Name: Mikrofabrykacja rusztowań wielkości chipów do trójwymiarowej hodowli komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-12T19:12:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Naucz się mikrofabrykacji porowatych chipów polimerowych do trójwymiarowej hodowli komórek. Przedstawiono metody tłoczenia na gorąco oraz mikrotermoformowania z wykorzystaniem technologii śladów jonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dirkowi Herrmannowi, Oliverowi Wendtowi, Siegfriedowi Hornowi, Hartmutowi Gutzeitowi i Joergowi Bohnowi za znaczącą pomoc w zakresie spawania oparami rozpuszczalnika. 
Ponadto chcielibyśmy podziękować Michaelowi Hartmannowi, Alexowi Gerwaldowi i Danielowi Leisenowi za wsparcie techniczne.

Sekwencja procesu nr 1: Tłoczenie na gorąco, obróbka skrawaniem i spawanie oparami rozpuszczalnika
CellChip o konstrukcji sześciennej jest powielany metodą tłoczenia na gorąco lub mikro-wtryskiwania. W tym celu stosujemy mikrobobioną formę mosiężną o geometrii odwrotnej do geometrii chipa. Pojemniki – rozmieszczone w regularnej macierzy liczącej do 1156 sztuk – mają kształt sześcianu o długości krawędzi 300 µm. W przypadku tłoczenia na gorąco proces powielania przeprowadzany jest na konwencjonalnym urządzeniu WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Germany). Narzędzie składa się z dwóch okrągłych płyt metalowych. W pierwszym kroku cienka płyta PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) jest umieszczana w centrum dolnej płyty otwartego narzędzia. Mikrostrukturalny wkład formy jest zamontowany centralnie w górnej płycie. Następnie narzędzie zostaje zamknięte w celu odessania powietrza z formy i podgrzane do temperatury powyżej temperatury przejścia szklistego polimeru. Poprzez dociśnięcie płyt do siebie, lepki polimer jest wtłaczany do opróżnionych jam, aż zostaną one całkowicie wypełnione, precyzyjnie odwzorowując geometrię formy. Po ochłodzeniu narzędzia mikrostrukturalny element polimerowy może zostać wyjęty z formy. Proces ten wymaga większej masy polimeru, niż jest to faktycznie niezbędne do wypełnienia jam formy. Nadmiar polimeru tworzy warstwę pozostałości, która może ułatwiać wyjmowanie elementu z formy. Jednak aby stworzyć pory o średnicy mniejszej niż 3 µm w dnie pojemników, gruba warstwa pozostałości musi zostać odchudzona lub nawet całkowicie usunięta i zastąpiona membraną porowatą. Aby uprościć proces integracji porów, tył powielonego CellChip jest całkowicie usuwany poprzez obróbkę frezarką diamentową. W tym celu elementy są mocowane na chłodzonej płycie montażowej, a dodatkowo kruche struktury są zamrażane w wodzie dejonizowanej, aby chronić je przed uszkodzeniem.
W ostatnim kroku procesu komercyjna membrana trawiona jonowo (poliwęglan, grubość 10 µm, rozmiar porów 3 µm, 2x106 porów/cm², Pieper Filter GmbH) jest przytwierdzana do spodu macierzy pojemników, która jest teraz otwarta zarówno od góry, jak i od dołu. Proces łączenia to spawanie oparami rozpuszczalnika przeprowadzane w szczelnej, podgrzewanej komorze [Ryc. 1], składającej się z górnego tłoka i ruchomej płyty dolnej z zintegrowanym uchwytem próżniowym.4 Do czterech obrobionych CellChipsów i membran trawionych jonowo poddaje się równolegle działaniu oparów rozpuszczalnika po uprzednim odpompowaniu powietrza z komory. Następnie formowane elementy i membrany są dociskane do siebie przez górny tłok. Po krótkim czasie ekspozycji (&lt;15 s) komora jest ponownie odsysana, co usuwa rozpuszczalnik. Dzięki krótkiemu czasowi kontaktu rozpuszczany jest tylko materiał przypowierzchniowy, co pozwala uniknąć deformacji struktury rdzeniowej pod wpływem obciążenia mechanicznego. Na koniec komora zostaje otwarta, a zespawane rozpuszczalnikiem CellChipsy można wyjąć i przygotować do hodowli komórkowej [Ryc. 2].
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png" alt="Konfiguracja systemu chromatograficznego; sprzęt do eksperymentu oczyszczania białek." width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"></a> Rysunek 1.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png" alt="Mikrografia SEM mikrostrukturalnej siatki; analiza rozkładu cząstek; skala 150 μm." width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"></a> Rycina 2.
