Name: Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów przy użyciu myszy reportera CD63-GFP. Technika ta umożliwia badanie komunikacji komórkowej w tkance tłuszczowej in vivo i in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Einstein Flow Cytometry Core za FACS oraz Analytical Imaging Facility za całą analizę obrazów. Prace te były częściowo wspierane przez granty National Institutes of Health DK128839 oraz grant wsparcia centrów onkologicznych NCI P30CA013330.

Zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt Albert Einstein College of Medicine, samce myszy były grupowo trzymane w temperaturze 22 °C przy wilgotności względnej 30-70% w cyklu światła i 12 godzin ciemności, zapewniano im bezwarunkowy dostęp do jedzenia i wody oraz utrzymywano na tle C57BL/6J.
1. Wykrywanie in vivo wydzielanych AdEV poprzez wychwyt przez APC
<ol>
	<li>Przygotowanie bufora<ol>
		<li>Bufor trawienia: Przygotuj DMEM buforowany HEPES, dodając 0,5 mL 1 M HEPES oraz 0,5 g ubogiej kwasów tłuszczowych w surowicę bydłą albuminę (BSA) do 50 mL DMEM. Mieszaj, aż się rozpuści.</li>
		<li>Bufor do płukania: Przygotuj PBS z 2,5 mM kwasu etylendiaminetetraoctowego (EDTA) oraz 4% surowicy płodowej bydła (FBS).</li>
		<li>Przygotuj Liberazę i DNazę 1 w dawce 5 mg/mL i 5 KU/mL. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrażać tuż przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie tkanki tłuszczowej pachwinowej i trawienie UWAGA: Czteromiesięczne myszy kontrolne AdipCD63-GFP i CD63-GFP zostały uśpione poprzez inhalację dwutlenkiem węgla. Przed izolacją APC, uśpione myszy umieszczano w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.<ol>
		<li>Usuń tkanki tłuszczowe techniką sterylną i umieść 1 g tkanki w 0,5 mL buforu trawiennego, a tkaczkę drobno zmiełknij sterylnymi nożyczkami na kawałki nie większe niż 1 mm.</li>
		<li>Zawiesić posiekaną tkankę w 10 mL strawionego buforu zawierającego 0,5 mg/mL liberazy i 50 U/mL DNazy 1.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze 37 °C na orbitalnym shakerze (100 obr./min) przez 30-60 minut. Delikatnie mieszaj tkankę, odwracając rurkę kilka razy podczas inkubacji. Gdy roztwór wydaje się mętny i nie pozostaną widoczne fragmenty tkanek, trawienie uważa się za zakończone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja transporterów opancerzonych<ol>
		<li>Rozcieńcz zawiesinę dwoma objętościami bufora trawienia i delikatnie odwróć rurkę 3-4 razy.</li>
		<li>Przepuszczenie przez sterylny filtr o średnicy 100 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę.</li>
		<li>Wiruj filtrat w 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń część adipocytu supernatantowego i oznacz pellet jako frakcję naczyniową stromalną (SVF).</li>
		<li>Przygotuj świeży bufor lizy 1× czerwonych krwinek (RBC) z wodą sterylną. Rozwinij czerwone krwinki w SVF, inkubując je na lodzie przez 5 minut, chronione przed światłem.</li>
		<li>Dodaj dwie objętości buforu do prania, następnie filtruj w wirówce o stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Stosuj się do protokołu izolacyjnego zestawu progenitora tkanki tłuszczowej (mysz), ponownie zawiesij SVF w buforze 80 μLof (PBS, pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) na gram tkanki.</li>
		<li>Dodaj 20 μL koktajlu nie-adipocytowego protedenatora na gram tkanki.</li>
		<li>Wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C w ciemności.</li>
		<li>Przepuścić próbkę przez kolumnę LS i pobrać przepływ.</li>
		<li>Wiruj przepływ (ujemny dla CD31, CD45, Ter119) w dawce 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać APC do badania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie wydzielanych AdEV za pomocą APC za pomocą mikroskopii konfokalnej<ol>
		<li>Zasiewaj 250 μL izolowanych APC (1 × 104 komórek /mL) z myszy AdipCD63-GFP lub CD63-GFP na szkiełka z komorą 8 dołków pokrytą kolagenem i pozwól komórkom na przyłączenie się przez około 6 godzin.</li>
		<li>Utrwal komórki 4% paradehydem przez 10 minut, aby zachować struktury komórkowe i EV do obrazowania. UWAGA: W tych testach sygnały GFP oznaczają AdEV, a ich wykrywanie w APC za pomocą mikroskopii konfokalnej wskazuje na wychwyt AdEV przez te komórki progenitorowe.</li>
		<li>Przemyj slajdy trzykrotnie PBS, zamontuj za pomocą medium antyfade i rejestruj sygnały GFP za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy o średnicy 63×. Uzyskuj obrazy jako zestawy serii z krokiem 0,5 μm, używając lasera 488 nm do wzbudzania GFP i wykrywania emisji na 500-550 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie wydzielanych AdEV poprzez wychwyt APC za pomocą cytometrii przepływowej<ol>
		<li>Licz APC i rozcieńczaj barwnik żywotności (np. Zombie) 1:1000 w 1X PBS. Zawiesz komórki w stężeniu 1× 106 na 100 μL. Inkubuj przez 20 minut na lodzie, chroniony przed światłem.</li>
		<li>Przemyj komórki raz buforem do mycia. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.</li>
		<li>Zawiesz komórki w buforze barwiącym o stężeniu 1× 106 na 100 μL.</li>
