Name: Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych włókien mięśniowych z mięśnia soleus myszy, która zachowuje ich integralność i umożliwia ekspansję satelitarnych komórek macierzystych z minimalnym zanieczyszczeniem fibroblastów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez ustanowione stypendia uniwersyteckie na rzecz stworzenia innowacji w dziedzinie nauki i technologii (JST, grant nr JPMJFS2139 dla T.H.) oraz granty od Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 23H00457 przyznane N.L.F., 20J12849 dla Y.Mi., 24K22254 dla Y. Ma). To badanie było również wspomagane przez Grant Badawczy Rządu Metropolitalnego Tokio [R2-2] dla Y.Ma., N.L.F., oraz fundusz badań strategicznych TMU na projekt innowacyjny [R3] dla N.L.F. Dzięki Yasuro Furuichi za jego rady i przydatne komentarze.

Wszystkie zwierzęta były trzymane w obiekcie hodowli Uniwersytetu Metropolitalnego w Tokio (Numery zezwoleń: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Wszystkie zwierzęta były utrzymywane w warunkach wolnych od określonych patogenów (SPF). Obsługa zwierząt i procedury eksperymentalne zastosowane w tym badaniu ściśle przestrzegano wytycznych Komitetu ds. Bezpieczeństwa i Etyk Uniwersytetu Metropolitalnego w Tokio.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Noś rękawiczki przez cały czas. W 25 mL probówce do wirowania, przygotuj 0,5% roztworu kolagenazy typu I w wysokoglukozynowym Dulbecco’s Zmodyfikowanym Podstawowym Podłożu Komórkowym (DMEM) + GlutaMAX z 1% zawiesiną penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B (AB). Po dokładnym rozpuszczeniu kolagenazy (lekko stuknij probówkę, jeśli to konieczne), wysterylizuj roztwór przez przefiltrowanie przez filtr o niskiej wiązce białek 0,22 μm. 
	UWAGA: 2,5 mL roztworu kolagenazy wystarcza na dwa mięśnie podgrzebieniowe (jeden mysz).</li>
	<li>Przygotuj 10 mL 5% surowicy wołowej (BSA) w buforowanym roztworze fosforanowym (PBS). Inaktywuj w temperaturze 60 °C przez 30 min, następnie przefiltruj roztwór przez filtr o niskiej wiązce białek 0,22 μm. 
	UWAGA: 5% BSA w roztworze PBS można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 10 dni.</li>
</ol>
2. Sekcja mięśnia podgrzebieniowego
<ol>
	<li>Ułóż sprzęt do sekcji mięśni (Rysunek 1A).</li>
	<li>Znieczulić myszy C57BL/6 poprzez dożylne podanie mieszaniny trzech środków znieczulających (0,5 mL/g masy ciała) zawierającej 1 mg/mL chlorowodorku medetomidyny, 5 mg/mL midazolam i 5 mg/mL tartratu butorfanolu, a następnie wyeliminować myszy poprzez uduszenie szyjne.</li>
	<li>Wykonaj kolejne cięcia skóry na tylnej kończynie i ściągnij skórę. Usuń powierzchniową powięź.</li>
	<li>Oddziel ścięgno mięśnia podgrzebieniowego (PLA) od ścięgna mięśnia łydkowego (GAS) i podgrzebieniowego (SOL). Delikatownie usuń PLA, ciągnąc za jego ścięgno (Rysunek 1B).</li>
	<li>Przetnij ścięgna mięśnia łydkowego (GAS) i podgrzebieniowego (SOL) i odsłoń mięśnie. Wpraw igłę w szczelinę między proksymalnym ścięgnem GAS i SOL (Rysunek 1C).</li>
	<li>Ostrożnie przesuń igłę w kierunku dystalnym, aby oddzielić mięsień podgrzebieniowy (SOL) i łydkowy (GAS) (Rysunek 1D). Umieść drugą igłę obok stawu skokowego, aby ustabilizować tylną kończynę i zapobiec ruchowi podczas sekcji.</li>
	<li>Przetnij ścięgna z strony GAS (Rysunek 1E).</li>
	<li>Ułóż SOL na GAS. Ostrożnie wyreguluj pozycję SOL, aby odsłonić proksymalne ścięgno i przetnij je za pomocą pary mikro szczypiec (Rysunek 1F).</li>
	<li>Ułóż SOL na stole sekcyjnym i usuń pozostałą część ścięgna (Rysunek 1G). 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalny; pozostała część ścięgna nie wpływa na wynik.</li>
</ol>
3. Trawienie mięśnia podgrzebieniowego
<ol>
	<li>Przenieś cały mięsień podgrzebieniowy do probówki 25 mL zawierającej przygotowaną 0,5% roztwór kolagenazy. Inkubator w temperaturze 37 °C przez 130 min. 
	UWAGA: Co 15-20 min. można ręcznie mieszać próbkę, aby lekko oddzielić włókna i wspierać aktywność kolagenazy.</li>
</ol>
4. Izolowanie pojedynczych włókien pod mikroskopem stereoskopowym
<ol>
	<li>Przetnij dwie pipety Pasteura, aby utworzyć jedną z szerokim otworem i jedną z wąskim otworem (Rysunek 2A). Pod płomieniem wysterylizuj i wygładź otwory, aby uniknąć uszkodzenia mięśni podczas tryturowania.</li>
	<li>Aby zapobiec przyleganiu włókien podczas izolacji, pokryj pipety Pasteura i trzy 50 mm naczynia Petriego 5% BSA/PBS. 
	UWAGA: Mikroskop stereoskopowy (Rysunek 2B) był używany przez cały proces izolacji.</li>
	<li>Po trawieniu mięśni przelej nadmiar roztworu kolagenazy i przenieś podgrzebieniowy do pierwszego naczynia zawierającego DMEM z 1% AB (Rysunek 2C).</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura o szerokim otworze delikatnie przemyj w górę i w dół, aby oddzielić włókna (Rysunek 2D).</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura o wąskim otworze przenieś całe pojedyncze włókna wzdłuż długości mięśnia do drugiego naczynia. Skorzystaj z okazji, aby usunąć zanieczyszczenia i/lub skurczone włókna (Rysunek 2E,F).</li>
	<li>Przenieś wysokiej jakości (o pełnej długości/nienaruszone) pojedyncze włó

