Name: Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Poznaj metodę MeRIP-qPCR do wykrywania modyfikacji m⁶A w transkryptach RNA w komórkach osteosarkoma. Technika ta pozwala na precyzyjną analizę poziomów metylacji z wykorzystaniem immunoprecypitacji i PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało wsparte grantami od National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 i 82205145).

1. Przygotowanie RNA
UWAGA: Ekstrakcja RNA przeprowadza się za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Pracuj w czystej szafie biobezpieczeństwa podczas pracy z komórkami i odczynnikami RNA. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, okulary ochronne). Przed uruchomieniem schłodź wirówkę do 4 °C.
<ol>
	<li>Przygotujcie komórki.<ol>
		<li>Wyjmij podłoże hodowlowane z naczynia o wysokości 3,5 cm i delikatnie umyj komórki za pomocą schłodzonego PBS. Dodaj odpowiednią objętość buforu lizy RNA bezpośrednio do naczynia, aby całkowicie zlizować komórki i delikatnie pipetować, aby ujednolicić.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę ogniwową do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Wirówka w 1000 × g przez 5 minut w 4 °C. UWAGA: Upewnij się, że wirnik jest wyważony, a pokrywa dobrze zamknięta.</li>
		<li>Po wirowaniu ostrożnie wyjmij rurkę mikrowirówki.</li>
		<li>Całkowicie zasysaj supernatant pipetą o pojemności 1 mL, nie naruszając granulatu na dnie. UWAGA: Nie dotykaj osadu ogniwa końcówką pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki lizu.<ol>
		<li>Dodaj 300 μL buforu lizy do pelletu komórkowego.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj, odwracając probówkę 30 razy, aż roztwór będzie przezroczysty i lepki, bez widocznych grudek.</li>
		<li>Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącają RNA.<ol>
		<li>Dodaj 300 μL 100% etanolu do lizatu (równa objętość buforu lizy).</li>
		<li>Delikatnie pipetuj w górę i w dół od razu (około 8-10 razy), żeby w pełni się wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj wiązanie kolumn RNA.<ol>
		<li>Włóż kolumnę oczyszczającą RNA do dostarczonej probówki zbiorczej 2 mL.</li>
		<li>Przelej całą mieszankę do kolumny oczyszczającej. UWAGA: Unikaj dotykania białej błony w centrum.</li>
		<li>Zamknij nakrętkę i zatwórz w wirówce przy 12 000 × g przez 1 minutę.</li>
		<li>Wyrzuć dolną ciecz i delikatnie stuknąć probówkę do góry nogami o chłonny papier, aby usunąć resztki płynu.</li>
		<li>Zwróć kolumnę oczyszczającą do probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płucz zanieczyszczenia.<ol>
		<li>Do kolumny oczyszczającej dodaj 500 μL buforu płukania (wody wolnej od nukleazy). UWAGA: Unikaj dotykania białej błony w centrum.</li>
		<li>Wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę i wyrzucaj ciecz o niższej wartości.</li>
		<li>Ponownie wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę, aby usunąć pozostałości płynu.</li>
		<li>Przełóż kolumnę oczyszczającą do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Otwórz pokrywę i pozwól kolumnie stać przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA elute.<ol>
		<li>Włóż kolumnę oczyszczającą do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Dodaj 25 μL Buforu Elution bezpośrednio na środek błony.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę, aby zebrać RNA w dolnej tubce.</li>
		<li>Ponownie nałóż eluat na membranę i ponownie wiruj przy 12 000 × g przez 1 minutę, aby zmaksymalizować wydajność. UWAGA: Zawsze dodaj bufor elution bezpośrednio na środek membrany kolumny. Unikaj dodawania go do ściany bocznej, ponieważ może to uniemożliwić rozpuszczenie RNA i znacznie zmniejszyć wydajność RNA. Nie przebijaj membrany końcówką pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz stężenie RNA.<ol>
		<li>Przepłucz port próbki spektrofotometru 1,5 μL Buforu Elution.</li>
		<li>Użyj 1,5 μL Bufora Elution jako pustego elementu. Potwierdź, że odczyt jest bliski zera.</li>
		<li>Załaduj 1,5 μL próbki RNA i zmierz stężenie.</li>
		<li>Ocena jakości próbek RNA za pomocą spektrofotometru (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) oraz elektroforezy żelowej agarozy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunoprecipitacja metylowanego RNA (MeRIP)
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny immunocapturek<ol>
		<li>Zdobądź nową sondę PCR o pojemności 0,2 mL.</li>
		<li>Dodaj składniki zgodnie z Tabelą 1 (przykład dla jednej reakcji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunocapture<ol>