		<li>Blokuj niespecyficzne wiązanie odczynnikiem blokującym receptory Fc (np. anty-CD16/CD32) w stosunku 1:100 na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Przeciwciało Sca-1 przed spinowaniem w dawce 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj 1 μL przeciwciała Sca-1 do rurki APC i inkubuj przez 20 minut na lodzie, pozostawiając rurkę przykrytą folią.</li>
		<li>Myj dwa razy z 1 ml buforu do mycia, wiruj w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.</li>
		<li>Zawiesz komórki w buforze płukania w temperaturze około 1 × 106 komórek na 500 μL do sortowania cytometrii przepływowej. Pobierz dane dla komórek Sca1+ i GFP+ na cytometrze przepływowym spektralnym wyposażonym w laser fioletowy 405 nm (filtr 450/50 nm dla Pacific Blue) oraz laser 488 nm niebieski (filtr 530/30 nm dla GFP). Przeanalizuj próbki za pomocą działającego oprogramowania instrumentu, z zamkniętymi komórkami Sca1+ oraz analizowanym podzbiorem GFP+ w tej populacji, jak pokazano na Rysunku 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie i analiza wydzielanych AdEV in vitro
<ol>
	<li>Różnicowanie APC do dojrzałych adipocytów UWAGA: Wszystkie hodowle są utrzymywane w temperaturze 37 °C, 8%CO2 , chyba że zaznaczono inaczej.<ol>
		<li>Dzień 0: Pokrywać naczynia żelatyną 0,2% przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), aspirować i nasionować świeżo wyizolowane APC w DMEM/F12 + 15% FBS + 1% penicylina/streptomycyna (P/S) + 0,1% Primocyna, aby osiągnąć 100% konfluencję przed różnicowaniem.</li>
		<li>Dzień 1-8: Zastąpienie pożywką różniczkową MesenCult adipogeniczną (łącznie 50 mL: 45 mL zasad + 5 mL suplementu + 0,5 mL GlutaMAX + 50 μL Primocin), zmiana na świeżą podłoże różnicujące w dniu 4.</li>
		<li>Dzień 9: Dwukrotnie myj adipocyty PBS, następnie zastępuj je dojrzałym podłożem hodowlowym (DMEM +1% BSA + 0,2% Primocin) i utrzymuj przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i oczyszczanie AdEV<ol>
		<li>Przepuścić powyżej hodowlę adipocytów wygenerowaną powyżej 15 mL, najpierw przez filtr 40 μm, a następnie przez filtr 30 μm.</li>
		<li>Wiruj filtrat w 500 × g przez 5 minut, a następnie 2 000 × g przez 10 minut, aby usunąć pozostałości komórek i zanieczyszczenia.</li>
		<li>Przepuszcz filtrat przez filtr 0,8 μm, a następnie koncentruj medium z 15 mL do 0,5 mL za pomocą jednostki ultrafiltracji odciętej 100 kDa (objętość próbki 15 mL) poprzez wirowanie w 4 000 × g przez 15 minut.</li>
		<li>Załaduj próbkę do kolumn chromatografii wykluczenia rozmiaru (SEC) z automatycznym kolektorem frakcji i zbieraj frakcje F1-8.</li>
		<li>Skoncentruj zebrane frakcje EV za pomocą jednostki ultrafiltracji odciętej 100 kDa (objętość próbki 4 mL) i przystąpi do weryfikacji zawartości EV w każdej frakcji za pomocą western blota, instrumentu do analizy śledzenia nanocząsteczek oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja, ilościowość i ocena rozmiaru/morfologii AdEV<ol>
		<li>Analiza zachodnich plam markerów EV<ol>
			<li>Każdą frakcję skoncentruj w zakresie od 400 μL do 25 μL, następnie dodaj 50 μL buforu radioimmunoprecipitacyjnego (RIPA) z dodatkiem inhibitorów proteazy i fosfatazy. Denaturuj próbki, dodając bufor ładowający 2× siarczanu dodecylosiarczanu sodu (SDS) i rozpuszczając białka na żelu triglicynowym o stężeniu 4-12%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza wielkości, koncentracji i jakości EV za pomocą instrumentu do śledzenia nanocząstek.<ol>
			<li>Przed analizą rozcieńcz próbki EV sterylnym, 0,1 μm filtrowanym PBS w stosunku 1:1000, zapewniając stężenie cząstek w optymalnym zakresie detekcji (około 107-10 9 cząstek/mL). Delikatnie mieszaj rozcieńczone próbki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.</li>
			<li>Załadować próbkę do instrumentu wyposażonego w wysokoczułą naukową kamerę komplementarno-metalowo-tlenkową (sCMOS), zielony moduł laserowy o średnicy 532 nm oraz próg detekcji 10 nm (do 1 000 nm) / 106 do 109 cząstek/mL.</li>
			<li>Wykonaj obrazowanie i ilościowanie za pomocą pakietu oprogramowania NS Xplorer, który stosuje dynamiczny algorytm obserwacji objętościowej oparty na stężeniach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Badanie morfologii EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)<ol>
			<li>Przekazać 50 μL EV, zebranych przed stężeniem, do centralnego obiektu do negatywnego barwienia EV. Stosuj EV do miedzianych siatek o grubości 400 meet wyłącznie o węglu, które zostały oczyszczone plazmowo środkiem czyszczącym.</li>
			<li>Po krótkim adsorbcyjnym przepłukaniu kratki wodą destylowaną, negatywnie zabarw 1% (w/v) octanu uranilu i usuń nadmiar bejcy papierem filtracyjnym przed suszeniem na powietrzu. Następnie obrazuj siatki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego z częstotliwością 120 KV.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Informacje o bezpieczeństwie i odpadach
<ol>
	<li>Obchodz się z paraformaldehydem i octanem uranilu w okapu z użyciem środków ochrony osobistej (PPE), ponieważ oba są toksyczne. Zbieraj odpady octanu uranylu w oznaczonych pojemnikach na niebezpieczne środki.</li>
	<li>Traktować wszystkie próbki biologiczne jako potencjalnie zakaźne i usuwać materiały zgodnie z instytucjonalnymi politykami i protokołami bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC).</li>
</ol>