<ol><li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18%E2%80%9388+yr%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeletal+muscle+satellite+cell%3A+The+stem+cell+that+came+in+from+the+cold%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold.</a> J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).</li>
<li>Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+and+myogenic+progression+in+skeletal+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells.</a> J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Günther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+characterisation+of+the+molecular+signature+of+quiescent+and+activated+mouse+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5205(2009).</li>
<li>Halevy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+Pax7+expression+during+myogenesis+in+the+posthatch+chicken+establishes+a+model+for+satellite+cell+differentiation+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal.</a> Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).</li>
<li>Biressi, S., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+muscle+satellite+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the muscle satellite cell population.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).</li>
<li>Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+muscle+satellite+cells+are+equal%2C+but+are+some+more+equal+than+others%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others.</a> J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).</li>
<li>Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+reporter+mouse+models%3A+A+pocket+guide+for+satellite+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Transl+Myol%22%5BJournal%5D)">Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research.</a> Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Pette, D., Staron, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms%2C+muscle+fiber+types%2C+and+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions.</a> Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).</li>
<li>Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+polymorphisms+and+fiber-type+composition+of+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+differences+between+actomyosin+ATPase+of+slow+and+fast+mammalian+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle.</a> Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).</li>
<li>Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+scavengers+in+providing+non-material+contributions+to+people%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Indic%22%5BJournal%5D)">Role of scavengers in providing non-material contributions to people.</a> Ecol Indic. 117, 11(2020).</li>
<li>Sullivan, S. M., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+mitochondrial+volume+density+and+capillarity+in+hamster+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles.</a> Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).</li>
<li>Fujita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+lipid+metabolism+and+capillary+density+of+the+skeletal+muscle+following+low-intensity+exercise+training+in+a+rat+model+of+obesity+with+hyperinsulinemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia.</a> PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).</li>
<li>Narusawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+myosin+in+developing+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Slow myosin in developing rat skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).</li>
<li>Faerman, A., Shani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+the+regulatory+myosin+light+chain+2+gene+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis.</a> Development. 118 (3), 919-929 (1993).</li>
<li>Denardi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2x-myosin+heavy+chain+is+coded+by+a+muscle+fiber+type-specific+and+developmentally+regulated+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene.</a> J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).</li>
<li>Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+type+and+fiber+type+specificity+in+muscle+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).</li>
<li>Talbot, J., Maves, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+type%3A+Using+insights+from+muscle+developmental+biology+to+dissect+targets+for+susceptibility+and+resistance+to+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).</li>
<li>Celegato, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+protein+and+transcript+profiles+of+FSHD+patient+muscles+correlate+to+the+D4Z4+arrangement+and+reveal+a+common+impairment+of+slow+to+fast+fibre+differentiation+and+a+general+deregulation+of+MyoD-dependent+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes.</a> Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).</li>
<li>Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+and+identifying+satellite+cell-opathies+within+muscular+dystrophies+and+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies.</a> Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).</li>
<li>Gallagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+84-days+of+bedrest+and+resistance+training+on+single+muscle+fibre+myosin+heavy+chain+distribution+in+human+vastus+lateralis+and+soleus+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles.</a> Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).</li>
<li>Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+composition+in+patients+with+traumatic+cord+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Rehabil+Med%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion.</a> Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).</li>
<li>Shenkman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+slow+to+fast%3A+Hypogravity-induced+remodeling+of+muscle+fiber+myosin+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype.</a> Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).</li>
<li>Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+skeletal+muscles+to+gravitational+unloading+and%2For+reloading%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading.</a> J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).</li>
<li>Higashino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+in+muscle+atrophy+and+muscle+fiber+type+conversion+after+spinal+cord+transection+and+peripheral+nerve+transection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroeng+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats.</a> J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).</li>
<li>Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+muscle+fibers+are+preferentially+affected+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy.</a> Cell. 52 (4), 503-513 (1988).</li>
<li>Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+decrease+of+IIx+myosin+heavy+chain+transcripts+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy.</a> Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).</li>
<li>Rafael, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+and+utrophin+influence+fiber+type+composition+and+post-synaptic+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure.</a> Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).</li>
<li>Kotelnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+to+meta-analysis+of+microarray+datasets+reveals+muscle+remodeling-related+drug+targets+and+biomarkers+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy.</a> PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).</li>
