Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy

Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania permeabolizacji błony lizosomalnej podczas nekrotozy, wykorzystując sondy fluorescencyjne, które wykrywają zmiany integralności błony lizosomalnej oraz zakwaszenie. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest scharakteryzowanie dynamiki uszkodzenia organelli podczas procesu śmierci komórkowej oraz precyzyjne określenie, jak to uszkodzenie powinno powodować lub przyczyniać się do śmierci komórek. Na początek należy umieścić 5 000 komórek w dwóch mililitrach podłoża DMEM z antybiotykami do sterylnej misy o szklanym dnie.

Umieść naczynie w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i inkubuj komórki przez noc. Dodaj 20 mikrolitrów zielonych kulek dextran do 25 mikrogramów na mililitr w świeżym, antybiotykowym medium DMEM, aby je rozcieńczyć. Usuń stare medium z naczynia i zastąp je dwoma mililitrami medium zawierającego wołowinę z dodatkiem DMEM.

Włóż naczynie do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i inkubuj przez 24 godziny, aby umożliwić internalizację koralików w lizosomach. Następnie dodaj dwa mikrolitry jednego milimolowego roztworu LysoTracker do dwóch mililitrów świeżego medium DMEM. Wymień stare medium na ten roztwór do bejczenia.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny. Włącz komponenty systemu konfokalnego, włączając komputer osobisty, mikroskop, zasilanie skanera, zasilanie lasera, emisję laserową oraz zasilanie Leica. Włącz sterowanie środowiskowe, w tym regulator temperatury, zwany Cube, oraz kontroler mieszanki dwutlenku węgla, zwany Brick.

Otwórz dopływ dwutlenku węgla i tlenu. Ustaw regulator temperatury na 37 stopni Celsjusza. Ustaw regulator gazu i wilgotności na 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności.

Złóż komorę obrazowania. Po barwieniu umyj komórki trzy razy dwoma mililitrami PBS, a następnie dodaj dwa mililitry świeżo uzupełnionego medium DMEM. Nałóż olejek immersyjny na obiektyw przed zdjęciem.

Zamontuj antenę na scenie mikroskopu. Reguluj intensywność lasera do 3%, ale nie więcej niż 5%. Następnie dostosuj wzmocnienie detektora w oprogramowaniu mikroskopu, aby zoptymalizować sygnał. Zminimalizuj tło, regulując pasek kontrastu.

Zrób zdjęcia bazowe nieleczonych komórek, które stanowią warunek kontrolny. Wróć płytkę do maski laminarnej i dodaj jeden mililitr antybiotyku DMEM, uzupełniony induktorami śmierci komórek. W oprogramowaniu do akwizycji ustaw tryb na XYT, format na 512 na 512, prędkość na 400, zoom na trzy, średnią linii na jeden, gromadzenie linii na trzy, gromadzenie klatek na jeden, interwał czasu na trzy minuty, czas trwania na osiem godzin oraz włącz autofokus.

Kliknij start, aby rozpocząć akwizycję w czasie poklatkowym. Wstępne badania obrazowe potwierdziły obecność stabilnych punktów LysoTracker oraz fluoresceinowego znakowanego dekstranu, wskazując na nienaruszone lizosomy przed leczeniem. Cztery godziny po leczeniu TSZ fluorescencja LyoTracker była wyraźnie zmniejszona, podczas gdy dekstran zaczął wykazywać rozproszony rozkład cytosolowy, co wskazuje na początkową permeabilizację błony lizosomalnej.

Osiem godzin po leczeniu sygnał LysoTracker niemal całkowicie zniknął, podczas gdy wiele komórek zachowało zielony dekstern puncta z rozproszonym zielonym sygnałem cytosolowym. Wykazujemy, że permeabolizację błony lizosomalnej można bezpośrednio zobrazować w żywej komórce poddawającej indukcji nekrototycznej. Protokół ten pokazuje, że połączenie LysoTracker i kulek dektranowych umożliwia jednoczesne monitorowanie pH lizosomu i uwalniania ładunku w czasie rzeczywistym.

Ważnym dla rozwoju tego protokołu obrazowania komórek żywych jest jego zdolność do monitorowania niewielkich zmian pH i przepuszczalności błony lizosomalnej w czasie rzeczywistym, rejestrując dynamiczne zdarzenia, które są pomijane przez analizę końcową, taką jak cytometria przepływowa i barwienie monowarstwowe.