<ol><li>Kershaw, E. E., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+as+an+endocrine+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue as an endocrine organ.</a> J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Luo, L., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in control of metabolism.</a> J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).</li>
<li>Lynes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cold-induced+lipokine+12%2C13-diHOME+promotes+fatty+acid+transport+into+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue.</a> Nat Med. 23, 631-637 (2017).</li>
<li>Sakers, A., De Siqueira, M. K., Seale, P., Villanueva, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-tissue+plasticity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adipose-tissue plasticity in health and disease.</a> Cell. 185 (3), 419-446 (2022).</li>
<li>Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+action+in+adipocytes%2C+adipose+remodeling%2C+and+systemic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects.</a> Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).</li>
<li>Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+resistance+related+to+white%2C+beige%2C+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin resistance related to white, beige, and brown adipocytes.</a> Mol Metab. 34, 27-42 (2020).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840-846 (2006).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP23+regulates+BAX-dependent+adipocyte+programmed+cell+death+independently+of+canonical+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">SNAP23 regulates BAX-dependent adipocyte programmed cell death independently of canonical macroautophagy.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3941-3956 (2018).</li>
<li>Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+in+inflammation+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipokines in inflammation and metabolic disease.</a> Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372, 425-432 (1994).</li>
<li>Scherer, P. E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum+protein+similar+to+C1q%2C+produced+exclusively+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes.</a> J Biol Chem. 270 (45), 26746-26749 (1995).</li>
<li>Considine, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoreactive-leptin+concentrations+in+normal-weight+and+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans.</a> N Engl J Med. 334, 292-295 (1996).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha%3A+Direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li>
<li>Steppan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hormone+resistin+links+obesity+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The hormone resistin links obesity to diabetes.</a> Nature. 409, 307-312 (2001).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+retinol+binding+protein+4+contributes+to+insulin+resistance+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes.</a> Nature. 436, 356-362 (2005).</li>
<li>Tilg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+Masterminds+of+metabolic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: Masterminds of metabolic inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 25, 250-265 (2025).</li>
<li>Clemente-Suarez, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adipokines+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The role of adipokines in health and disease.</a> Biomedicines. 11 (5), 1290(2023).</li>
<li>Hallal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+extracellular+vesicle+surface+for+clinical+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Understanding the extracellular vesicle surface for clinical molecular biology.</a> J Extracell Vesicles. 11 (10), e12260(2022).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28MISEV2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Le Lay, S., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+adipose+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+inter-organ+crosstalk%3A+Implications+for+metabolic+regulation+and+adipose+tissue+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring adipose tissue-derived extracellular vesicles in inter-organ crosstalk: Implications for metabolic regulation and adipose tissue function.</a> Cell Rep. 44 (6), 115732(2025).</li>
<li>Shimoda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+surface+glycans+reflect+osteogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%3A+Profiling+by+an+evanescent+field+fluorescence-assisted+lectin+array+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exosome surface glycans reflect osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: Profiling by an evanescent field fluorescence-assisted lectin array system.</a> Sci Rep. 9, 11497(2019).</li>
<li>Albuquerque, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Paracoccidioides+brasiliensis+glycan+shares+serologic+and+functional+properties+with+cryptococcal+glucuronoxylomannan%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">A Paracoccidioides brasiliensis glycan shares serologic and functional properties with cryptococcal glucuronoxylomannan.</a> Fungal Genet Biol. 49 (11), 943-954 (2012).</li>
<li>Li, Y., Tang, X., Gu, Y., Zhou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+extracellular+vesicles%3A+Small+vesicles+with+big+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived extracellular vesicles: Small vesicles with big impact.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 28 (7), 149(2023).</li>
<li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li>
<li>Crewe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endothelial-to-adipocyte+extracellular+vesicle+axis+governed+by+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state.</a> Cell. 175 (3), 695-708.e13 (2018).</li>
<li>Flaherty, S. E. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363 (6430), 989-993 (2019).</li>
<li>Clement, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+extracellular+vesicles+carry+enzymes+and+fatty+acids+that+stimulate+mitochondrial+metabolism+and+remodeling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Adipocyte extracellular vesicles carry enzymes and fatty acids that stimulate mitochondrial metabolism and remodeling in tumor cells.</a> EMBO J. 39, e102525(2020).</li>
<li>Kulaj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+extracellular+vesicles+increase+insulin+secretion+through+transport+of+insulinotropic+protein+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived extracellular vesicles increase insulin secretion through transport of insulinotropic protein cargo.</a> Nat Commun. 14, 709(2023).</li>
<li>McCann, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+mice+for+isolating+and+auditing+cell+type-specific+extracellular+vesicles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Reporter mice for isolating and auditing cell type-specific extracellular vesicles in vivo.</a> Genesis. 58 (7), e23369(2020).</li>
<li>Men, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+reporter+mice+reveal+the+involvement+of+exosomes+in+mediating+neuron+to+astroglia+communication+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exosome reporter mice reveal the involvement of exosomes in mediating neuron to astroglia communication in the CNS.</a> Nat Commun. 10, 4136(2019).</li>
<li>Jeffery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cre+recombinase+models+for+the+study+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cre recombinase models for the study of adipose tissue.</a> Adipocyte. 3 (3), 206-211 (2014).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603, 926-933 (2022).</li>
<li>Krylova, S. V., Feng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+machinery+of+exosomes%3A+Biogenesis%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The machinery of exosomes: Biogenesis, release, and uptake.</a> Int J Mol Sci. 24 (2), (2023).</li>
<li>Crewe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+interrogating+adipose+tissue+extracellular+vesicle+functions+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">The challenges of interrogating adipose tissue extracellular vesicle functions in physiology.</a> Commun Biol. 5, 581(2022).</li>
<li>Blandin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+analysis+of+adipose-derived+extracellular+vesicles+reveals+specific+EV+lipid+sorting+informative+of+the+obesity+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Lipidomic analysis of adipose-derived extracellular vesicles reveals specific EV lipid sorting informative of the obesity metabolic state.</a> Cell Rep. 42 (3), 112169(2023).</li>
<li>Matilainen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+secretion+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+is+associated+with+adipose+tissue+inflammation+and+the+mobilization+of+excess+lipid+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Increased secretion of adipocyte-derived extracellular vesicles is associated with adipose tissue inflammation and the mobilization of excess lipid in human obesity.</a> J Transl Med. 22, 623(2024).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Olson, A. L., Knight, J. B., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+4%2C+VAMP2%2C+and%2For+VAMP3%2Fcellubrevin+are+functional+target+membrane+and+vesicle+SNAP+receptors+for+insulin-stimulated+GLUT4+translocation+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes.</a> Mol Cell Biol. 17 (5), 2425-2435 (1997).</li>
<li>Oh, E., Miller, R. A., Thurmond, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+4+overexpression+ameliorates+effects+of+aging+and+high-fat+diet+on+glucose+control+and+extends+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 4 overexpression ameliorates effects of aging and high-fat diet on glucose control and extends lifespan.</a> Cell Metab. 22 (3), 499-507 (2015).</li>
<li>Merz, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+the+exocytosis+protein+STX4+in+skeletal+muscle+remediates+peripheral+insulin+resistance+and+alters+mitochondrial+dynamics+via+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enrichment of the exocytosis protein STX4 in skeletal muscle remediates peripheral insulin resistance and alters mitochondrial dynamics via Drp1.</a> Nat Commun. 13, 424(2022).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involution+of+brown+adipose+tissue+through+a+syntaxin+4+dependent+pyroptosis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Involution of brown adipose tissue through a syntaxin 4 dependent pyroptosis pathway.</a> Nat Commun. 15, 2856(2024).</li>
<li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+exosome+secretion+from+single+cells+reveals+a+modulatory+role+for+GPCR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying exosome secretion from single cells reveals a modulatory role for GPCR signaling.</a> J Cell Biol. 217 (3), 1129-1142 (2018).</li>
<li>Arora, A., Sharma, V., Gupta, R., Aggarwal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+derived+from+ex+vivo+culture+of+visceral+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicles derived from ex vivo culture of visceral adipose tissue.</a> Bio Protoc. 14 (11), e5011(2024).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Sci Rep. 7, 15297(2017).</li>
<li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine. 11 (4), 879-883 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych do zgłoszenia.

