Name: Zstandardyzowany ex vivo model świńskiej błony śluzowej jamy ustnej do oceny przepływów peptydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-09T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj zastosowanie zstandardyzowanego modelu ex vivo świńskiej błony śluzowej jamy ustnej do oceny przepływów peptydów. Metoda wykorzystuje komory dyfuzyjne i filmy mukoadhezyjne do badań preklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Benowi Shovlinowi (UCD School of Veterinary Medicine) za pomoc techniczną. Dziękujemy również dr. Hansowi Eckhardtowi (UCD School of Chemistry) za wsparcie w analizie uHPLC. Niniejszy projekt otrzymał dofinansowanie z programu badań i innowacji Horyzont Europa Unii Europejskiej w ramach grantu numer 101071054. Wyrażamy również wdzięczność za dodatkowe wsparcie finansowe ze środków grantu numer 13/RC/2073_P2, Research Ireland CURAM Center for Medical Devices oraz Europejskiego Funduszu Rozwoju. Autorzy chcieliby podziękować Kennethowi McNamarze z Rosderra Irish Meats za dostarczenie wieprzowych policzków.

Policzki świń użyte w tym badaniu zostały zebrane z lokalnej rzeźni, dlatego nie było potrzeby uzyskiwać aprobaty etycznej.
1. Izolowanie, przygotowanie i przechowywanie nabłonka policzkowego świń
<ol>
	<li>Zbierz tkanki policzkowe świń z lokalnej rzeźni i przetransportuj je w ciągu 90 min do laboratorium w lodowatej buforowej sali fosforanowej (PBS, pH 7.4). W ciągu następnych 60 min przygotuj tkanki zgodnie z opisanym wcześniej sposobem19,24, z niewielkimi modyfikacjami dla różnych miejsc oromukosy, jak pokazano na Rysunku 1.</li>
	<li>Za pomocą skalpela oddziel nabłonek policzkowy od tkanki podstawowej i przepłucz tkankę trzykrotnie sałą fosforanową (PBS). Wyrzuć nabłonek z widocznymi uszkodzeniami powierzchni.</li>
	<li>Zanurz cały nabłonek w PBS w temperaturze 65 °C przez 3 min i oddziel nabłonek oraz pozostałą tkankę łączną podścieliska mięśniowego za pomocą kleszczy złotniczych rozmiaru 5. Ta metoda jest również stosowana do izolacji nabłonka podjęzykowego i językowego.</li>
	<li>Lekko osusz przecięty oromukosę na papierze celulozowym i przystąp do badań permeacji (preferowana opcja) lub zamroź na maksymalnie 4 tygodnie.</li>
	<li>Do procesu zamrażania po separacji zanurz oromukosę na 2 godziny w krioprotektorze, 85% glicerolu25, z lekkim wstrząsaniem. Glicerol o wysokiej lepkości zastępuje wodę międzykomórkową, aby zapobiec tworzeniu się kryształków wody, które mogą uszkodzić strukturę tkanki.</li>
	<li>Po tym czasie wymieszaj glicerol ze świeżym PBS i 10% glicerolem. Zamrożone próbki śluzówki przechowuj w temperaturze -20 °C lub -70 °C, w zależności od wymaganej długości przechowywania. Wykonaj procedurę zamrażania z kontrolowaną prędkością ~-1 °C·min-1. 
	UWAGA: Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane przynajmniej na trzech próbkach tkanek z policzków różnych zwierząt.</li>
</ol>
2. Badanie permeacji ex vivo w nabłonku zamontowanym w komórkach dyfuzyjnych Franza i użycie komór Hilltop do prezentacji GLP-1 RA i GDC
UWAGA: Badania permeacji ex vivo są przeprowadzane początkowo na świeżym, izolowanym nabłonku policzkowym świń przy użyciu komórek dyfuzyjnych Franza (FDC).
<ol>
	<li>Zmontuj przecięte tkanki nabłonka w komórkach (powierzchnia okna 1,2 cm2), jak pokazano na Rysunku 2, i wyrównaj przez 30 min z PBS, pH 6,8 (strona donora, objętość 1 ml) i PBS, pH 7,4 (strona odbiorcza, objętość 10 ml).</li>
	<li>Po 30 min wyrównania, zastąp donorowy roztwór PBS (pH 6,8) 1 ml PBS zawierającego 1:1 stosunku GLP-1RA (25 mg/ml) i GDC (25 mg/ml).</li>
	<li>Przez 180 min pobierz co godzinę 1 ml z komory odbiorczej przez 3 godziny, utrzymując temperaturę 37 °C i prędkość obrotów 300 rpm. W momencie rozpoczęcia i zakończenia eksperymentu pobierz po trzy próbki z komór donorowych. Po każdym pobraniu uzupełnij komory 1 ml PBS.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu przechowuj tkankę w 10% formalinie do badań histologicznych lub zhomogenizuj ją, aby określić ilość pozostałego w tkankach peptydu GLP-1RA.</li>
	<li>Podobnie przeprowadź badania permeacji GLP-1RA za pomocą komórek Hilltop (HTC). 