		<li>Mocno zamknij nakrętkę rurki. Umieść rurkę PCR na rotatorze lub rolującym shakerze.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 90 minut. UWAGA: Upewnij się, że roztwór jest mieszany cały czas i delikatnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozszczepienie RNA<ol>
		<li>Po inkubacji do każdej probówki należy dodać 10 μL Nuclear Digestion Enhancer (NDE) oraz 2 μL Chemie Mix Cleavage Enzyme Mix (CEM).</li>
		<li>Mieszaj delikatnie, pipetując pipetami 5 do 6 razy.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.</li>
		<li>Przygotowanie kontroli RNA wejściowego<ol>
			<li>Aby zapewnić spójność między immunoprecypitacją (IP) a próbkami wejściowymi, przetwarzaj część RNA równolegle jako kontrolę wejściową.</li>
			<li>Przenieś 1 μg całkowitego RNA (10% wejścia) z każdej próbki do osobnej probówki PCR. Dodaj 20 μL buforu wychwytującego immuno (ICB), 1,5 μL NDE, 1 μL CEM i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacenie magnetyczne i płukanie<ol>
		<li>Umieść rurkę PCR na stojaku magnetycznym.</li>
		<li>Pozwól rurce stać przez 2 minuty, aż roztwór stanie się przezroczysty, a kulki zostaną zatrzymane na ściance rurki.</li>
		<li>Ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant, nie naruszając koralików.</li>
		<li>Trzymaj tubkę na magnetycznym stojaku i dodaj 150 μL Wash Buffer (WB).</li>
		<li>Zdejmij rurkę ze stojaka magnetycznego i delikatnie przechyl ją do góry nogami, aby całkowicie zawieszyć kulki.</li>
		<li>Wróć rurkę do stojaka magnetycznego. Poczekaj 1-2 minuty, aż roztwór się wysunę, potem odrzuć supernatant.</li>
		<li>Powtórz krok mycia trzy razy.</li>
		<li>Przemyj kulki ponownie 150 μL buforu trawienia białek (PDB) tą samą metodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwalnianie i odzyskiwanie wzbogaconego RNA<ol>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy do trawienia białek, mieszając proteinazę K i PDB w proporcji 1:9. (Do każdej reakcji przygotuj 20 μL: 2 μL proteinazy K + 18 μL PDB).</li>
		<li>Po ostatnim umyciu zdejmij rurkę z magnetycznego stojaku.</li>
		<li>Dodaj 20 μL świeżo przygotowanego roztworu roboczego do trawienia białka do granulki i delikatnie wymieszaj.</li>
		<li>Umieść rurkę PCR w cyklerze termicznym i inkubuj w temperaturze 55 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Umieść rurkę PCR z powrotem na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż roztwór się rozwinie (około 2 minuty).</li>
		<li>Ostrożnie przelej cały supernatant (około 20 μL) do nowej rurki PCR o pojemności 0,2 mL. UWAGA: RNA jest teraz w supernatancie. Usuń paciorki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie RNA<ol>
		<li>Dodaj 20 μL roztworu oczyszczającego RNA (RPS) do każdej probówki, ujemnej i wejściowej probówki.</li>
		<li>Dodaj 160 μL 100% etanolu.</li>
		<li>Vortex RNA Binding Beads do ich ponownego zawieszenia.</li>
		<li>Dodaj 2 μL kulek wiążących RNA z zawieszoną zawieszoną do każdej probówki.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj w górę i w dół co najmniej 10 razy.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić wiązanie RNA.</li>
		<li>Umieść rurkę na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż roztwór się rozwinie (około 2 minuty).</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucaj supernatant, nie naruszając koralików.</li>
		<li>Trzymaj rurkę na magnetycznym stojaku i dodaj 150 μL świeżo przygotowanego etanolu 90%. Inkubuj przez 30 sekund.</li>
		<li>Wyrzuć 90% etanolu. Powtórz mycie 90% etanolem jeszcze raz (w sumie dwa razy).</li>
		<li>Usuń rurkę ze stojaka magnetycznego.</li>
		<li>Dodaj 13 μL Bufora Elution do suszonych kulek.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby wydzielić RNA.</li>
		<li>Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż roztwór się rozwinie (około 2 minuty).</li>
		<li>Ostrożnie przelej cały supernatant (około 13 μL) do nowej rurki PCR wolnej od RNazy.</li>
		<li>Użyj natychmiast lub przechowuj RNA w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RT-qPCR
<ol>
	<li>Odwrotnie transkrybować RNA wzbogacone o m6A do cDNA<ol>
		<li>Do transkrypcji odwrotnej używaj oczyszczonego RNA z grupym6A-IP, wejściowej lub IgG.</li>
		<li>Przygotuj reakcję transkrypcji odwrotnej (RT). UWAGA: Zapewnij równe wejście RNA we wszystkich grupach, aby umożliwić wiarygodne porównania w dalszej analizie qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmacnianie qPCR<ol>
		<li>Przygotuj reakcje qPCR przy użyciu chemii SYBR Green. Dodaj 10 μL SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL zapalnika do przodu (10 μM), 0,5 μL zapalnika odwrotnego (10 μM), 7 μLddH2O oraz 2 μL cDNA do każdej probówki, dokładnie wymieszaj i krótko wiruj przed załadowaniem do instrumentu qPCR. UWAGA: Ustaw trzy studnie replikacyjne dla każdej próbki cDNA (Input, IgG, m6A-IP). Lista spłonników znajduje się w Tabeli 2 .</li>