Opisany protokół wypełnia istotną lukę metodologiczną, zapewniając solidny i powtarzalny system do izolowania i charakteryzowania AdEV oraz ich przyjmowania przez APC. W porównaniu do EV z innych źródeł, AdEV są bardziej bogate w lipidy i wyporności, co sprawia, że klasyczne techniki izolacji oparte na ultrawirowaniu są mniej wydajne35. Jednak większość opublikowanych protokołów oczyszczania AdEV nadal opiera się na ultrawiringu, co może wpływać na morfologię pęcherzyków, prowadzić do powstawania ...

Tkanka tłuszczowa jest coraz częściej uznawana za dynamiczny narząd hormonalny o kluczowej roli w homeostazie energetycznej całego ciała 1,2,3,4,5. Poza klasyczną funkcją magazynowania lipidów, adipocyty regulują ogólnoustrojową wrażliwość na insulinę, a zaburzenia masy tłuszczowej – czy to nadmiar, czy niedobór – są powiązane z insulinoopornością i chorobami metabolicznymi 6,7,8,9. Jednym z mechanizmów proponowanych do tej zdolności regulacyjnej jest komunikacja międzykomórkowa za pośrednictwem czynników wydzielanych. Chociaż adipokiny są dobrze ugruntowane jako kluczowe sygnały endokrynne z tkanki tłuszczowej 10,11,12,13,14,15,16,17,18, adipocyty uwalniają także znaczną liczbę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), czyli cząstek związanych z błoną zawierających lipidy, białka, kwasy nukleinowe i metabolity. Czy EV wydzielane przez adipocyty (AdEV) również przenoszą glikany, podobnie jak inne typy EV, pozostaje niejasne 19,20,21,22,23,24. Adipocyty zostały udowodnione jako główne źródło EV, ponieważ około 80% krążących mikroRNA egzosomalnych pochodzi z adipocytów w modelach myszy, co wykazano na przykładzie adipocytów specyficznych dla adipocytów myszy knockout Dicera przy warunkach wyjściowych25. Rola AdEV w metabolizmie, stanach zapalnych, wrażliwości na insulinę i adipogenezie została opisana, ale pozostaje niedo zrozumiana 26,27,28,29. Inne potencjalne funkcje, szczególnie w pośredniczeniu przesłuchu z innymi typami komórek i narządami, pozostają w dużej mierze nieznane. Obfitość26 pojazdów elektrycznych sugeruje, że mogą odgrywać ważne role zarówno w sygnalizacji lokalnej, jak i systemowej, jednak biologiczne znaczenie i mechanizmy działania AdEV pozostają w dużej mierze niezbadane. Ta luka w wiedzy podkreśla potrzebę solidnych i wyspecjalizowanych metod badania wydzielania i funkcjonowania AdEV.
Aby wypełnić tę lukę, wygenerowaliśmy adipocytowo-specyficzne myszy CD63-GFP (AdipCD63-GFP) poprzez krzyżowanie myszy Adiponektyn-Cre z myszami Stopfl/fl/CD63-GFP (szczep #:036865, JAX). Wzorce Stopfl/fl/CD63-GFP, które nie wyrażały CD63-GFP w przypadku braku Cre, zostały użyte jako grupy kontrolnej. Szczep raportujący CD63-GFP został skutecznie wykorzystany do śledzenia EV specyficznych dla typu komórek in vivo, w tym EV pochodzących od endotelu i neuronów30,31. Ponieważ adiponektyna jest wyrażana wyłącznie w dojrzałych adipocytach, a nie w komórkach progenitorowych adipocytów (APCs)32,33, a CD63 jest markerem EV34, GFP+ EV wykryte w krążeniu i tkankach można konkretnie zidentyfikować jako AdEV. W związku z tym w tym badaniu GFP+ EV wykryte w APC są interpretowane jako AdEV wchłaniane przez te komórki progenitorowe. Ten system reporterów umożliwia bezpośrednie monitorowanie uwalniania pęcherzyków oraz potencjalnych interakcji docelowych in vivo i in vitro, umożliwiając badanie AdEV w innych typach komórek tkanki tłuszczowej. Co ważne, AdEV są szczególnie bogate w lipidy w porównaniu z EV innych typów komórek, co czyni je bardziej wypornymi, kruchymi i trudniejszą do odzyskania przy użyciu tradycyjnych metod ultrawirowania 35,36,37. Wysokie siły odśrodkowe mogą uszkodzić te pęcherzyki lub prowadzić do znacznej utraty próbki i zanieczyszczenia, co komplikuje dalszą analizę. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zoptymalizowaliśmy workflow łączący wiele niskoobrotowych etapów wirowania z chromatografią wykluczającą rozmiar, co minimalizuje naprężenia ścinające, zachowuje integralność pęcherzyków oraz poprawia czystość i wydajność wydajności, umożliwiając dokładne ilościowe i badania funkcjonalne. Razem system CD63-GFP oraz ten zoptymalizowany proces izolacji zapewniają dostępne i powtarzalne podejście do badania wydzielania AdEV i jego funkcji w przesłuchiwaniu tkanki tłuszczowej oraz systemowej regulacji metabolicznej.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Fisher</td><td>AM9260G</td><td>500x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>1000x rozcieńczenia wodą</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1000x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Zestaw izolacyjny tkanki tłuszczowej, mysz</td><td>Miltenyi biotec</td><td>30-106-639</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon ultra, 100 kDa MWCO</td><td>Sigma</td><td>UFC9100</td><td>15 mL objętości próbki</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon ultra, 100 kDa MWCO</td><td>Sigma</td><td>UFC9100</td><td>4 mL objętości próbki</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Przeciwciało Calnexin</td><td>Calnexin</td><td>ab22595</td><td>1000x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD63</td><td>abcam</td><td>ab217345</td><td>500x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>CD81</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>10037</td><td>500x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Corning &nbsp; BioCoat&nbsp; Preparat z kultury kolagenu I</td><td>Sigma</td><td>CLS354630</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Corning &nbsp; sito komórkowe</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td>40 &mu; Rozmiar porów m</td></tr><tr><td>Corning &nbsp; sito komórkowe</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td>100 &mu; Rozmiar porów m</td></tr><tr><td>Przeciwciało COX IV</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4844</td><td>1000x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX</td><td>Thermofisher</td><td>10565018</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>Magazyn 5 KU/mL przy -20 i stopniach; C</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>100x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Halt&trade; Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)</td><td>Thermofisher</td><td>78444</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Przeciwciało HSP70</td><td>abcam</td><td>ab181606</td><td>1000x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Invitrogen eBioscience 10X Bufor Lizy RBC (wielogatunkowy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9743</td><td>10x rozcieńczenie w wodzie</td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDP</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC2042225</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LEICA STELLARIS 8</td><td>Mikroskopy Leica</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Stopień Badawczy</td><td>Sigma</td><td>LIBTM-RO</td><td>Magazyn 5 mg/mL przy -20 stopniach i stopień; C</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex MCE</td><td>Sigma</td><td>SLAA025</td><td>0,8 &mu; Rozmiar porów m</td></tr><tr><td>NanoSight Pro</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Mini Protein Gels, 4&ndash; 12%,</td><td>Thermofisher</td><td>XP04120BOX</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Bufor próbek SDS Novex Tris-glycine (2x)</td><td>Thermofisher</td><td>LC2676</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Przeciwciało Ly-6A/E (Sca-1) przeciwko myszy Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>108119</td><td>Rozcieńczenie 25x</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu (16%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td>rozcieńczyć do 4% z PBS</td></tr><tr><td>pluriStrainer S / 30 & micro; m (sitko komórkowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0922459</td><td>30 &mu; Rozmiar porów m</td></tr><tr><td>Rozwiązanie S Ponceau</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>NC9141851</td><td>500x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent z DAPI</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>8961S</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało przeciwmysie CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101301</td><td>100x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>RIPA buffer&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI89900</td><td>10x rozcieńczenie w wodzie</td></tr><tr><td>Cytometr przepływu spektralnego (Aurora 3)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Syntaxin 4</td><td>Systemy synapcyjne</td><td>110042</td><td>5000x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Tecnai 20 (Transmisyjny Mikroskop Elektronowy)</td><td>FEI</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Tergeo-EM</td><td>PIE Scientific LLC</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało winkulinowe</td><td>abcam</td><td>ab18508</td><td>5000x rozcieńczenie</td></tr></tbody></table>

charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera cd63-gfp in vivo i in vitro

Characterization of Adipocyte-Derived Extracellular Vesicle Secretion Using a CD63-GFP Reporter Mouse Model In Vivo and In Vitro

Adipocyty są coraz częściej uznawane za aktywne komórki endokrynne, które wydzielają znaczne ilości EV wzbogaconych o białka, lipidy i kwasy nukleinowe. Jednak mechanizmy rządzące wydzielaniem EV oraz dynamika uwalniania EV w różnych kontekstach biologicznych nie są w pełni poznane. Aby wypełnić tę lukę, wygenerowaliśmy nową, specyficzną dla adipocytów linię myszy raportujących CD63-GFP, w której ekspresja CD63 oznaczonego GFP jest sterowana przez promotor Adiponektyny, umożliwiając selektywne znakowanie i śledzenie AdEV in vivo. Korzystając z tego modelu reportera, badaliśmy wydzielanie AdEV oraz ich dostarczanie do APC w tkankach tłuszczowych. Obrazowanie konfokalne i cytometria przepływowa wykazały, że AdEV są aktywnie pobierane przez APC, co podkreśla wcześniej niedoceniany mechanizm komunikacji parakrynologicznej w mikrośrodowisku tłuszczowym.
Aby uzupełnić badania in vivo , utworzono system in vitro , umożliwiający bezpośrednie monitorowanie wydzielania EV z zróżnicowanych adipocytów. APC zostały wyizolowane z podskórnych białych tkanek tłuszczowych myszy zgłaszających i indukowane do różnicowania się do dojrzałych adipocytów. W tych komórkach sygnały CD63-GFP obserwowano jako odrębne punkty i wzbogacały się w błonie plazmatycznej, gdy wydzielanie EV było hamowane, co jest zgodne z nagromadzeniem pęcherzyków przy zablokowanym uwalnianiu. W normalnych warunkach wzrostu EV wydzielane do podłoża hodowlanego były koncentrowane i następnie oczyszczane za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarów, co umożliwiło dalsze analizy funkcjonalne i biochemiczne.
Platformę tę można stosować do APC pochodzących z innych depow tłuszczowych, takich jak biała i brązowa tkanka tłuszczowa w najądrzu, lub poprzez różnicowanie ich na specyficzne dla depotu adipocyty, co umożliwia porównanie wydzielania EV między różnymi typami adipocytów.

