów. Składają się głównie z komórek nabłonkowych typu I i II, odpowiedzialnych za wymianę gazów, funkcje odpornościowe i utrzymanie integralności strukturalnej, oraz fibroblastów w ścianach, które utrzymują homeostazę macierzy zewnątrzkomórkowej1. Te i inne komórki rezydentne są nieustannie narażone na cykliczne rozciągnięcie i naprężenia ścinające podczas oddychania2. Takie mechaniczne sygnały są przekształcane w sygnały biochemiczne, które wpływają na strukturę komórek, różnicowanie i komunikację3.
Patologiczne obciążenie mechaniczne obserwuje się w chorobach płuc, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP). POChP to postępujące schorzenie charakteryzujące się niszczeniem mięślicha, przewlekłym stanem zapalnym oraz zwężeniem małych dróg oddechowych4. W tej chorobie zniszczenie ścian pęcherzyków włosowych, utrata elastyny, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) prowadząca do włóknienia oraz przewlekłe zapalenie wspólnie upośledzają zdolność płuc do wytrzymania uszkodzeń strukturalnych 5,6. Skutkuje to heterogenicznymi i nieprawidłowymi deformacjami pęcherzyków zębowych podczas oddychania, które dodatkowo nasilają się podczas zaostrzeń choroby 7,8.
Chociaż do badania biologii pęcherzyka pęcherzykowego stosowano kilka metod in vitro, każda z nich ma istotne ograniczenia. Systemy współhodowli 2D ułatwiają badanie interakcji między komórkami, ale nie rejestrują architektury tkanek ani dynamiki macierzy zewnątrzkomórkowej, co zmniejsza znaczenie fizjologiczne. Statyczne kultury 3D lepiej zachowują strukturę i interakcje macierzowe, jednak nie uwzględniają dynamicznych wskazówek mechanicznych obecnych in vivo. Platformy mikrofluidyczne i organ-on-chip mogą naśladować przepływ płynów i naprężenia mechaniczne, zapewniając wysoką wierność fizjologiczną, ale często są technicznie skomplikowane, o niskiej przepustowości i kosztowne9. Dla kontrastu, trójwymiarowy model organoidów mechanicznie obciążonych tutaj łączy złożoność strukturalną, heterogeniczność komórkową oraz kontrolowaną stymulację mechaniczną – aspekt często pomijany w istniejących modelach, w ramach powtarzalnej, skalowalnej platformy, która oferuje równowagę między istotnością fizjologiczną a dostępnością eksperymentalną10,11.
Aby zrozumieć złożone mechanizmy przyczyniające się do chorób takich jak POChP oraz odkryć cele terapeutyczne, opracowano modele chorobowe. Pomimo swojego znaczenia, naprężenia mechaniczne są często pomijane w modelach in vitro alveolarnych stosowanych do badania mechanizmów i patogenezy chorób płuc, takich jak POChP. Aby wypełnić tę lukę, przedstawiamy metodę hodowania organoidów nadbłonkowych pęcherzyków w matrycy podstawowej, pobierania i osadzania w 3D żelach kolagenowych, stosowania cyklicznego naprężenia mechanicznego za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki oraz oceny kluczowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych. Te trójwymiarowe modele mechanicznych organoidów lepiej rejestrują interakcje komórkowe oraz mikrośrodowisko ludzkiej niszy pęcherzyka płucnego, umożliwiając badanie przesłuchu między nabłonkiem a mezenchymalnym12.
Bioreaktor stosuje odkształcenie równoosiowe z konfigurowalnymi parametrami, pozwalając na wydłużenie do 30% i częstotliwości do 5 Hz do modelowania zarówno warunków fizjologicznych, jak i patologicznych. W tym badaniu stworzyliśmy modele organoidów osadzonych w hydrożelach kolagenu-I, poddawanych 18% naprężeniom przy 0,4 Hz przez 24 godziny, aby naśladować patologiczne oddychanie. Ustanowiliśmy ustandaryzowany workflow charakteryzacji, który obejmuje immunobarwienie dla markerów specyficznych dla komórek oraz immunotesty do ilościowego uwalniania mediatorów immunologicznych po przeciężeniu mechanicznym. Celem tego badania jest zapewnienie fizjologicznie istotnej, przyjaznej dla użytkownika i elastycznej platformy do badania biologii pęcherzyków płucnych pod obciążeniem mechanicznym.