<li>Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathomechanisms+and+biomarkers+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%3A+Roles+of+DUX4+and+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7.</a> EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).</li>
<li>Lassche, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomeric+dysfunction+contributes+to+muscle+weakness+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).</li>
<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).</li>
<li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li>
<li>Collins, C. A., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+grafting+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and grafting of single muscle fibres.</a> Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).</li>
<li>Ravenscroft, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+flexor+digitorum+brevis+myofiber+culture+system%E2%80%94a+more+mature+muscle+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).</li>
<li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).</li>
<li>Smith, L. R., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+explants%3A+Ex-vivo+models+to+study+cellular+behavior+in+a+complex+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment.</a> Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).</li>
<li>Tarpey, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+utilization+of+the+flexor+digitorum+brevis+for+assessing+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function.</a> Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).</li>
<li>Omairi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dystrophin-associated+glycoprotein+complex+composition+by+the+metabolic+properties+of+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres.</a> Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).</li>
<li>Moyle, L. A., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+immunostaining+of+skeletal+muscle+fibres+to+study+myogenic+progression+in+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells.</a> Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).</li>
<li>Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+transcriptomes+of+EDL%2C+psoas%2C+and+soleus+muscles+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice.</a> BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).</li>
<li>Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+single+myofibers+from+Mus+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus.</a> Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Pierwsza kluczowa wskazówka do izolowania dużej liczby włókien mięśniowych z mięśnia płaskiego łydki (SOL) to zachowanie integralności strukturalnej mięśnia podczas dysekcji. Jeśli epimyzjum SOL zostanie rozerwane lub jeśli mięsień zostanie siłkowato wyciągnięty, szczególnie wzdłuż jego osi podłużnej, podczas dysekcji, wydajność izolacji zostanie poważnie naruszona. Błędy tej dysekcji są zwykle łatwe do zidentyfikowania później. Rzeczywiście, po trawieniu kolagenazą, mięsień staje się jednolicie skurczona i tworzy białą, zwartą masę. W takich warunkach, tylko bardzo niewielka liczba żywotnych włókien może zostać rozdzielonych.
Drugim decydującym czynnikiem dla pomyślnej izolacji płaskiego łydki jest wydajność trawienia kolagenazą typu I. Kiedy kolagenaza działa optymalnie, podczas pierwszych 10 sesji płukania można uzyskać około 100–200 włókien płaskiego łydki. W przeciwieństwie do tego, gdy trawienie jest nieoptymalne, nawet po pierwszych 20 płukaniach, może zostać uwolnionych mniej niż 50 włókien. Aby uzyskać wyższą wydajność włókien, wymagane jest bardziej energiczne płukanie i dodatkowe cykle płukania. Jednakże, ponieważ włókna SOL są wyjątkowo kruche, często prowadzi to do kurczenia się włókien podczas płukania.
Do ustanowienia czystej kultury pierwotnych mioblastów pochodzących z SOL, ponownie trawienie kolagenazą odgrywa kluczową rolę. Gdy trawienie jest wydajne, mniejsza liczba włókien pozostaje przyczepionych do pozostałego tkanki i przeniesienie włókien do środowiska kulturowego powoduje minimalne skażenie fibroblastami. W przeciwieństwie do tego, gdy SOL jest słabo strawiony, dysocjatowane włókna pozostaną przyczepione do pozostałej tkanki, zanieczyszczając kulturę mioblastów fibroblastami. Badacze powinni szukać typowych znaków skażenia fibroblastami w zasiewianych próbkach komórek; obejmują one znacznie większy rozmiar komórek i rozległe wypustki cytoszkieletu, w porównaniu z znacznie mniejszymi, wrzecionowatymi komórkami satelitarnymi w przyczepionych naczyniach pokrytych Matrigel. Jeśli wystąpi skażenie, badacze mogą poddać komórki krokom pre-plating, jak opisano gdzie indziej45. Krótko mówiąc, SC są kultywowane przez 3 dni po izolacji, a następnie trypsynowane i krótko pre-plating na pokrytych kolagenem naczyniach. Podczas 15–30 min inkubacji, fibroblasty przywierają, podczas gdy SC pozostają w zawieszeniu i są przenoszone do świeżych naczyń pokrytych Matrigel.
Jak wspomniano powyżej i zgodnie z naszym doświadczeniem, włókna SOL są dłuższe i bardziej kruche niż włókna z mięśnia przedłużacza długiego palców (EDL) i mięśnia zginacza krótkiego palców (FDB). To sprawia, że przenoszenie włókien za pomocą pipet Pasteur jest wyzwaniem. Istotne jest aspirowanie włókien wzdłuż ich osi podłużnej, a nie ciągnięcie ich od środka; w przeciwnym razie włókna składają się i kurczą pod wpływem stresu. Oprócz decydujących czynników, które bezpośrednio decydują o sukcesie izolacji włókien, kilka dodatkowych kroków technicznych jest istotne dla poprawy wydajności włókien płaskiego łydki. Jednym z nich jest pokrycie wszystkich pipet Pasteur, naczyń i probówek kolekcjonerskich 5% BSA. Zapobiega to przywieraniu świeżo dysocjowanych włókien mięśniowych do powierzchni, zapobiegając tym samym zginaniu włókien i późniejszemu kurczeniu się. Zaleca się przygotowanie nowych, wysterylizowanych w cieple, pokrytych BSA pipet Pasteur za każdym razem, gdy wyizolowane są próbki mięśniowe. Alternatywnie, badacze mogliby przygotować zestaw pipet Pasteur do długotrwałego użytku. Jeśli tak, każdorazowo wysterylizować w cieple i świeżo pokryć BSA przed użyciem.
Konwencjonalny protokół izolacji pojedynczych włókien mięśniowych był pierwotnie zoptymalizowany dla mięśni glikolitycznych, takich jak FDB i EDL37. Jednakże, mięśnie utleniające, takie jak SOL, są strukturalnie odmienne. Analizy transkryptomowe wykazały, że ekspresja genów związanych z zewnątrzkomórkową matrycą (ECM) różni się między SOL a EDL46, w tym geny takie jak dystrofina, białko łączące cytoszkielet mięśnia szkieletowego44. W konsekwencji, standardowa wartość trawienia mięśnia EDL z 0,2% (2 mg/mL) kolagenazą przez 60–90 min nie jest optymalna dla mięśni SOL, co prowadzi do zwartych pakietów włókien lub skurconych włókien po trawieniu. W niniejszym badaniu zoptymalizowano kilka kluczowych kroków, aby dostosować protokół dla utleniających mięśni SOL. Poprzez dostosowanie stężenia kolagenazy typu I do 0,5% (5 mg/mL), wydłużenie okresu inkubacji do 130 min i minimalizowanie stresu mechanicznego podczas płukania, można spójnie uzyskać 300–500 nienaruszonych włókien z jednego myszy. W porównaniu z EDL, liczba włókien i wydajność próbek SOL pozostaje mniejsza (EDL może dać > 500 włókien); niemniej jednak, liczba włóki