Razem te podejścia wprowadzają solidne narzędzie genetyczne oraz komplementarny system in vitro do analizy dynamiki wydzielania i celowania AdEV. Te postępy rzucają światło na komunikację komórkową wewnątrztłuszczową i tworzą fundamenty do zrozumienia szerszego metabolicznego wpływu AdEV na zdrowie i chorobę.

Korzystając z tego protokołu wykrywania AdEV poprzez absorpcję APC za pomocą mikroskopii konfokalnej, izolowaliśmy APC z tkanek pachwinowych myszy AdipCD63-GFP i Stopfl/fl/CD63-GFP i barwiliśmy je DAPI w celu wizualizacji jąder. Podczas badania mikroskopii konfokalnej APC myszy Stopfl/fl/CD63-GFP nie wykazały wykrywalnych punktów GFP (Rysunek 1A). Dla porównania, APC wyizolowane z myszy AdipCD63-GFP wykazywały liczne odrębne punkty GFP w cytoplazmie (<strong class="xfig...

Protokół wykorzystuje specyficzną dla adipocytów linię myszy raportującej CD63-GFP do wizualizacji i ilościowej wydzieliny pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów (EV) oraz wykazania ich przyjmowania przez komórki progenitorowe, ujawniając szlak parakrynowy w tkance tłuszczowej.

Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro

Adipocytes are increasingly recognized as active endocrine cells that secrete substantial quantities of EVs enriched in proteins, lipids, and nucleic ...