Sekwencja procesu nr 2: irradiacja ciężkimi jonami, mikrotermokształtowanie i trawienie śladów (proces SMART)
Nowy proces o nazwie SMART jest niedawno opracowaną mikrotechnologią do wytwarzania funkcjonalizowanych mikrostruktur przypominających membrany.5 Technologia ta opiera się na mikrotechnicznym procesie termoformowania, zwanym „mikrotermoformowaniem”.6,7 W tym kluczowym etapie procesu, który został zaadaptowany z makroskopowego procesu termoformowania arkuszów uwięzionych, podgrzana cienka folia polimerowa w stanie zmiękczonym i gumowo-sprężystym jest formowana pod wpływem ciśnienia gazu wewnątrz wnęki formy [Rys. 3]. W przeciwieństwie do tłoczenia na gorąco lub wtryskiwania, proces ten nie jest formowaniem pierwotnym i polimer nie ulega stopieniu. Ze względu na to, że folia jest formowana wciąż w stanie stałym z zachowaniem trwałości spójności materiału, modyfikacje materiałowe o wysokiej rozdzielczości bocznej mogą być najpierw generowane na płaskich foliach polimerowych, a następnie zachowywane podczas całego procesu formowania. Po etapie mikrotermoformowania modyfikacje te mogą być dalej selektywnie przetwarzane, np. poprzez mokrą obróbkę chemiczną.
<img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_9/Giselbrecht-Fig3.png" alt="Schemat formowania filmu polimerowego; zmiany ciśnienia i temperatury; proces tworzenia mikromanier." width="400" height="217" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3
Proces SMART w zasadzie składa się z trzech etapów:
<ol>
<li>tworzenie wzorów modyfikacji o wysokiej rozdzielczości na płaskich cienkich filmach polimerowych w procesie wstępnym</li>
<li>trójwymiarowe kształtowanie filmów poprzez mikrotermoformowanie bez utraty (wzorowanych) modyfikacji</li>
<li>proces końcowy (opcjonalny) w celu finalnej funkcjonalizacji cienkościennych części mikrostrukturalnych</li>
</ol>
Proces SMART, który obecnie stosujemy do wytwarzania porowatych CellChips, obejmuje następujące etapy procesowe [Rys. 4]. Cienka folia polimerowa, np. z poliwęglanu (Pokalon OG461Gl, 50 µm, LoFo High Tech Film GmbH, Niemcy), jest naświetlana przyspieszonymi ciężkimi jonami (takimi jak jony Xe, Au lub U) w ośrodkach akceleracyjnych GSI (Darmstadt, Niemcy) przy energiach ok. 1 GeV i fluencji rzędu 108 jonów/cm². Przenikając przez folię, każdy jon tworzy niemal prosty ślad zmodyfikowanego materiału, zwany śladem utajonym. Wstępnie przetworzone folie są następnie termoformowane w macierz 25x25 cienkościennych mikrokontenerów, z których każdy ma średnicę i głębokość 300 µm. Proces ten jest obecnie przeprowadzany na zmodyfikowanej prasie do tłoczenia na gorąco [Rys. 5], gdzie folia polimerowa jest zaciskana pomiędzy dwiema metalowymi płytami. Górna płyta jest wyposażona w mikroobrobioną formę, a dolna zawiera przyłącza ciśnienia i próżni. Folia jest wciągana do uprzednio opróżnionych z powietrza mikrownęk formy za pomocą azotu pod ciśnieniem do 5 MPa. Formowanie folii odbywa się w temperaturze bliskiej temperaturze przejścia szklistego, co zapobiega wyżarzaniu śladów.
<img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_10/Giselbrecht-Fig4.png" alt="Schemat napromieniowania ciężkimi jonami; ΔT, Δp; proces: trawienie śladów; badania naukowe." width="400" height="119" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png" alt="Układ doświadczalny do pomiaru wzbudzenia optycznego, system spektroskopowy z połączeniami światłowodowymi." width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"></a> Rysunek 5
W procesie końcowym ślady jonowe są selektywnie trawione do postaci porów poprzez zanurzenie całej mikrostruktury w odpowiednim medium trawiącym (np. 5 Mol/L NaOH, 10% w/v MeOH). Poprzez kontrolowanie czasu oraz warunków trawienia, takich jak stężenie, temperatura i specjalne dodatki (np. promotory trawienia), można dostosować rozmiar i kształt powstałych porów [Ryc. 6].
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png" alt="Obraz mikroskopowy powierzchni mikrostrukturalnej; obraz SEM; analiza tekstury powierzchni; wzór w nanoskali." width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"></a> Rysunek 6