Mięsień szkieletowy jest tkanką najbardziej obfitą w organizmie ludzkim, stanowiącą około 40–50% całkowitej masy ciała1. Mięsień szkieletowy pełni funkcję zbiornika energii w postaci glikogenu. Podczas narażenia na zimno dostarcza ciepła poprzez termogenezę i ważnie zapewnia ruch. Mięsień szkieletowy składa się z wielojądrowych, post-mitotycznych miofibrili. Aby utrzymać dojrzewanie i naprawę mięśni, nowe jądra mięśniowe są generowane przez komórkę macierzystą naszych mięśni szkieletowych, komórkę satelitarna (SC). Komórki SC znajdują się na obwodzie włókien mięśniowych powstałych po urodzeniu2,3,4. Komórki SC są identyfikowane przez czynnik transkrypcyjny Pax7, który jest ekspresowany zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji3,5. Po uszkodzeniu lub stymulacji hipertroficznej, komórki SC aktywują się i zwiększają ekspresję MyoD, wchodzą w program miogenezy, proliferują i ostatecznie łączą się z istniejącymi lub nowo tworzącymi się miofibrilami, aby przywrócić funkcję mięśniową6,7,8. Komórki SC są heterogeniczne pod względem ich zdolności macierzystych, pochodzenia embriologicznego (somitycznego vs. niesomytycznego), etapu wzrostu po urodzeniu (młode vs. stare) oraz składu mięśni (włókna szybkie vs. powolne)9,10,11.
W zależności od regionu ciała, mięsień szkieletowy jest dostosowany do zaspokojenia energetycznych i funkcjonalnych potrzeb danego regionu. Ta heterogeniczność włókien mięśniowych jest możliwa dzięki ich kurczliwości i zdolności oksydacyjnej. Rzeczywiście, włókna mięśniowe składają się z powolnych, utleniających włókien kurczliwych (oznaczanych jako typ I i IIa) i szybko kurczących się włókien glikolizy (oznaczanych jako IIx, u gryzoni IIb)12,13. Ta piękna, funkcjonalna mozaika rodzajów włókien umożliwia nam swobodne poruszanie się w naszym codziennym życiu. Na przykład, mięśnie pomagające utrzymać postawę ciała, takie jak mięsień łydkowy (SOL) i mięsień prostownik kręgosłupa, są w stanie przewlekłego, niskiego poziomu aktywacji i zawierają wysoki udział powolnych, utleniających włókien typu I i IIa. W przeciwieństwie do nich, krótkie, ale szybko działające mięśnie, takie jak mięsień rozciągacz długi palców, są głównie zbudowane z glikolizy typu IIx i typu IIb. Kompozycja włókien nie jest jednak stała; raczej, włókna mięśniowe są dynamicznymi strukturami zdolnymi do przejścia od szybko kurczących się do powolnych i odwrotnie, w zależności od wymagań funkcjonalnych nałożonych na nie. Różnica w kurczliwości rodzajów włókien jest możliwa dzięki zawartości białka miozyny. Jest to główne białko w mięśniach szkieletowych, zbudowane z izoform łańcuchów lekkich i ciężkich miozyny12,14.
Wewnątrz sarkomeru (najmniejsza funkcjonalna jednostka mięśnia, która generuje siłę), głowy miozyny i aktyny wchodzą w interakcje tworząc strukturę znaną jako mostek poprzeczny. Poprzez hydrolizę ATP, energia jest uwalnianą przez cykliczne oddziaływania miozyny i aktyny15,16. Ciężka łańcuch miozyny (MyHC) jest najbardziej odpowiednim markerem do identyfikacji rodzajów włókien12,13. W zależności od izoformy MyHC, która jest ekspresowana, szybkość kurczenia się mięśni będzie różna. Jak wspomniano, włókna typu I są powolnymi włóknami utleniającymi, w przeciwieństwie do włókien typu II. Grupy mięśni dominujące typu I zawierają większą obfitość enzymów utleniających, są bogatsze w mitochondria i mają gęstą sieć naczyń krwionośnych do perfuzji mięśni17,18 (przypomina to biegacza maratońskiego). Włókna typu I są kodowane przez gen MYH713,19. Włókna typu II są szybko męczące, zawierają dużą proporcję enzymów glikolizy i mają większą maksymalną prędkość skracania, co sprawia, że są idealne na krótkie, energetyczne ruchy (przypomina to kulturystę). Włókna typu II dla typu IIa, IIx i IIb (u gryzoni) są kodowane przez geny MYH2, MYH1 i MYH4 odpowiednio20,21. Nic dziwnego, że jakakolwiek patofizjologiczna obrażka, która wpływa na integralność mięśni, spowoduje zmianę składu rodzajów włókien i prowadzić do szkodliwych efektów na funkcję mięśni, potencjalnie obniżając jakość życia. W rzeczywistości, wiele dystrofii mięśniowych rozpoczyna się albo w komórkach satelitarnych (satelitarne-

