Spektroskopowe obrazowanie cząsteczek DNA z użyciem kontrastu wewnętrznego

Nasze badania przedstawiają pierwszy protokół pomiaru wewnętrznych fluorescencjowych widm cząsteczek DNA, umożliwiający badanie ich natywnych właściwości optycznych oraz cech związanych z potwierdzeniem sekwencji. Protokół ten wykorzystuje endogenną fluorescencję do spektroskopowego obrazowania DNA, unikając oznakowania zakłóceń indukowanych, błędów wiązań oraz niespójnej gęstości oznakowanej w istniejących metodach. Na początek rozpuszcz próbkę DNA w wodzie dejonizowanej bez nukleazy do końcowego stężenia 100 milimolarów.

Przygotuj pięć mikrolitrów aliquotów roztworu DNA, aby zminimalizować powtarzające się cykle zamarzania i rozmrażania. Przechowuj dodatkowe probówki z roztworem w stanie 4 stopni Celsjusza. Używając chusteczki laboratoryjnej, delikatnie wyczyść szkiełko.

Pipeta nałóż pięć mikrolitrów roztworu DNA o pojemności 100 milimolowych na świeżo oczyszczone szkiełko i pozwól próbce wyschnąć przez jedną do trzech godzin, aby utworzyć żel DNA. W okapie oparowym przygotuj bufor beta-merkaptoetanolowy lub bufor obrazowania DABCO, aby wspierać stochastyczne przełączanie zdjęć cząsteczek DNA. Pipetą nałóż pięć mikrolitrów buforu obrazującego na żel DNA i załóż pokrywę na próbkę.

Jeśli w środku przykrytej próbki znajdują się pęcherzyki, użyj pęsety, aby je usunąć. Uzyskaj sztucznie wykonaną matrycę nanodziur zawierającą otwory o średnicy 100 nanometrów, rozmieszczone co cztery mikrometry, ułożone w osiem rzędów i pięciu kolumnach. Włącz system sSMLM i włóż filtry wąskiej pasma bezpośrednio przed kamerę.

Umieść próbkę kalibracyjną pod mikroskopem i włącz lampę mikroskopu, aby rozświetlić próbkę. Ustaw czas naświetlania na 200 milisekund dla wszystkich filtrów, ale zmień go na 2 000 milisekund dla filtra 750 nanometrów. Przejdź do "nabycia" i szybkiego poklatkowania, aby dostosować liczbę klatek do 10 dla każdego filtra.

Po kalibracji załaduj próbkę żelu DNA na podium mikroskopu tak, że strona pokrywy jest skierowana do obiektywu, i otwórz oprogramowanie kamery do akwizycji danych. Zidentyfikuj odpowiednią pozycję Z za pomocą automatycznego systemu śledzenia ostrości i reguluj ostrość, aż pojawi się wyraźne stochastyczne miganie. Upewnij się, że obiektyw nie dotyka krawędzi ślizgowej pokrywy, aby zapobiec przeciekowi bufora do oleju immersyjnego i zakłócaniu prowadzenia.

Uzyskaj około 10 000 do 30 000 klatek z pożądaną mocą oświetlenia i czasem naświetlenia 30 milisekund. Po przejęciu danych pozwól oprogramowaniu zapisywać dane domyślnie w formacie nd2. Szklany preparat wyrzuć do zatwierdzonego kosza na odpady przeznaczonego na tłuczone szkło lub ostre przedmioty.

Wszystkie pozostałe bufory wyrzuć do wyznaczonego pojemnika na ciecz chemiczną zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego. Otwórz Fiji i użyj wtyczki bio formats, aby załadować pobrany surowy stos obrazów próbki DNA. Wybierz obraz, a następnie stosy, Z Project i wybierz minimalną intensywność jako typ projekcji, aby wygenerować minimalną projekcję surowego stosu obrazów.

Wybierz kalkulator obrazów i odejmij minimalną projekcję od surowego stosu obrazów. Zapisz tło odejmowany zbiór danych jako plik TIF do analizy spektralnej. Następnie wykonaj identyfikację lokalizacji na stosie obrazów zerowego rangi za pomocą wtyczki ThunderSTORM w wersji 1.3.