<table><tbody><tr><td>Rurka mikrowirówki o pojemności 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>15 mL stożkowa lampa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mL stożkowa rurka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa (elastyczna membrana) Tissue Train okrągła płyta piankowa</td><td>Flexcell International</td><td>TTCF-5001</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa A549</td><td>Amerykańska Kolekcja Kultury Typowej (ATCC)</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Sprężarka powietrza</td><td>California Air Tools</td><td>10020DSPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do zbierania organoidów Cultrex</td><td>Bio-Techne</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów cytotoksyczności LDH CyQUANT LDH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C20300</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenylindol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylsulfoksyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' zmodyfikowanego Eagle' s medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop EVOS XL Core</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1200</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5209501</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazów Fidżi</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Flexcell FX-6000 Tension and Tissue Train (zawiera kontroler napięcia Flexlink FX-6000, zbiornik ciśnieniowy, płytę podstawową, akrylowe okno, cylindryczne stacje załadunkowe o średnicy 25 mm, syfon, oprogramowanie FlexSoft FX-6000 V1.0 oraz różne rurki)</td><td>Flexcell International</td><td>FX6000T</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka interleukina-6 Duoset ELISA</td><td>Bio-Techne</td><td>DY206</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka interleukina-8 Duoset ELISA</td><td>Bio-Techne</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td>11889122</td><td></td></tr><tr><td>Matryca bazalna membrana matrigelowa</td><td>Corning</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (Pen/Streptokok)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sondy znakujące falloidynę, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen ogonowy szczura I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko dehydrogenazy mleczanowej (aktywne)</td><td>Abcam</td><td>Ab93699</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizy RIPA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofugeowe rurki wolne od RNazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>T75 cm2 kolba kulturowa T75 cmsup</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339194</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych a549/mrc-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor

Chociaż dynamika oddychania i obciążenie mechaniczne odgrywają kluczową rolę w biologii pęcherzyków płucnych, ich wkład w patogenezę chorób układu oddechowego jest często pomijany. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy model organoidów, w którym organoidy nabłonkowo-włókniowe śródrostkowe są poddawane kontrolowanemu obciążeniu mechanicznemu za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki. Ta platforma odtwarza przestrzenną organizację i wielokomórkową złożoność tkanki pęcherzykowej oraz umożliwia badania nad tym, jak komunikacja między komórkami i mechanotransdukcja wpływają na strukturę i funkcjonowanie tkanek w zdrowiu i chorobie. W tym protokole opisujemy metody generowania i hodowli organoidów nabłonkowych i fibroblastowych z wykorzystaniem linii komórkowych nabłonka śródpęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 w hydrożelu z błoną podstawną i macierzą zewnątrzkomórkową. Następnie organoidy są nieenzymatycznie izolowane i osadzane w żelach kolagenowych 3D na wyspecjalizowanych płytkach bioreaktora. Przedstawiamy procedury stosowania naprężenia równoosiowego, aby naśladować patologiczne wzorce oddychania obserwowane podczas zaostrzeń układu oddechowego. Na koniec przedstawiamy standardowy proces charakteryzacji, w tym immunobarwienie dla markerów specyficznych dla komórek oraz immunoanalizy profilujące uwalnianie mediatorów immunologicznych. Razem te analizy wspierają ocenę struktury i funkcji organoidów. Protokół ten zapewnia przyjazną użytkownikowi, powtarzalną i adaptowalną platformę do badania biologii pęcherzyków w warunkach mechanicznego obciążenia, z łatwo modyfikowalnymi parametrami, aby spełnić różnorodne cele eksperymentalne i rozwijać badania nad mechanizmami chorób płuc.

Ustanowiono i hodowano przez ponad 21 dni organoidy nabłonka pęcherzykowego i fibroblastów pochodzące z linii komórkowych. W tym czasie obserwowano zmiany morfologiczne, a liczbę, powierzchnię i średnicę organoidów oceniano w dniach 3., 9. i 21., aby monitorować ich wzrost i rozwój. Średnia liczba organoidów na studzienkę uległa znacznemu zmniejszeniu w dniach 9. i 21. w porównaniu z dniem 3. (Rycina 2A). W przeciwieństwie do tego, średnia powierzchnia i średnica organoidów znacznie zwiększy...

Protokół ten określa generowanie organoidów z komórek nabłonka pęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 na rusztowaniu hydrożelowym z macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie osadzenie w żelach kolagenowych 3D oraz ekspozycję na mechaniczne obciążenia za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki do badania mechanobiologii pęcherzykowej.

Generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych A549/MRC-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

Although breathing dynamics and mechanical strain play critical roles in alveolar biology, their contributions to the pathogenesis of respiratory diseases ...

generation-3d-collagen-embedded-a549mrc-5-alveolar-organoids-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Ten protokół przedstawia metodę hodowli i 3D hodowli komórek podobnych do ameloblastów w mikrograwitacji, aby zachować ich wydłużony i spolaryzowany kształt, a także ekspresję białek specyficzną dla szkliwa. Opisano również warunki hodowli konstruktów inżynierii przyzębia i narządów płuc w warunkach mikrograwitacji.

Rozmnażanie komórek i narządów zębów i dróg oddechowych w mikrograwitacji

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.

Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

University of British Columbia - Okanagan.  This protocol outlines the generation of organoids from A549 alveolar epithelial cells and MRC-5 lung fibroblasts on an extracellular matrix hydrogel scaffold, followed by embedding in 3D collagen gels and exposure to mechanical strain using a cell-stretching bioreactor to investigate alveolar mechanobiology.

Generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych A549/MRC-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

Przeglądaj więcej filmów