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol tartrate</td><td>Meiji Yakuka Co., Ltd</td><td>711-12</td><td>Nazwa produktu: Vetorphale injection</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>US Biological</td><td>C3999</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington</td><td>M9B2717</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-free DMEM</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569</td><td></td></tr><tr><td>High-glucose DMEM+GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Life technology</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Low-protein binding filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride</td><td>Kyoritsu Seiyaku Co., Ltd</td><td>8816</td><td>Nazwa produktu: Dorbene Injection</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>4987211762100</td><td>Nazwa produktu: Dormicum Injection</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspension</td><td>Wako</td><td>161-23181</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S stain solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24-3875-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (25 mL)</td><td>IWAKI</td><td>2362-025</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>IWAKI</td><td>5 3/4 IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin dishes (100-mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020-100</td><td>Określane jako Petri dish w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Anbitodies for immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-32723</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Myosin Heavy Chain</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB4470</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>AB-528428</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-MyoD</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-760</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anbitodies for immunoblotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated Anti-mouse IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA931</td><td>1:1000/ kończąca peroksydazą koniugatu</td></tr><tr><td>HRP-conjugated Anti-Rabbit IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA934</td><td>1:1000/ kończąca peroksydazą koniugatu</td></tr><tr><td>Mouse Anti-MyHC I</td><td>Sigma</td><td>M8421</td><td>1:1000/ Myosin Heavy Chain I</td></tr><tr><td>Mouse Anti-MyHC II</td><td>Sigma</td><td>M4276</td><td>1:1000/ Myosin Heavy Chain II</td></tr><tr><td>Mouse Anti-PGC-1&alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-517380</td><td>1:1000/ Pparg coactivator 1 alpha</td></tr><tr><td>Mouse Anti-&alpha;-tubulin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3873</td><td>1:1000/ Alpha tubulin</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-COXIV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#4850</td><td>1:1000/ Cytochrome c oxidase IV</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2218</td><td>1:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GLUT4</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2213</td><td>1:1000/ Glucose Transporter 4</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-&beta;-actin</td><td>Proteintech</td><td>20536-1-AP</td><td>1:2000/ Nonmuscle Beta-actin</td></tr></tbody></table>