		<li>Uruchom program qPCR.<ol>
			<li>Wykonaj reakcje qPCR na cyklerze termicznym w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu: ustaw początkową denaturację na 95 °C przez 30 s; Uruchom 40 cykli, w tym denaturację w 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w 58 °C przez 10 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 30 s.</li>
			<li>Po amplifikacji przeprowadź analizę krzywej stopu, ustawiając denaturację na 95 °C przez 15 sekund, chłodząc na 60 °C przez 1 minutę, a następnie stopniowo podnosząc temperaturę do 95 °C z tempem narastania 0,5 °C/s z ciągłym nabijaniem fluorescencji, aby potwierdzić specyficzność produktów amplifikowanych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych<ol>
		<li>Przeanalizuj wartości Ct grupy docelowej i kontrolnej.</li>
		<li>Oblicz wzbogacenie za pomocą jednej z następujących metod:<ol>
			<li>Metody 1: Metoda procentowa inputu %Input = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100% UWAGA: Ct (Input) i Ct (IP) reprezentują wartości progowe cyklu próbek wejściowych i IP, a współczynnik rozcieńczenia (DF) to odwrotność frakcji wejściowej użytej dla qPCR (np. jeśli 10% całkowitego RNA zostało użyte jako Input, to DF = 10).</li>
			<li>Metody 2: Metoda porównawcza CT (metoda 2^-ΔΔCt ) ΔCtsample=CtIP−CtIgG Ct=ΔCttraktowane−ΔCt kontrola, Fold=2−ΔΔCt. UWAGA: Utrzymuj równomierne ilości RNA, konfigurację reakcji i efektywność podkładu we wszystkich próbkach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+m6A+RNA+methylation+and+noncoding+RNA+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).</li>
<li>Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+m6A+modification+and+alternative+splicing+during+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression.</a> Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).</li>
<li>Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+methylation+modification%3A+Potential+pathways+to+suppress+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis.</a> Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).</li>
<li>Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot+blot+analysis+for+measuring+global+N6-methyladenosine+modification+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA.</a> Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+strategies+to+profile+transcriptomic+m6A+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications.</a> Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).</li>
<li>McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+in+the+detection+of+m6A+changes+using+MeRIP%2Fm6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq.</a> Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).</li>
<li>Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+profiling+of+N6-methyladenosine+%28m6A%29+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications.</a> Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).</li>
<li>Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+monoclonal+antibodies+against+N6-methyladenosine+for+the+detection+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications.</a> PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).</li>
<li>Law, J., Günther, S., Watanabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptome+mapping+of+N6-methyladenosine+using+m6A+immunoprecipitation+with+high-throughput+sequencing+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).</li>
<li>Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+m6A+RNA+modification+by+LC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).</li>
<li>Slama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+enrichment+factors+for+modified+RNA+in+MeRIP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments.</a> Methods. 156, 102-109 (2019).</li>
<li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+m6A+detection+empowered+by+endogenous+labeling+unveils+complexities+across+RNA+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms.</a> Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MeRIP-qPCR stał się cennym narzędziem do badania modyfikacji RNA m6A o szerokich zastosowaniach. Jest szczególnie przydatna przy walidacji wyników sekwencjonowania o wysokiej przepustowości oraz precyzyjnym lokalizowaniu miejsc modyfikacji w określonych obszarach genów docelowych podczas badań mechanistycznych. Ponadto metoda ta może być łatwo wdrażana w większości laboratoriów biologii molekularnej dzięki stosunkowo niskim kosztom i prostocie operacyjnej, co czyni ją efektywnym i praktycznym podejściem do bad...