Badamy pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z adipocytów, EV, aby określić ich rolę w tkance tłuszczowej, a szczególnie jak regulują one przesłuch między dojrzałymi adipocytami a ich komórkami progenitorowymi. Obecnie nie istnieją systemy in vivo do badania wydzieliny EV adipocytów, a istniejące protokoły oczyszczania nie są jeszcze w pełni zoptymalizowane. Na początek użyj techniki sterylnej do usunięcia tkanki tłuszczowej pachwinowej z uśpionych myszy.Włóż jeden gram tkanki do dwumililitrowej probówki zawierającej 0,5 mililitra buforu trawiennego. Używając sterylnych nożyczek, pokrój tkankę na kawałki nie większe niż jeden milimetr. Zawieś posiekaną tkankę w 10 mililitrach buforu trawiennego zawierającego 0,5 miligrama liberazy na mililitr oraz 50 jednostek DNazy I na mililitr. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na orbitalnym shakerze.Podczas inkubacji delikatnie odwróć rurkę kilka razy. Gdy roztwór wydaje się mętny i nie pozostaną widoczne fragmenty tkanki, trawienie jest zakończone. Aby wyizolować frakcję naczyniową stromalną, czyli SVF, rozcieńcz strawioną zawiesinę dwoma objętościami buforu trawiennego.Delikatnie odwróć rurkę trzy do czterech razy, aby dobrze wymieszać. Przepuszczaj zawiesinę przez sterylny filtr o średnicy 100 mikrometrów, aby usunąć niestrawioną tkankę, a następnie wiruj filtrat w 300g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oznacz granulat jako SVF.Inkubuj frakcję naczyniową stromalną w świeżo przygotowanym buforze lizy czerwonych krwinek na lodzie przez pięć minut, chronionym przed światłem. Dodaj dwie objętości buforu do płukania i wiruj w 400g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesij frakcję naczyniową stromalną w 80 mikrolitrach buforu na gram tkanki i przenieś zawartość do nowej rurki.Dodaj 20 mikrolitrów koktajlu na wyniszczenie progenitorów niebędących adipocytami na gram tkanki. Inkubuj próbkę przez 15 minut w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza w ciemności. Przepuszczaj próbkę przez kolumnę LS i zbieraj przepływ zawierający ujemną frakcję komórek linii liniowej.Wiruj przepływ w dawce 300g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać komórki progenitorowe adipocytów. Inkubuj 250 mikrolitrów izolowanych myszy progenitorowych komórek adipocytów myszy na szkiełkach z ośmiodołkami pokrytymi kolagenem przez sześć godzin. Utrwal komórki 4% paradehydu na 10 minut, aby zachować struktury pęcherzyków komórkowych i zewnątrzkomórkowych do obrazowania.Następnie przemyj zamki trzy razy PBS, a następnie zamontuj medium anty-fade. Następnie, po zliczeniu komórek progenitorowych adipocytów, zawiesz je i rozcieńcz barwnik żywotny. Inkubuj na lodzie przez 20 minut, chroniony przed światłem.Umyj komórki raz za pomocą bufora i wirówki. Zawieś komórki w buforze barwiącym błyskotliwie, tak aby końcowe stężenie wynosiło 1 milion komórek na 100 mikrolitrów. Blokuj niespecyficzne wiązanie, dodając odczynnik blokujący receptory Fc w proporcji 1:100 i inkubuj.Wolne kręć przeciwciałem SCA-1 przy 6000g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj przeciwciało SCA-1 do rurki APC w rozcieńczeniu 1:100, a następnie umieść rurkę na lodzie, chronioną przed światłem. Przemyj komórki dwa razy jednym mililitrem buforu do mycia, a następnie wiruj w 300g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zawiesić komórki w buforze płukania do sortowania cytometrii przepływowej, a następnie pobrać dane dla komórek SCA-1 dodatniej i GFP dodatniej na cytometrze spektralnym wyposażonym w laser fioletowo-niebieski. Aby rozpocząć rozróżnienie, obtacz naczynia 0,2% żelatyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Siej świeżo wyizolowane APC w podłożu z dodatkiem DMEM/F12 i inkubuj do połączenia się.Zamień medium od pierwszego do ósmego dnia na MesenCult adipogenic differentiation medium. Dziewiątego dnia przemyj adipocyty dwukrotnie PBS, a następnie zamień podłoże na dojrzałą podłoże adipocytów zawierające DMEM 1% BSA i 