	UWAGA: Celem użycia HTC jest potwierdzenie efektu zwiększania permeacji oromukosalnej przez GDC na GLP-1 RA w roztworze przed sformułowaniem dwuwarstwowowego filmu buczalnego. HTC to komora zbudowana z Kraton G-2705, biokompatybilnego kopolimeru styrenu-etenu-butylen-styrenu (SEBS) o średnicy zewnętrznej 19 mm i zawierająca poduszeczkę Webril (średnica 12,7 mm) złożoną w 100% z nieprzestawionych włókien bawełnianych, służącą jako materiał absorbujący i nieprzywierający do roztworu26.</li>
	<li>Podobnie oceń permeację ex vivo GLP-1RA i GDC (stosunek 1:1) ładowanego w dwuwarstwowym filmie przywierającym do błony śluzowej, umieszczając filmy w komorach donorowych FDC lub w 3D wkładkach, jak opisano dla HTC.</li>
	<li>Aby potwierdzić integralność porcinego nabłonka buczalnego, użyj FD-4 (0,05 mM) jako fluorescującego znacznika przepływu i dodaj go do strony donora, aby ocenić przecieki przez tkankę. 
	UWAGA: Tkanki wykazujące przecieki są wykluczone z obliczeń permeacji.</li>
	<li>Po 3-godzinnym eksperymencie określ skumulowane przepływy GLP-1 RA metodą uHPLC z 200 μL próbek pobranego z przedziału bazolateralnego w trzech powtórzeniach. Powtórz wszystkie eksperymenty permeacyjne trzykrotnie. Określ skumulowane przepływy GLP-1RA z krzywej kalibracji wygenerowanej na podstawie ustalonych stężeń GLP-1RA.</li>
</ol>
<p class="jove_title

<ol><li>Karki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oromucosal+films+for+peptide+delivery%3A+formulation+strategies+using+permeation+enhancers+and+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2025).</li>
<li>Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+drug+delivery+and+3d+printing+technologies%3A+a+focus+on+special+patient+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations.</a> Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).</li>
<li>Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+peptides+by+the+oral+route%3A+formulation+and+medicinal+chemistry+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches.</a> Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).</li>
<li>Al Musaimi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA%27s+stamp+of+approval%3A+unveiling+peptide+breakthroughs+in+cardiovascular+diseases%2C+ACE%2C+HIV%2C+CNS%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond.</a> J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).</li>
<li>Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+approval+of+Rybelsus+%28oral+semaglutide%29%3A+ushering+in+a+new+era+in+peptide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery.</a> Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Just+how+prevalent+are+peptide+therapeutic+products%3F+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review.</a> Int J Pharm. 587, 119491(2020).</li>
<li>Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+buccal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Permeability of buccal mucosa.</a> Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).</li>
<li>Mazzinelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosa+models+to+evaluate+drug+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Oral mucosa models to evaluate drug permeability.</a> Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).</li>
<li>Djekic, L., Martinovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+methods+for+characterization+of+bioadhesiveness+of+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioadhesives+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems.</a> Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).</li>
<li>Mura, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+study+for+the+development+and+optimization+by+experimental+design+of+an+in+vitro+method+for+prediction+of+drug+buccal+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption.</a> Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).</li>
<li>Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+validation+and+standardization+of+oromucosal+ex-vivo+permeation+studies+for+implementation+in+quality-controlled+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments.</a> J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).</li>
<li>Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWakchaure%2C+RS+%22Next-Generation+Drug+Delivery+Systems%22">Next-Generation Drug Delivery Systems</a>. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).</li>
<li>Wang, S., Zuo, A., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+evaluation+of+in+vitro+penetration+models+for+buccal+mucosal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery.</a> J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).</li>
<li>Sa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+features+of+oral+epithelium+in+seven+animal+species%3A+as+a+reference+for+selecting+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models.</a> Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).</li>
<li>Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+oral+cavity%3A+in+vitro+and+in+vivo+evaluations+of+buccal+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems.</a> J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oromucosal+films%3A+from+patient+centricity+to+production+by+printing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques.</a> Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).</li>