test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Single Fiber Isolation Assay for the Assessment of Oxidative Myofiber Behavior

Mięsień szkieletowy składa się z wielojądrowych miofibrili, których integralność i funkcja są niezbędne dla ruchu i ogólnego stanu zdrowia. W zaburzeniach nerwowo-mięśniowych grupy mięśni mogą być dotknięte różnie w zależności od rodzaju i stadium choroby, dlatego ważne jest odizolowanie żywych pojedynczych włókien z reprezentatywnych mięśni w celu przeprowadzenia badań mechanizmu działania. Celem tego protokołu jest zapewnienie niezawodnej metody odizolowania dużej liczby nienaruszonych pojedynczych miofibrili z mysiego mięśnia płaskiego stępu (SOL), który jest trudny do odizolowania ze względu na długość włókien i ich kruchość. Poprzez optymalizację stężenia kolagenazy i czasu trawienia, protokół minimalizuje utratę włókien i zachowuje ich żywotność podczas odizolowywania. Zoptymalizowany przepływ pracy znacząco zmniejsza przyczepianie pozostałego tkankowego materiału do odizolowanych włókien, ograniczając tym samym przenoszenie nienależących do włókien komórek i minimalizując zanieczyszczenie międzykomórkowe. Ta technika nadaje się do analiz pojedynczych włókien, a także do odizolowania satelitowych komórek i następczego ich rozmnażania w warunkach minimalnego zanieczyszczenia. Stosując ten zoptymalizowany przepływ pracy, rutynowo uzyskujemy około 300–500 nienaruszonych pojedynczych miofibrili pochodzących z SOL, które można immunolabylować z dużą wydajnością, a także uzyskujemy wysokiej jakości populację satelitowych komórek z minimalnym zanieczyszczeniem fibroblastami. Wykorzystując analizy porównawcze z mięśniem przedłużaczem długim palców (EDL), podkreślamy wartość dostosowanego, specyficznego dla danego mięśnia podejścia do oceny terapii w badaniach nad chorobami nerwowo-mięśniowymi, umożliwiając testowanie kandydujących interwencji farmaceutycznych w małych, scalonych oknach eksperymentalnych.