Najnowsze badania epitrankryptomu pokazują, że modyfikacja RNA N 6-metyladenozyny (m6A), czyli metylacja pozycji N6 na adenozynie, jest najliczniejszą znaną wrodzoną modyfikacją chemiczną mRNA w komórkach eukariotycznych1. m6A uczestniczy w szerokim zakresie procesów biologicznych, w tym w stabilności mRNA, splicingu, eksportu jądrowego oraz efektywności translacji2. Co ważne, coraz więcej dowodów sugeruje, że zaburzenia regulacji modyfikacjim6Aprzyczyniają się do inicjacji i rozwoju różnych nowotworów, w tym osteosarcoma, wysoce agresywnego złośliwego guza kości, który dotyka głównie nastolatków i młodych dorosłych3.
Badanie modyfikacji m6Awymaga solidnych i wiarygodnych metodologii. Opracowano kilka metod wykrywania poziomów modyfikacji m6A, w tym m6A punktowego blota, m6A ELISA oraz MeRIP-seq. Test kropkowym6A jest prosty i opłacalny, jednak cierpi na ograniczoną czułość i słabą ilościowość. Zapewnia poziom modyfikacjim6Acałkowitego RNA, zamiast poziomu modyfikacjim6Adla konkretnego RNA4. m6A ELISA oferuje stosunkowo wygodne i wysokoprzepustowe wykrywanie; jednak reaktywność krzyżowa i niska dokładność pozostają poważnymi problemami, a także nie ma możliwości ujawniania modyfikacji specyficznych dla transkrypcji lub lokalizacji5. MeRIP-seq umożliwia mapowaniem6Ana cały transkryptom; jednak jego wymagania dotyczące dużych ilości RNA, stosunkowo niskiej rozdzielczości i zależności od przeciwciał ograniczają precyzję i powtarzalność MeRIP-seq6. Dla porównania, MeRIP-qPCR łączy immunoprecipitację z ilościowym PCR, zapewniając wyższą czułość i swoistość do celowanego wykrywaniam6Ana specyficznym RNA7. Metoda ta umożliwia czułe i celowane wykrywanie różnicowego wzbogacenia m6A w genach kandydatów, co czyni ją szczególnie odpowiednią do badań walidacyjnych w badaniach raka związanych z m6A. Ta metoda stanowi opłacalną i dostępną alternatywę dla laboratoriów mających na celu badanie mechanizmów regulacyjnych pośredniczonych przez m6A.
Przedstawiliśmy szczegółowy protokół (Rysunek 1) do oceny poziomów modyfikacji c-Mycm6A w komórkach kostnoowocaka, używając MeRIP-qPCR jako przykładu. MeRIP-qPCR, opierający się na wzbogaceniu metylowanych fragmentów RNA opartym na przeciwciałach, a także w połączeniu z transkrypcją odwrotną i ilościowym PCR, ocenia obecność i względną obfitośćm6Aw specyficznym RNA. Wykazaliśmy, że to podejście skutecznie rozróżnia różnice metylacji c-Myc i stanowi wiarygodną podstawę do badania funkcjonalnej roli m6Aw komórkach osteosarcoma. Niniejsze badanie podkreśla potencjał MeRIP-qPCR jako praktycznego i specyficznego narzędzia do badań nad modyfikacją m6Aw osteosarcomie oraz tworzy podstawy do identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td>Shanghai Titan Scientific Co., Ltd., Ameryka</td><td>1158566</td><td></td></tr><tr><td>143B</td><td>ATCC, Ameryka</td><td>ATCC CRL-8303TM</td><td></td></tr><tr><td>2& razy; SYBR Green qPCR Mix</td><td>Beijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., Chiny</td><td>FS-Q1002</td><td></td></tr><tr><td>Denovix DS-11&nbsp;</td><td>Denovix</td><td>DS-11&nbsp;</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>Medium DMEM</td><td>WISENT CORPORATION, Chiny</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Gibco, Ameryka</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EpiQuik CUT& Zestaw do wzbogacania RNA (MeRIP) RUN m6A</td><td>Epigentek, Ameryka</td><td>P-9018-24</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>WISENT CORPORATION, Chiny</td><td>086-150</td><td></td></tr><tr><td>hFOB1.19</td><td>Bank Komórkowy Chińskiej Akademii Nauk, Chiny</td><td>GNHu14</td><td></td></tr><tr><td>m6Zestaw do testów metylacji RNA</td><td>Abcam, Anglia</td><td>ab185912</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji odwrotnej mikroRNA</td><td>EZBioscience-EZB, Ameryka</td><td>A0010CGQ</td><td></td></tr><tr><td>System czasu rzeczywistego</td><td>BIO-RAD, Ameryka</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA</td><td>EZBioscience-EZB, Ameryka</td><td>B0004DP</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresowy trypLE</td><td>Gibco, Ameryka</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