Ustaw próg na 1,2 razy falę odchylenia standardowego. F1, dopasowując promień do trzy, oraz sigma do 1,5, aby odtworzyć obraz rzędu zerowego i wyodrębnić współrzędne zdarzenia emisyjnego. Dla przyciętego stosu obrazów zerowego zerowego wybierz wtyczkę, następnie ThunderSTORM i przeprowadź analizę.

Do przetwarzania danych kalibracyjnych i uzyskania zależności między przesunięciami poziomymi a pionowymi oraz długościami fal używaj Fiji oraz otwartego oprogramowania RainbowSTORM z wersją MATLAB nowszą niż 2020b. Wykonaj identyfikację lokalizacji na obrazach kalibracyjnych pięciu długości fal za pomocą wtyczki ThunderSTORM. Ustaw próg na pięć razy odchylenie standardowe, falę.

F1, dopasowując promień do trzech, oraz sigma do 1,5 do rekonstrukcji lokalizacji nanodziur rzędu zerowego oraz odpowiadających lokalizacji widmowych pierwszego rzędu. Uzyskaj średni obraz każdego kalibracyjnego i dostosuj próg w zakresie od pięciu do dziesięciu razy względem fali odchylenia standardowego. F1 do uzyskania 80 lokalizacji dla każdego obrazu kalibracyjnego.

Uruchom RainbowSTORM i kliknij przeglądaj w kalibracji spektralnej, aby załadować pliki CSV dla każdej długości fali kalibracyjnej. Następnie kliknij zapisz plik kalibracyjny, aby go przepisać. Użyj spersonalizowanego skryptu Pythona w wersji 3.11.7, aby wyodrębnić pełne spektrum danych.

Następnie ustaw właściwe ścieżki plików w skrypcie Pythona dla stosu obrazów odejmowanych w tle w formacie TIF z poprzedniego kroku odejmowania tła. Ustaw ścieżkę pliku dla pliku CSV lokalizacyjnego wyprodukowanego w etapie analizy lokalizacji oraz pliku kalibracyjnego w formacie MAT wygenerowanego w kroku kalibracyjnym. Następnie ustaw przesunięcie poziome na 925–984 piksele dla danych o długości 532 nanometrów uzyskanych za pomocą 3D DWP odpowiadającego oknu spektralnemu od 525 do 750 nanometrów, aby zapewnić zasięg poza zakresem filtrów 590–650 nanometrów.

Dostosuj przesunięcie pionowe do 23 pikseli zarówno dla danych 488 nanometrów, jak i 532 nanometrów uzyskanych za pomocą 3D DWP na podstawie spektralnej krzywej kalibracji uzyskanej za pomocą RainbowSTORM. Na koniec linearyzuj widmo nieliniowe za pomocą dopasowania wielomianów trzeciego rzędu do dalszej analizy porównań i klasyfikacji. Wykonano kalibrację spektralną, umożliwiającą pomiar odpowiadających poziomych i pionowych przesunięcia pikseli między obrazami zerowego a pierwszego rzędu.

Pozwalało to na odwzorowanie krzywej kalibracyjnej między pozycją piksela a długością fali. Nieliniowe i przekształcone widma emisji liniowej pod wzbudzeniem 532 nanometrów uzyskano dla GC alter, która odnosi się do rodzaju dwuniciowej cząsteczki DNA. Zielona krzywa reprezentowała średnie spektrum.

Nieliniowe i przekształcone spektra emisji liniowej A10C10, rodzaju cząsteczki DNA o pojedynczych niciach, zostały uzyskane pod wzbudzeniem o średnicy 488 nanometrów, gdzie niebieska krzywa reprezentuje średnie widmo. Protokół ten pozwala badaczom mierzyć wewnętrzne spektra fluorescencyjne syntetyzowanych cząsteczek pojedynczych i dwuniciowych DNA za pomocą spektroskopowego obrazowania superrozdzielczego. Precyzyjne zlokalizowanie właściwej pozycji Z jest kluczowe, ponieważ próbki żelu DNA nie mają informacji strukturalnych i wymagają uważnej koncentracji, aby obserwować stochastyczne mrugania.

Przyszłe prace mogą obejmować pomiar wewnętrznej fluorescencji RNA i białka, integrację modeli obliczeniowych do przewidywania sekwencji oraz obrazowania chromatyny wolnej od oznakowania.