<ol><li>Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-like+culture+system+using+microstructures%3A+influence+of+extracellular+matrix+material+on+cell+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation.</a> J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Heckele, M., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+micro+molding+of+thermoplastic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+And+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Review on micro molding of thermoplastic polymers.</a> Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+as+a+novel+technique+for+manufacturing+scaffolds+in+tissue+engineering+%28CellChips%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.</li>
<li>Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+thermoforming+of+micro+fluidic+analysis+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).</li>
<li>Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+of+flexible%2C+not+buried+hollow+microstructures+for+chip-based+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).</li>
<li>Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+tracks+in+solids%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nuclear tracks in solids.</a> , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.</li>
</ol>

Choć ugruntowane metody mikroreplikacji polimerów, takie jak mikroodlewanie wtryskowe czy tłoczenie na gorąco, nadają się do wytwarzania mikrostruktur, nie są one w rzeczywistości skuteczne w tworzeniu mikrostruktur z zintegrowaną i ściśle kontrolowaną porowatością, której wymaga CellChip. Struktury masywne wymagają np. kosztownej obróbki w celu zmniejszenia grubości ścianek przed późniejszą perforacją laserową lub konieczna jest całkowita zastąpienie ścianek membranami trawionymi ścieżkowo. 
SMART to nowa i obiecująca ...

mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Wykorzystanie technologii mikrowytwarzania jest niezbędne do tworzenia rusztowań o powtarzalnej geometrii i stałej jakości do trójwymiarowej hodowli komórek. Technologie te oferują szeroki wachlarz zalet nie tylko w procesie produkcji, ale także w różnych zastosowaniach. Na rozmiar i kształt formowanych skupisk komórek można wpływać poprzez precyzyjną i powtarzalną architekturę mikrowytworzonego rusztowania, a tym samym kontrolować długość drogi dyfuzji składników odżywczych i gazów.1 Jest to niewątpliwie użyteczne narzędzie zapobiegające apoptozie i nekrozie komórek wynikającej z niewystarczającej podaży składników odżywczych i gazów lub z niedostatecznego usuwania metabolitów komórkowych.
Nasz polimerowy chip, nazwany CellChip, ma wymiary zewnętrzne 2 x 2 cm z centralnym obszarem mikrostrukturalnym. Obszar ten jest podzielony na macierz do 1156 mikrokontenerów o typowej długości krawędzi 300 m dla konstrukcji sześciennej (chip cp- lub cf-) lub o średnicy i głębokości 300 m dla konstrukcji okrągłej (chip r).2
Do tej pory do wytwarzania chipów mikrostrukturalnych stosowano tłoczenie na gorąco lub mikroodlew wtryskowy (w połączeniu z późniejszą pracochłonną obróbką części). W zasadzie mikroodlew wtryskowy jest jedną z niewielu technik replikacji opartych na polimerach, która do tej pory umożliwia masową produkcję mikrostruktur polimerowych.3 Jednak obie techniki mają pewne niepożądane ograniczenia wynikające z przetwarzania lepkiej stopki polimeru przy tworzeniu bardzo cienkich ścianek lub zintegrowanych otworów przelotowych. W przypadku CellChipu niezbędne są cienkie warstwy dolne, aby przebić polimer i zapewnić małe pory o określonym rozmiarze, służące do dostarczania komórkom pożywki hodowlanej, np. poprzez mikrofluidyczną perfuzję pojemników.
W celu przezwyciężenia tych ograniczeń oraz redukcji kosztów produkcji opracowaliśmy nowe podejście mikrotechniczne oparte na procesie termoformowania w skali mikro. Do wytwarzania wysokoporowatych polimerowych płytek o cienkich ściankach stosujemy kombinację irradiacji ciężkimi jonami, mikrotermoformowania oraz trawienia śladów. W tym tak zwanym procesie „SMART” (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) cienkie folie polimerowe są naświetlane wysokoenergetycznymi ciężkimi pociskami o energii rzędu kilkuset MeV, co prowadzi do powstania tzw. „śladów utajonych”. Następnie folia w stanie sprężystym jest formowana w części trójwymiarowe bez modyfikowania ani wyżarzania śladów. Po procesie formowania selektywne trawienie chemiczne przekształca ostatecznie ślady w cylindryczne pory o regulowanej średnicy.