test merip-qpcr do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego rna w komórkach osteosarcoma

MeRIP-qPCR Assay for Detecting m6A Modification Levels of Specific RNA in Osteosarcoma Cells

Modyfikacja epitranskryptomiczna RNA odgrywa kluczową rolę w inicjacji i rozwoju różnych nowotworów, wśród których N 6-metyladenozyna (m6A) jest najbardziej powszechną i funkcjonalnie zróżnicowaną modyfikacją. Przedstawiamy tutaj uprościony i powtarzalny protokół wykorzystujący MeRIP-qPCR do oceny poziomów modyfikacji m6Aspecyficznych transkryptów w komórkach osteosarcoma. W tym badaniu wyodrębniono całkowite RNA, po czym nastąpiła inkubacja z konkretnym przeciwciałem przeciw m6A do modyfikacji immunocapture RNAm6A. Następnie RNA zostało rozfragmentowane, a wzbogacenie fragmentów m6A-zmodyfikowanych RNA osiągnięto za pomocą magnetycznych kulek białka G. Wzbogacone RNA było uwalniane przez trawienie proteinazy K i oczyszczane przez kulki wiążące RNA. Na koniec RNA poddano odwrotnej transkrypcji oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu oceny poziomu m6Aw genach kandydatów. Wyniki wykazały, że ta metoda skutecznie rozróżnia różnice metylacji i stanowi wiarygodne narzędzie do badania funkcjonalnych mechanizmów modyfikacjim6Aw komórkach osteosarcoma. Podsumowując, MeRIP-qPCR oferuje proste i bardzo szczegółowe podejście do badania modyfikacji m6Aw komórkach kostniaraka. Protokół ten ma duży potencjał w wyjaśnianiu sieci regulacyjnych m6Aoraz identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Przedstawiamy tutaj reprezentatywny wynik analizy MeRIP-qPCR, poziom modyfikacjim6A c-Myc w komórkach hFOB1.19 i 143B. Jak pokazano na Rysunku 2, wzbogacenie c-Myc przeciwciałem przeciwm6 Abyło istotnie wyższe w porównaniu z kontrolą IgG, która wykazywała jedynie poziomy tła, co sugeruje, że przeciwciało przeciwm6A jest zarówno skuteczne, jak i specyficzne. Zaobserwowaliśmy również, że poziom modyfikacjim6Ac-Myc był istotnie wyższy w 143B niż w kom...

Protokół ten oferuje szczegółowe podejście do oceny poziomów modyfikacji m6Aspecyficznego RNA za pomocą MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

RNA epitranscriptomic modification plays a critical role in the initiation and development of various cancers, among which N6-methyladenosine (m6A) is the ...