0,2% Primocyny. Aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez adipocyty, najpierw przeprowadź 15 mililitrów pożywki hodowlanej przez filtr 40-mikrometrowy, a następnie przez filtr 30-mikrometrowy.Wiruj filtrat w 500g przez pięć minut, a następnie odwiruj supernatant w 2000g przez 10 minut, aby usunąć pozostałości komórek i zanieczyszczenia. Po przepuszczeniu powstałego supernatantu przez filtr 0,8 mikrometra i przelaniu filtratu do jednostki ultrafiltracyjnej 15 mililitrów, wiruj w 4000 g przez 15 minut, aby skoncentrować medium. Załaduj skoncentrowaną próbkę do kolumny chromatografii wykluczającej rozmiar podłączoną do automatycznego zbieracza frakcji i zbieraj frakcje od F1 do F8.To przeprowadzić analizę Western blotem, koncentrując każdą frakcję od 400 do 25 mikrolitrów.Pipetuj 50 mikrolitrów buforu immunoprecipitacyjnego z dodatkiem inhibitorów proteazy i fosfatazy do koncentratu. Dodaj 75 mikrolitrów dwóch ładowania SDS 2X, aby zdenaturować próbkę i rozdzielić białka na żelu Tris-Glycine o stężeniu 4% do 12%. Do analizy śledzenia nanocząstek rozcieńcz próbki pęcherzyków zewnętrznych sterylnym PBS o filtracji 0,1 mikrometra i delikatnie wymieszaj.Załaduj rozcieńczoną próbkę do instrumentu NTA wyposażonego w wysokoczułą naukową kamerę komplementarno-tlenkową oraz 532-nanometrowy zielony laser. Ustaw detekcję dla cząstek o średnicy od 10 nanometrów do 1000 nanometrów, w stężeniu od 10 do potęgi sześciu do 10 do mocy dziewięciu cząstek na mililitr. Komórki progenitorowe adepozycyjne z myszy stop-flock-flock/CD63GFP nie wykazały wykrywalnych zielonych fluorescencjowych białek punkta pod mikroskopią konfokalną.Komórki myszy AdipCD63 wykazywały liczne wyraźne zielone fluorescencyjne białka punkty w cytoplazmie. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 1,2% komórek pozytywnych czaszki 1 u myszy zgłaszających wykazało się zieloną fluorescencyjną białkiem w porównaniu do 12,6% u myszy AdipCD63-GFP. Zachodnie blottingowanie frakcji chromatografii wykluczenia rozmiaru wykazało, że markery pęcherzyków zewnątrzkomórkowych CD63 i HSP70 zostały wzbogacone o frakcje F1 i F2. Natomiast markery retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów były nieobecne, co potwierdzało czystość pęcherzyków.Analiza śledzenia nanocząstek wykazała, że pęcherzyki zewnętrzne pochodzące z adipocytów mają rozmiary od 50 nanometrów do 500 nanometrów, a transmisyjna mikroskopia elektronowa potwierdziła, że pęcherzyki wykazują nienaruszone struktury podwójnej błony. Western blot potwierdził knockout STX4 w adipocytach. Mikroskopia konfokalna wykazała, że pęcherzyki dodatnie CD63-GFP były rozproszone w cytosolu w dzikich adipocytach, ale gromadziły się w pobliżu błony plazmatycznej w adipocytach STX4.Stężenie wydzielanych pęcherzyków pochodzących z adipocytów zewnętrznych było istotnie zmniejszone w adipocytach STX4 knockout w porównaniu do typu dzikiego. Western blot o równych ilościach białek w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych wykazał zmniejszoną ekspresję CD63 i CD81 w adipocytach STX4 knockout w porównaniu z typem dzikim. Protokół zapewnia solidny i powtarzalny system do badania wydzielania EV adipocytów in vivo i in vitro, a także zoptymalizowaną metodę oczyszczania EV adipocytów.Protokół po raz pierwszy opisuje i potwierdza zastosowanie seryjnej wirówek niskoobrotowych połączonych z chromatografią wykluczającą rozmiar do oczyszczania EV pochodzących z dojrzałych adipocytów. Nasze wyniki pozwalają nam zadawać nowe pytania dotyczące tego, jak adipocyty wykorzystują pęcherzyki zewnątrzkomórkowe do komunikacji z innymi typami komórek w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

characterization-adipocyte-derived-extracellular-vesicle-secretion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów przy użyciu myszy reportera CD63-GFP. Technika ta umożliwia badanie komunikacji komórkowej w tkance tłuszczowej in vivo i in vitro.

Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro

Przeglądaj więcej filmów