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Wykorzystanie technologii mikrofabrykacji jest warunkiem niezbędnym do stworzenia rusztowań o powtarzalnej geometrii i stałej jakości dla trójwymiarowych hodowli komórkowych...

Witajcie, nazywam się Stefan Re i pracuję w Instytucie Interfejsów Biologicznych. W poniższym artykule zaprezentujemy proces wytwarzania mikrostrukturalnego rusztowania zwanego chipem, do którego przygotowania wykorzystujemy dwie różne metody. Jest to proces wytłaczania na gorąco połączony z określonymi procesami następczymi oraz proces mikroformowania termicznego, który został niedawno opracowany w tutejszym centrum badawczym o nazwie Squi. Znajdujemy się obecnie w namiocie typu clean room, a po prawej stronie widoczna jest typowa próżniowa maszyna do tłoczenia na gorąco, której używamy do produkcji mikrostrukturalnego chipa komórkowego. W pierwszej kolejności wprowadzamy formę mikrostrukturalną.Jest on tutaj zamontowany w takiej płytce, a tutaj widać dwie formy. Forma ta została wykonana za pomocą mikroobróbki i jest wytworzona z mosiądzu. Teraz montuję formę mikrostrukturalną w urządzeniu.W procesie formowania na gorąco wykorzystujemy płyty polimerowe, takie jak ta tutaj, a do produkcji chipu komórkowego zazwyczaj stosujemy poliwęglan lub PMA. Teraz wkładamy płytę polimerową do maszyny, centralnie w obszarze płyty, i zamykamy narzędzie. Po zamknięciu maszyny komora jest ewakuowana, następnie forma lub całe narzędzie jest nagrzewane do temperatury formowania, a rozgrzany polimer jest prasowany do formy z mikrostrukturą.Następnie, po zakończeniu procedury formowania, cała forma zostaje schłodzona, a maszyna przeprowadza automatyczny proces usuwania próbki. To, co widzicie tutaj, to uformowany chip komórkowy z odlewnymi elementami – dwa chipy komórkowe oraz typowa warstwa pozostałości, która powstaje w wyniku procesu Hot and bussing. Po etapach Hot and bussing warstwa pozostałości na częściach musi zostać odchudzona, a ostatecznie całkowicie usunięta.W tym przypadku elementy formy zostają przycięte, a następnie zamrożone na tej płytce montażowej. Po zamocowaniu frezujemy pozostałą warstwę do określonej grubości elementu, aby odsłonić siatkę mikrostruktury z tyłu. Podczas procesu frezowania ścianki mikropojemnika są stabilizowane przez zamrożoną wodę.W końcowej fazie otrzymujemy dwa uformowane chipy komórkowe z wolnostojącymi siatkami pojemników MicroCon, które są otwarte z obu stron – u góry oraz u dołu, gdzie będziemy dokonywać łączenia. Następnie, po procesie frezowania, do tyłu tych otwartych macierzy pojemników MicroCon przytwierdzamy porowatą membranę. Do tylnej części otwartego chipa komórkowego przyklejamy perforowaną, dostępną w handlu membranę z poliwęglanu, aby uzyskać mikroporowate macierze pojemników.W tym celu wstawiamy do komory cienkie polimerowe membrany z wyrytymi ścieżkami. Grubość membran mieści się w zakresie około 10 mikronów, a następnie na ich wierzchu umieszczamy chip komórkowy. Następnie zamykamy tę wnękę, a w pierwszym kroku komora zostaje odpompowana.Następnie wstrzykujemy odparowany rozpuszczalnik, aby rozpuścić powierzchnię polimeru, a poprzez wywarcie nacisku na ten stos, membrana zostaje przytwierdzona do chipa komórkowego. W ostatnim kroku komora jest opróżniana, a następnie wyjmujemy gotowy chip komórkowy. Opracowaliśmy niedawno nową technikę wytwarzania chipów opartą na procesie termoformowania, która została dostosowana do mikroskali, dlatego nazwaliśmy ją mikrotermoformowaniem.Do wytwarzania porowatej membrany wykorzystujemy folie polimerowe naświetlone przyspieszonymi ciężkimi jonami. Proces ten odbywa się we współpracy z ośrodkiem Unilog, gdzie ciężkie jony tworzą ślady potykowe w folii polimerowej, przenikając całkowicie przez warstwę polimeru. Podczas procesu termoformowania ślady te zostają zachowane, co prowadzi do powstania porów.Następnie, po procesie formowania, trawione są te ścieżki w celu uzyskania porów o określonej wielkości. Po prawej stronie widać przystosowaną maszynę — urządzenie do wytłaczań na gorąco, przystosowane do tego procesu mikrotermicznego formowania.Narzędzie składa się głównie z trzech części: płyty górnej i płyty dolnej. Posiadają one złącza do ciśnienia gazu i ewakuacji, a trzecią częścią jest element pełniący rolę pokrywy. W pierwszym kroku umieszczamy cienką błonę o grubości w zakresie od około 50 do 100 µm.Następnie zamykamy narzędzie i przechodzimy do drugiego kroku. Komora utworzona przez te dwie płyty oraz górną ściankę zostaje odessana. Po ewakuacji powietrza folia polimerowa jest dociskana między tymi dwiema płytami, a następnie podgrzewamy ją do temperatury formowania. Formowanie.Temperatura znajduje się tutaj w zakresie temperatury przejścia szklistego, co oznacza, że polimer nie jest stopiony, lecz znajduje się w stanie sprężystości białkowej lub w stanie sprężystości gumowej. W kolejnym kroku przykładamy ciśnienie gazu. Jako gaz wykorzystujemy azot, który powoduje rozciągnięcie gumopodobnej błony polimerowej do uprzednio ewakuowanych mikrootform.Po tym etapie formowania całe narzędzie zostaje schłodzone, a następnie otwarte. Na koniec mikrostrukturalna pianka polimerowa jest wyjmowana z formy ręcznie. Zaletą tego nowego procesu jest możliwość znaczącego ograniczenia liczby etapów procesowych w porównaniu do standardowego procesu mikro-wtryskiwania lub procesu gorącego tłoczenia.Po termoformowaniu ciężkich, prasowanych żelazkiem folii polimerowych, selektywnie trawimy ślady w celu uzyskania porów o zdefiniowanej wielkości. W tym celu wykorzystujemy prosty układ z szklanego naczynia; ślady są trawione wodorotlenkiem sodu, przy delikatnym mieszaniu i podgrzewaniu do temperatury około 60 °C. Procedura trawienia trwa od jednej do kilku godzin, w zależności od pożądanej wielkości porów.Oto dwa gotowe produkty: chip komórkowy zgrzany i wyoblokowany z membraną mikroporowatą na tylnej ściance formowanego chipu komórkowego oraz w mojej lewej ręce termoformowany, cienkościenny, elastyczny chip komórkowy. Przed użyciem w hodowlach komórkowych zostają one oczyszczone i wysterylizowane poprzez naświetlanie gamma.