Nasza technika pokazuje, że odizolowanych włókien mięśnia płaskiego stopy (SOL) i długiego rozciągacza palców (EDL) można skutecznie immunomarkować przeciwko Pax7 (Rysunek 3B). Te odizolowanych włókna można trzymać w płynnym podłożu kulturowym (składającym się z DMEM + GlutaMAX z 10% surowicą konną, 1% AB, 0,5% CEE) przez 3 dni, po czym następuje immunomarkowanie (Rysunek 3B). Przechowywanie włókien pływających dłużej niż 4 dni nie jest zalecane. W opisanym warunkach pływających włókien, miofibrile mają tendencję do skupiania się po tym czasie, co komplikuje późniejszą analizę immunomarkowania.
Prezentowana technika może być również wykorzystana do immunoblottingu w programie miogenowym (Rysunek 3C). Rzeczywiście, mioblasty pochodzące z SOL-u i EDL-u były rozmieszczone na 24-otworowym płytkach w około 70% konfluencji. Komórki były albo utrzymywane w podłożu wzrostowym przez 1 dzień (mioblasty) albo indukowane do różnicowania przez dwa lub cztery dni (wczesne i różnicowane miokruby odpowiednio). Pięć µg białka zostało załadowane do analizy immunoblottingu.
Ekspresja MyHC I była prawie specyficznie wyrażona w włóknach mięśniowych pochodzących z SOL-u, z minimalną ekspresją w miokrbach i znikomą w mioblastach (Rysunek 3C). MyHC II był wyrażany zarówno w włóknach mięśniowych SOL, jak i EDL. Ta ekspresja odbija SOL, składający się głównie z typu I i IIa, podczas gdy EDL składa się głównie z włókien IIx i IIb. Mioblasty nie wyrażały MyHC II, ale jego ekspresja rosła stopniowo podczas różnicowania. Oksydacyjno-powiązane białka PGC-1α i COXIV wykazywały oczekiwaną wyższą ekspresję w włóknach pochodzących z SOL. Również wyższa ekspresja GLUT4 została wykryta w odizolowanych włóknach SOL w porównaniu z włóknami EDL. Problem, z jakim mogą się zmierzyć biolodzy mięśni szkieletowych, to fakt, że szeroko stosowane białka ekspresyjne domowe i kontrole ładowania, takie jak α-tubulina, β-aktyna, GAPDH i całkowite barwienia białek, w tym Ponceau S, nie pozostają stabilne w mioblastach, miokrbach i odizolowanych włóknach mięśniowych, każde z nich wykazujące wyraźną zmienność. Intensywność sygnału α-tubuliny i β-aktyny była najwyższa w miokrbach, podczas gdy barwienie Ponceau S było stosunkowo słabe w mioblastach. W przeciwieństwie do tego, GAPDH wykazywał silniejszą ekspresję w włóknach mięśniowych EDL. Niemniej jednak, w zależności od celu eksperymentu, jeden z tych białek domowych może nadal być zastosowany, alternatywnie można rozważyć czynniki normalizacji, takie jak białko szoku ciepłowy 70 (HSP70).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig1.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Sekcja mięśnia płaskiego stopy. (A) Wyposażenie wymagane do sekcji. 1: mikroskrzyżówki, 2: delikatne kleszcze, 3: nożyczki do sekcjonowania, i 4: szpilki sekcjonujące. (B) Żyłka PLA została odcięta od paczek ścięgien GAS i SOL (żółta strzałka). Dystalna żyłka PLA (biała strzałka) została podniesiona kleszczami. (C) Szpilka sekcjonująca została włożona w przestrzeń między proksymalnym ścięgnem SOL (czerwona strzałka) a GAS (zielona strzałka). (D) SOL zostało oddzielone od GAS za pomocą szpilki sekcjonującej. (E) Paczki ścięgien GAS i SOL zostały następnie odcięte po stronie GAS. (F) Proksymalne ścięgno SOL zostało następnie odcięte mikroskrzyżówkami. (G) Dodatkowe dystalne paczki ścięgien zostały usunięte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Izolacja włókien mięśnia płaskiego stopy. (A) Wyposażenie wymagane do izolacji. 1: wąskie i 2: szerokie rurki Pasteura. (B) Stereomikroskop używany do izolacji. (C) Soleus strawiony kolagenazą został przeniesiony do DMEM z 1% AB. (D) Włókna mięśnia płaskiego stopy oddzielone od mięśnia po pierwszych 10 sesjach płukania. (E) Pojedyncze włókna przeniesione do drugiej płytki. (F) Obraz pokazujący czyste włókna usunięte ze szczątków i skurczone włókna. (G) Wolne od szczątków pojedyncze włókna przeniesione do trzeciej płytki. (H) Intakte pojedyncze włókna wyraźnie widoczne. Skala bara

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Skeletal muscle is composed of multinucleated myofibers whose integrity and function are essential for movement and overall health. In neuromuscular ...