<li>Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+to+overcome+the+buccal+mucosal+barrier+to+administer+therapeutic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides.</a> Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).</li>
<li>De Vries, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+permeability+barrier+inside+porcine+buccal+mucosa%3A+a+combined+in+vitro+study+of+drug+permeability%2C+electrical+resistance+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology.</a> Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).</li>
<li>Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+pig+esophageal+mucosa+as+a+permeability+barrier+model+for+buccal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue.</a> J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).</li>
<li>Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+the+future+of+buccal+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Current status and the future of buccal drug delivery systems.</a> Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).</li>
<li>Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+buccal+drug+delivery+and+absorption%E2%80%94in+vitro+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies.</a> J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).</li>
<li>Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+theoretical+pore+sizes+of+the+porcine+oral+mucosa+for+permeation+of+hydrophilic+permeants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants.</a> Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).</li>
<li>Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+tissue+as+a+control+for+histochemical+and+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining.</a> Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).</li>
<li>Franz-Montan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+pig+oral+mucosa+sites+as+permeability+barrier+models+for+drug+permeation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies.</a> Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPegg%2C+DE+%22Cryopreservation+and+Freeze-Drying+Protocols%22">Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols</a>. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).</li>
<li>Hoogstraate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+delivery+of+fluorescein+isothiocyanate-dextran+4400+with+glycodeoxycholate+as+an+absorption+enhancer+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs.</a> J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).</li>
<li>Karki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pullulan-based+bilayer+film+for+buccal+delivery+of+a+GLP-1+peptide+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue.</a> Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).</li>
<li>Shu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+and+experimental+analysis+of+drug-coated+microneedle+skin+insertion%3A+the+mode+of+administration+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters.</a> Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).</li>
<li>Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryoprotectants+for+maintaining+drug+permeability+barriers+in+porcine+buccal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa.</a> Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).</li>
<li>Rebollo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salcaprozate-based+ionic+liquids+for+GLP-1+gastric+delivery%3A+a+mechanistic+understanding+of+in+vivo+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance.</a> J Control Release. 377, 267-276 (2025).</li>
<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li>
<li>Brayden, D. J., Stuettgen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+glycodeoxycholate+and+sodium+deoxycholate+as+epithelial+permeation+enhancers%3A+in+vitro+and+ex+vivo+intestinal+and+buccal+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays.</a> Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych zainteresowań finansowych ani konfliktów interesów do ujawnienia.

Niniejsza metodologia opisuje protokoły eksperymentalne do izolacji świńskich śluzówek policzkowych i innych śluzówek oromucosalnych, wraz z testami przenikalności dla terapeutyków opartych na peptydach, przy użyciu niskotoksycznego stabilnego analogu GLP-1RA jako przykładu30. Peptydy to hydrofilowe makrocząsteczki o znikomej przenikalności przez błony śluzowe17. Sukces w realizacji powyższego protokołu polega na precyzyjnym izolowaniu i montażu śluzówki policzkowej i podjęzykowej. Izolacja wymaga specjalistycznej umiejętności i rygorystycznej kontroli temperatury; nawet nieznaczne wahania termiczne podczas procesu ogrzewania mogą powodować niekorzystne fizjologiczne i morfologiczne zmiany w tkankach nabłonkowych, co ostatecznie kompromituje integralność danych na temat przenikania. Ponadto, utrwalenie izolowanej tkanki wewnątrz spersonalizowanych wstawianych elementów 3D reprezentuje krytyczny krok. Biorąc pod uwagę delikatną naturę warstw nabłonkowych, istnieje wyższe ryzyko pęknięcia lub wycieku tkanki podczas montażu. Aby to zminimalizować, zastosowaliśmy test wycieku FD4, który służy jako środek kontroli jakości, aby zapewnić integralność membrany przed rozpoczęciem badań przepływu. Wyciek FD4 był początkowo oceniany wizualnie i dalsze ilościowo mierzone za pomocą spektroskopii UV-widocznej. Odpowiednie dane są dostępne w danych uzupełniających (Dodatkowa Figura 4 oraz Dodatkowy Plik 3).
