Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro

Badamy pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z adipocytów, EV, aby określić ich rolę w tkance tłuszczowej, a szczególnie jak regulują one przesłuch między dojrzałymi adipocytami a ich komórkami progenitorowymi. Obecnie nie istnieją systemy in vivo do badania wydzieliny EV adipocytów, a istniejące protokoły oczyszczania nie są jeszcze w pełni zoptymalizowane. Na początek użyj techniki sterylnej do usunięcia tkanki tłuszczowej pachwinowej z uśpionych myszy.

Włóż jeden gram tkanki do dwumililitrowej probówki zawierającej 0,5 mililitra buforu trawiennego. Używając sterylnych nożyczek, pokrój tkankę na kawałki nie większe niż jeden milimetr. Zawieś posiekaną tkankę w 10 mililitrach buforu trawiennego zawierającego 0,5 miligrama liberazy na mililitr oraz 50 jednostek DNazy I na mililitr. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na orbitalnym shakerze.

Podczas inkubacji delikatnie odwróć rurkę kilka razy. Gdy roztwór wydaje się mętny i nie pozostaną widoczne fragmenty tkanki, trawienie jest zakończone. Aby wyizolować frakcję naczyniową stromalną, czyli SVF, rozcieńcz strawioną zawiesinę dwoma objętościami buforu trawiennego.

Delikatnie odwróć rurkę trzy do czterech razy, aby dobrze wymieszać. Przepuszczaj zawiesinę przez sterylny filtr o średnicy 100 mikrometrów, aby usunąć niestrawioną tkankę, a następnie wiruj filtrat w 300g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oznacz granulat jako SVF.

Inkubuj frakcję naczyniową stromalną w świeżo przygotowanym buforze lizy czerwonych krwinek na lodzie przez pięć minut, chronionym przed światłem. Dodaj dwie objętości buforu do płukania i wiruj w 400g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesij frakcję naczyniową stromalną w 80 mikrolitrach buforu na gram tkanki i przenieś zawartość do nowej rurki.

Dodaj 20 mikrolitrów koktajlu na wyniszczenie progenitorów niebędących adipocytami na gram tkanki. Inkubuj próbkę przez 15 minut w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza w ciemności. Przepuszczaj próbkę przez kolumnę LS i zbieraj przepływ zawierający ujemną frakcję komórek linii liniowej.

Wiruj przepływ w dawce 300g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać komórki progenitorowe adipocytów. Inkubuj 250 mikrolitrów izolowanych myszy progenitorowych komórek adipocytów myszy na szkiełkach z ośmiodołkami pokrytymi kolagenem przez sześć godzin. Utrwal komórki 4% paradehydu na 10 minut, aby zachować struktury pęcherzyków komórkowych i zewnątrzkomórkowych do obrazowania.

Następnie przemyj zamki trzy razy PBS, a następnie zamontuj medium anty-fade. Następnie, po zliczeniu komórek progenitorowych adipocytów, zawiesz je i rozcieńcz barwnik żywotny. Inkubuj na lodzie przez 20 minut, chroniony przed światłem.

Umyj komórki raz za pomocą bufora i wirówki. Zawieś komórki w buforze barwiącym błyskotliwie, tak aby końcowe stężenie wynosiło 1 milion komórek na 100 mikrolitrów. Blokuj niespecyficzne wiązanie, dodając odczynnik blokujący receptory Fc w proporcji 1:100 i inkubuj.

Wolne kręć przeciwciałem SCA-1 przy 6000g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj przeciwciało SCA-1 do rurki APC w rozcieńczeniu 1:100, a następnie umieść rurkę na lodzie, chronioną przed światłem. Przemyj komórki dwa razy jednym mililitrem buforu do mycia, a następnie wiruj w 300g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zawiesić komórki w buforze płukania do sortowania cytometrii przepływowej, a następnie pobrać dane dla komórek SCA-1 dodatniej i GFP dodatniej na cytometrze spektralnym wyposażonym w laser fioletowo-niebieski. Aby rozpocząć rozróżnienie, obtacz naczynia 0,2% żelatyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Siej świeżo wyizolowane APC w podłożu z dodatkiem DMEM/F12 i inkubuj do połączenia się.