Badanie to koncentruje się na izolowaniu nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utleniającego mięśnia rozpuszczalnika. Istniejące metody izolacji pojedynczych włókien nieodpowiednio zachowują delikatne długie włókna mięśnia soleus. Ten zoptymalizowany protokół eliminuje uszkodzenia, umożliwiając odzyskanie nienaruszonych włókien.Aby rozpocząć, przygotuj sprzęt potrzebny do sekcji mięśniowej. Użyj wstępnie przygotowanej potrójnej mieszanki znieczulającej do sedacji myszy C57 black six przez iniekcję dootrzewnowa. Następnie uśmierć zwierzę poprzez dyslokację szyjną.Wykonaj sekwencyjne nacięcia skóry na tylnej kończynie i zdejmij skórę, aby odsłonić tkankę podstawową. Następnie usuń powięź powierzchniową. Oddziel ścięgno plantaris od pakietów ścięgien mięśnia brzuchatego i soleus.Delikatnie usuń plantaris, ciągnąc za jego ścięgno. Przetnij pakiety ścięgien mięśnia brzuchatego i soleus, aby odsłonić mięśnie. Wpraw igłę w przerwie między proksymalnym ścięgnem mięśnia brzuchatego a soleus.Ostrożnie przesuń tę igłę w kierunku dystalnym, aby oddzielić mięsień soleus od mięśnia brzuchatego. Wpraw drugą igłę w proksymalne ścięgno mięśnia brzuchatego i soleus. Przetnij pakiety ścięgien od strony mięśnia brzuchatego.Ułóż soleus na brzuchatym. Wyreguluj pozycję soleus, aby odsłonić proksymalne ścięgno. Przetnij proksymalne ścięgno mikroskrzyżówkami.Ułóż soleus na stole sekcyjnym. Usuń pozostałą część ścięgna. Przenieś nietkniętego soleus do 25-mililitrowej probówki do wirówki zawierającej 0,5% roztworu kolagenazy.Inkubatoruj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 130 minut. Przetnij dwie pipety pasteurowskie, aby utworzyć jedną z szerokim otworem i jedną z wąskim otworem. Wysterylizuj i wygładź otwory pod płomieniem, aby zapobiec uszkodzeniu mięśni podczas trituracji.Użyj roztworu surowicy zawierającej 5% BSA w PBS, aby powlekać pasteurowskie pipety i trzy 50-milimetrowe naczynia Petriego, aby zapobiec przyleganiu włókien. Po trawieniu wyrzuć nadmiar roztworu kolagenazy. Przenieś soleus do naczynia zawierającego DMEM z 1% antybiotykiem antymykotycznym.Użyj pasteurowskiej pipety z szerokim otworem, aby delikatnie pippetować w górę i w dół, aby oddzielić włókna. Użyj pasteurowskiej pipety z wąskim otworem, aby przenieść nietknięte pojedyncze włókna wzdłuż ich długości do drugiego naczynia. Usuń zanieczyszczenia i skurczone włókna podczas transferu.Teraz przenieś wysokiej jakości nietknięte pojedyncze włókna do trzeciego naczynia za pomocą pasteurowskiej pipety z wąskim otworem. Zbierz włókna do zawirowanego probówki z pokrytym BSA 25 mililitrami. Delikatnie wymieszaj zawiesinę i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na pięć minut, aby włókna osiadły.Użyj pasteurowskiej pipety z wąskim otworem, aby wyrzucić nadstan, pozostawiając około 500 mikrolitrów medium. Zachowaj osad zawierający oczyszczone pojedyncze włókna mięśniowe. Rozcieńcz matrygel do stężenia 0,1 miligrama na mililitr w DMEM.Użyj go do powleczenia 100-milimetrowego naczynia kulturowego. Inkubatoruj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut lub do momentu ukończenia polimeryzacji. Dodaj około 500 mikrolitrów accutase do wcześniej przygotowanej zawiesiny włókien mięśniowych i inkubatoruj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie dodaj 10 mililitrów medium hodowlanego zawierającego DMEM bez glukozy z suplementami. Przenieś 10 mililitrów zawiesiny włókien mięśniowych potraktowanych accutase do naczynia powlekanego matrygelem. Dodaj około cztery pojedyncze włókna na centymetr kwadratowy do 100-milimetrowego naczynia kulturowego.Równomiernie przenieś włókna na całej powierzchni naczynia kulturowego. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić równomierne rozmieszczenie włókien. Obserwuj kolonie mioblastów po trzech dniach w kulturze.Zastępuj medium hodowlane codziennie, aż komórki osiągną konfluencję. Kontynuuj hodowlę, aż konfluencja zostanie osiągnięta w szóstym dniu. Po sześciu dniach w medium proliferacyjnym, izolowane włókna soleus dały czystą kulturę mioblastów.Pojedyncze włókna pochodzące od soleus i pojedyncze włókna pochodzące od extensora digitorum longus bezpośrednio po izolowaniu wykazały komórki satelitarne immunooznaczone za pomocą siódmego pudełka parzystego. Pojedyncze włókna pochodzące od soleus i pojedyncze włókna pochodzące od extensora digitorum longus hodowane przez trzy dni w pływającym medium kulturowym również wykazywały komórki satelitarne immunooznaczone za pomocą siódmego pudełka parzystego. Ten protokół umożliwia wysoką rozdzielczość analizy zachowania molekularnego w pojedynczych włóknach, jednocześnie dając bogatą, żyjącą subpopulację satelitarną.Zachowanie integralności struktury soleus podczas sekcji i precyzyjne optymalizowanie trawienia kolagenazu typu jeden są kluczowe dla zapobiegania uszkodzeniu włó

single-fiber-isolation-assay-for-assessment-oxidative-myofiber

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie włókien permeabilizowanych saponiną w połączeniu z respirometryczną analizą fosforylacji oksydacyjnej umożliwia zintegrowaną ocenę funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne w stanach fizjologicznych i patologicznych może odzwierciedlać różne wpływy regulacyjne, w tym oddziaływania mitochondrialne, morfologię oraz biochemikę.

Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Ten film pokazuje izolację pojedynczych włókien mięśniowych z pobranego mięśnia myszy Extensor Digitorum Longus (EDL). Wyizolowane włókna mięśniowe można hodować w celu zbadania aktywności komórek macierzystych mięśni związanych z włóknami mięśniowymi.

Izolacja włókien mięśniowych: technika uzyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych z zebranego mięśnia prostownika myszy Digitorum Longus (EDL)

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Ten protokół demonstruje izolację pojedynczego włókna z liofilizowanych ludzkich mięśni szkieletowych i klasyfikację typów włókien według izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) przy użyciu techniki kropkowania. Zidentyfikowane próbki włókien MHC I i II mogą być następnie dalej analizowane pod kątem specyficznych dla rodzaju błonnika różnic w ekspresji białek przy użyciu western blotting.

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj metodę izolacji pojedynczych włókien mięśniowych z mięśnia soleus myszy, która zachowuje ich integralność i umożliwia ekspansję satelitarnych komórek macierzystych z minimalnym zanieczyszczeniem fibroblastów.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Przeglądaj więcej filmów