Konwencjonalny FDC, uważany za standard w badaniach ex vivo, często stanowi wyzwanie przy ilościowym określaniu terapeutyków peptydowych ze względu na duże objętości w komorze odbiorczej, zazwyczaj 10 mL. Duża objętość prowadzi do nadmiernego rozcieńczenia próbki, co sprawia, że stężenia peptydów, które przenikają, spadają poniżej dolnej wartości LOD dla standardowych metod analitycznych. Aby tego uniknąć, opracowaliśmy nowy 3D-drukowany wkład, który naśladuje skalę i objętości systemu transwells używanego do monowarstw komórek nabłonkowych, w tym Caco-231. Wkłady mogą być bezpośrednio umieszczane w standardowych 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej i bezpiecznie zakwaterowane izolowanych świńskich śluzówek policzkowych nabłonkowych. Ta modyfikacja znacznie zmniejsza objętość komponentu donorskiego prawie 7-krotnie do 1,5 mL, koncentrując się na analicie i przezwyciężając ograniczenia wrażliwości uHPLC. Ta adaptacja jest szczególnie ważna dla ilościowego określania kosztownych leków peptydowych o niskiej przenikalności.
Zwiększenie przenikania GLP-1 RA w obecności GDC zaobserwowano za pomocą systemu wkładów 3D. Kumulatywna ilość GLP-1RA, która przeniknęła, osiągnęła ~55,3 µg po 3 h, co odpowiada ~4,3 % początkowego stężenia na stronie donora. W porównaniu, nie wykryto pomiaru przepływu GLP-1 RA, gdy podobne stężenia GLP-1RA i GDC uwięzione w filmach bucalnych zostały zastosowane do śluzówki policzkowej zamontowanej w FDC, co sugeruje, że przenikanie peptydów mogło wystąpić, ale pozostało analitycznie niewykrywalne z powodu nadmiernego rozcieńczenia w dużej objętości odbiornika. Jednakże, kumulatywne przenikanie GLP-1 RA z dwuwarstwy bukkalnej formuły filmowej osiągnęło około 1,8 % po 3 h w wkładach 3D przez 3 h, co wykazało wykonalność wykrywania niskiego poziomu transportu peptydów przez tkankę bucalną z form dawkowania przy użyciu zminiaturyzowanego systemu odbioru. Ex vivo przenikanie GLP-1 RA zostało również ocenione przy użyciu HTC zawierających wacik bawełniany załadowany peptydem i GDC. Jest to bardzo użyteczne początkowe urządzenie do sprawdzenia koncepcji, że prezentacja peptydu z filmów z wzmacniaczem przenikania może być możliwa. Integralność bariery świńskiej śluzówki policzkowej może być monitorowana podczas eksperymentu za pomocą TEER i wycieku FD-4. Podczas ekspozycji na agonistę receptora GLP-1 (GLP-1 RA) obserwowano powolne, zależne od czasu zmniejszenie TEER, co jest zgodne ze zwiększoną transportem parakomórkowym wywołanym w śluzówce policzkowej przez sól żółciową32.
Ograniczeniem tej techniki jest zależność od świeżej tkanki świńskiej, która nie zawsze jest dostępna na żądanie z ubojowni, a jakość tkanki może być zmienna. Aby rozwiązać problem z pozyskaniem świeżej tkanki w rozsądnej odległości od laboratorium, oceniliśmy krioprotekcję na potrzeby przechowywania wysokiej jakości próbek, które moglibyśmy wykorzystać później. Chociaż użycie świeżej tkanki jest optymalne, użycie izolowanych przechowywanych tkanek śluzówkowych wymaga ostrożnego stosowania kryoprotektorów i szybkości zamrażania, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu i późniejszemu uszkodzeniu bariery. Protokół ma zdolność do łączenia standardowych badań przenikania w skali makro z wysoce czułą analizą peptydów. Poprzez optymalizację zarówno procesu izolacji tkanki, jak i protokołu przenikania za pomocą wkładów 3D, osiągnęliśmy wyższy stopień reprodukcyjności i czułości niż jest to zazwyczaj raportowane z FDC. Ponadto,

Śluzobłona jamy ustnej i podjęzykowa stanowią atrakcyjne drogi podawania leków doustnych, ponieważ oferują bezpośrednio dostępne miejsca i unikanie pierwszego przejścia wątrobowego, co może poprawić biodostępność i akceptację przez pacjentów w porównaniu z innymi drogami, w tym doustną1,2. Peptydy są ogólnie podawanie przez iniekcję, zamiast podawać doustnie ze względu na słabą permeację przez nabłonek jelitowy, ze względu na wyższą masę cząsteczkową, hydrofiliczność i podatność na degradację enzymatyczną3. FDA zatwierdziła 102 peptydy do zastosowań terapeutycznych, a około 450 peptydów terapeutycznych jest obecnie badanych w badaniach przedklinicznych lub klinicznych4. Obejmują one tabletki doustne zawierające środki poprawiające permeację (np. semaglutyd, Rybelsus)5 i platformy oromukozy (Minirin Melt i Nocdurna sublingualne octan desmopresyny) opracowane przy użyciu technologii tabletek do rozpuszczania w ustach firmy Catalent's Zydis (ODT)6. Pomimo rozległych badań nad przepuszczalnością leków przez śluzówkę jamy ustnej, wartości przepuszczalności cząsteczek wykazują słabą powtarzalność i ograniczoną porównywalność między badaniami7,8. Te niespójności wynikają głównie z różnic w stosowanych modelach zwierzęcych i z różnic w obsłudze i przygotowaniu izolowanej śluzówki jamy ustnej9.