Moje badania koncentrują się na osteosarcomie. Staram się omówić zalety MeRIP-qPCR w porównaniu z innymi kierunkami technicznymi i przyszłymi badaniami. Na początek usuń pożywkę hodowlową z naczynia o średnicy 3,5 centymetra zawierającego komórki osteosarcoma.Delikatnie umyj raz za pomocą schłodzonego PBS. Dodaj odpowiednią ilość buforu lizy RNA bezpośrednio do naczynia, aby całkowicie zlizować komórki. Delikatnie pipetuj zawieszenie, aby się ujednoliło.Przenieś zawiesinę komórkową do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie wiruj rurkę mikrowirówki w temperaturze 1 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu ostrożnie wyjmij rurkę mikrowirówki.Używając pipety o pojemności jednego mililitra, całkowicie zasysaj supernatant, nie naruszając granulki na dnie. Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu lizycznego do pelletu komórkowego. Dokładnie wymieszaj, odwracając probówkę 30 razy, aż roztwór będzie przezroczysty i lepki, bez widocznych grudek.Następnie inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty i przekonuj wytrącanie i oczyszczanie RNA. Do immunoprecipitacji metylowanego RNA należy dodać wymienione odczynniki do probówki. Zamknij szczelnie korek rurki PCR dla wychwytu odporności.Następnie umieść rurkę PCR na rotatorze lub wstrząszaczce i inkubuj. Teraz przenieś rurkę PCR na podstawkę magnetyczną. Pozwól tubce stać przez dwie minuty, aż roztwór stanie się przezroczysty, a kulki zostaną zachwycone na ściance rurki.Następnie ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant, nie naruszając koralików. Trzymając tubkę na stojaku magnetycznym, dodaj 150 mikrolitrów bufora do mycia. Zdejmij rurkę ze stojaka magnetycznego i delikatnie przechyl ją do góry nogami, aby całkowicie zawieszyć kulki.Wróć rurkę do stojaka magnetycznego. Po dwóch minutach, gdy roztwór się rozjaśni, odrzuć supernatant. Następnie dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu roboczego trawienia białek do kulek i inkubuj rurkę PCR w cyklerze termicznym.Po inkubacji należy umieścić rurkę z powrotem na podstawce magnetycznej i ostrożnie przenieść cały supernatant do nowej rurki PCR o pojemności 0,2 mililitra. Dodaj 20 mikrolitrów roztworu oczyszczającego RNA do każdej probówki, ujemnej probówki i probówki wejściowej. Następnie podaj pipetę 160 mikrolitrów 100% etanolu.Wiruj kulki RNA, aby je ponownie zawiesić. Następnie przenieś dwa mikrolitry kulek wiążącego RNA z zawieszoną zawiesiną do każdej probówki. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym, wyrzuć supernatant i dodaj 150 mikrolitrów świeżo przygotowanego 90% etanolu.Po wyrzuceniu etanolu podaj 13 mikrolitrów buforu elucijnego do wysuszonych kulek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie ostrożnie przeniesiono cały supernatant do nowej probówki PCR wolnej od RNAse do dalszej analizy, a do oceny poziomu modyfikacji N6-metyladenozyny w transkrypcji RNA c-Myc w komórkach osteosarcoma użyto MeRIP-qPCR. wzbogacenie c-Myc przy użyciu przeciwciała anty-N6-metyladenosyny było istotnie wyższe niż w kontroli immunoglobuliny G zarówno w komórkach hFOB1.19, jak i 143B.Poziom modyfikacji c-Myc N6-metyladenosyny był istotnie wyższy w komórkach 143B niż w komórkach hFOB1.19. MeRIP-qPCR wykrywa niską ilością m6A, umożliwiając lokalizację regionalną i oferuje tanią alternatywę dla metod opartych na sekwencjonowaniu z efektywnością wzbogacania przeciwciał. Oczekuje się, że przyszłe badania będą dalej integrować MeRIP-qPCR z nanosekwencjonowaniem, aby poprawić dokładność, rozdzielczość oraz podstawową interpretację modyfikacji m6A.

merip-qpcr-assay-for-detecting-m6a-modification-levels-specific-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Prezentujemy tutaj metodę hodowli komórkowej do indukowania przemian mezenchymalno-nabłonkowych (MET) w komórkach mięsaka opartą na połączonej ektopowej ekspresji członków rodziny mikroRNA-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). Metoda ta jest odpowiednia do lepszego zrozumienia biologicznego wpływu plastyczności fenotypowej na agresywność raka i leczenie.

Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

Tutaj opisana jest syngeniczna implantacja ortotopowa, po której następuje procedura amputacji kostniakomięsaka ze spontanicznymi przerzutami do płuc, która może być wykorzystana do badań przedklinicznych biologii przerzutów i rozwoju nowych terapii.

Syngeneiczny ortotopowy kostniakomięsak Sprague Dawley Rat Model z amputacją w celu kontrolowania częstości przerzutów

Obecny protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA w celu lokalizacji lncRNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka.

Fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ dla długiej lokalizacji niekodującego RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.

Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA

Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.

Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown

Poznaj metodę MeRIP-qPCR do wykrywania modyfikacji m⁶A w transkryptach RNA w komórkach osteosarkoma. Technika ta pozwala na precyzyjną analizę poziomów metylacji z wykorzystaniem immunoprecypitacji i PCR.

Test MeRIP-qPCR do wykrywania^poziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

Przeglądaj więcej filmów