Zamień medium od pierwszego do ósmego dnia na MesenCult adipogenic differentiation medium. Dziewiątego dnia przemyj adipocyty dwukrotnie PBS, a następnie zamień podłoże na dojrzałą podłoże adipocytów zawierające DMEM 1% BSA i 0,2% Primocyny. Aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez adipocyty, najpierw przeprowadź 15 mililitrów pożywki hodowlanej przez filtr 40-mikrometrowy, a następnie przez filtr 30-mikrometrowy.

Wiruj filtrat w 500g przez pięć minut, a następnie odwiruj supernatant w 2000g przez 10 minut, aby usunąć pozostałości komórek i zanieczyszczenia. Po przepuszczeniu powstałego supernatantu przez filtr 0,8 mikrometra i przelaniu filtratu do jednostki ultrafiltracyjnej 15 mililitrów, wiruj w 4000 g przez 15 minut, aby skoncentrować medium. Załaduj skoncentrowaną próbkę do kolumny chromatografii wykluczającej rozmiar podłączoną do automatycznego zbieracza frakcji i zbieraj frakcje od F1 do F8.To przeprowadzić analizę Western blotem, koncentrując każdą frakcję od 400 do 25 mikrolitrów.

Pipetuj 50 mikrolitrów buforu immunoprecipitacyjnego z dodatkiem inhibitorów proteazy i fosfatazy do koncentratu. Dodaj 75 mikrolitrów dwóch ładowania SDS 2X, aby zdenaturować próbkę i rozdzielić białka na żelu Tris-Glycine o stężeniu 4% do 12%. Do analizy śledzenia nanocząstek rozcieńcz próbki pęcherzyków zewnętrznych sterylnym PBS o filtracji 0,1 mikrometra i delikatnie wymieszaj.

Załaduj rozcieńczoną próbkę do instrumentu NTA wyposażonego w wysokoczułą naukową kamerę komplementarno-tlenkową oraz 532-nanometrowy zielony laser. Ustaw detekcję dla cząstek o średnicy od 10 nanometrów do 1000 nanometrów, w stężeniu od 10 do potęgi sześciu do 10 do mocy dziewięciu cząstek na mililitr. Komórki progenitorowe adepozycyjne z myszy stop-flock-flock/CD63GFP nie wykazały wykrywalnych zielonych fluorescencjowych białek punkta pod mikroskopią konfokalną.

Komórki myszy AdipCD63 wykazywały liczne wyraźne zielone fluorescencyjne białka punkty w cytoplazmie. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 1,2% komórek pozytywnych czaszki 1 u myszy zgłaszających wykazało się zieloną fluorescencyjną białkiem w porównaniu do 12,6% u myszy AdipCD63-GFP. Zachodnie blottingowanie frakcji chromatografii wykluczenia rozmiaru wykazało, że markery pęcherzyków zewnątrzkomórkowych CD63 i HSP70 zostały wzbogacone o frakcje F1 i F2. Natomiast markery retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów były nieobecne, co potwierdzało czystość pęcherzyków.

Analiza śledzenia nanocząstek wykazała, że pęcherzyki zewnętrzne pochodzące z adipocytów mają rozmiary od 50 nanometrów do 500 nanometrów, a transmisyjna mikroskopia elektronowa potwierdziła, że pęcherzyki wykazują nienaruszone struktury podwójnej błony. Western blot potwierdził knockout STX4 w adipocytach. Mikroskopia konfokalna wykazała, że pęcherzyki dodatnie CD63-GFP były rozproszone w cytosolu w dzikich adipocytach, ale gromadziły się w pobliżu błony plazmatycznej w adipocytach STX4.

Stężenie wydzielanych pęcherzyków pochodzących z adipocytów zewnętrznych było istotnie zmniejszone w adipocytach STX4 knockout w porównaniu do typu dzikiego. Western blot o równych ilościach białek w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych wykazał zmniejszoną ekspresję CD63 i CD81 w adipocytach STX4 knockout w porównaniu z typem dzikim. Protokół zapewnia solidny i powtarzalny system do badania wydzielania EV adipocytów in vivo i in vitro, a także zoptymalizowaną metodę oczyszczania EV adipocytów.

Protokół po raz pierwszy opisuje i potwierdza zastosowanie seryjnej wirówek niskoobrotowych połączonych z chromatografią wykluczającą rozmiar do oczyszczania EV pochodzących z dojrzałych adipocytów. Nasze wyniki pozwalają nam zadawać nowe pytania dotyczące tego, jak adipocyty wykorzystują pęcherzyki zewnątrzkomórkowe do komunikacji z innymi typami komórek w warunkach fizjologicznych i patologicznych.