microfabrication-chip-sized-scaffolds-for-three-dimensional-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrofabrykacja podłoży wielkości chipu do trójwymiarowej hodowl  komórek

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

W przeszłości wiele systemów hodowli in vitro – głównie hodowle monowarstwowe – często obarczonych było wadą polegającą na tym, że zróżnicowane komórki pierwotne miały stosunkowo krótki czas życia i ulegały dedyferencjacji podczas hodowli. W konsekwencji większość ich funkcji swoistych dla danego organu była szybko utracona. Aby zatem odtworzyć lepsze warunki dla tych komórek in vitro, wprowadzono modyfikacje i adaptacje do konwencjonalnych hodowli monowarstwowych.

Wywiad: Bioreaktory i rusztowania 3D z modyfikowaną powierzchnią w badaniach nad komórkami macierzystymi

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Pokazujemy nowatorską metodę konstruowania jednokomórkowego trójwymiarowego (3D) montażu bez sztucznego rusztowania.

Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje wytwarzanie rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych urządzeń do hodowli komórek na poziomie narządów do rekapitulacji funkcjonalności na poziomie narządów in vitro.

Skalowalna produkcja rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych układów narządowych

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Naucz się mikrofabrykacji porowatych chipów polimerowych do trójwymiarowej hodowli komórek. Przedstawiono metody tłoczenia na gorąco oraz mikrotermoformowania z wykorzystaniem technologii śladów jonowych.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Przeglądaj więcej filmów