Testy przepuszczalności ex vivo z wykorzystaniem izolowanej śluzówki jamy ustnej i podjęzykowej są cennym narzędziem do przewidywania in vivo przepuszczalności małych cząsteczek przez śluzówkę jamy ustnej oraz do przedklinicznego przesiewania składników formulacji istotnych dla form dawkowania10,11,12; jednak ich zastosowanie w przesiewaniu peptydów było ograniczone, ponieważ bazalna przepuszczalność jest nieznaczna. W ostatnich latach świńska śluzówka jamy ustnej stała się preferowanym modelem, ponieważ jej struktura nierogowaczona oraz właściwości fizjologiczne i biochemiczne są bardzo podobne do ludzkich13. Próbki śluzówki jamy ustnej pobrane od psów są jeszcze mniej dostępne niż tkanki świńskie z rzeźni, choć obie źródła są nierogowacone14. Nadal istnieje znaczna zmienność grubości nabłonka i metod przetwarzania. Standardyzacja przygotowania śluzówki jamy ustnej i podjęzykowej jest konieczna. Czynniki takie jak krótko- i długoterminowe warunki przechowywania, grubość tkanki i utrzymanie żywotności podczas eksperymentów wpływają na wyniki przepuszczalności ex vivo8. Zachowanie tkanki jest krytyczne, ponieważ zarówno integralność strukturalna, jak i aktywność metaboliczna śluzówki bezpośrednio wpływają na profile dyfuzji12,15. Utrata funkcji bariery może prowadzić do sztucznie wysokich wskaźników permeacji leków16,17. Poza przechowywaniem, metoda użyta do rozpinania świńskiej śluzówki jamy ustnej do montowania w komorach permeacji wprowadza dalszą zmienność. Różnice w usuwaniu łącznotkankowego tkanki łącznej, czy to mechanicznie, chemicznie czy termicznie, mogą zmienić przepuszczalność18. Chociaż niektóre raporty sugerują, że separacja termiczna do izolowania nabłonka od mięśni gładkich zachowuje przepuszczalność19, brakuje konsensusu. Obecnie nie istnieje powszechnie akceptowana metoda do rozpinania i oceny integralności izolowanej śluzówki jamy ustnej20. Oznakowany wodny cukier fluoresceinowy izotiocyjanian-dekstran (FITC dekstran 4000, FD-4) jest powszechnie stosowany jako wskaźnik integralności świńskiej śluzówki jamy ustnej, ponieważ tylko małe cząsteczki o masie poniżej ~500 Da mogą pasywnie przenikać przez tkankę. Natomiast nienaruszona śluzówka ogranicza transport FD-4, a transfer z donora do receptora poniżej 0,6% jest zazwyczaj uważany za akceptowalny w ciągu 2-4 godzin21,22. Dodatkowo barwienie tkankowe hematoksyliną i eozyną umożliwia proste ocena morfologii nabłonka23.
W niniejszej pracy opracowałeśmy znormalizowany protokół dotyczący manipulacji śluzówką izolowanej świńskiej śluzówki jamy ustnej, zaprojektowany w celu optymalizacji integralności i przepuszczalności śluzówki w określonym czasie. Naszymi celami było zapewnienie ram eksperymentalnych dla rozpinania tkanki nabłonkowej jamy ustnej u świń oraz poprawa niezawodności ex vivo ocen przepuszczalności peptydów przez śluzówkę jamy ustnej zamontowaną w komorach dyfuzji i wkładkach. Najpierw przeprowadziliśmy analizy wizualne w celu zidentyfikowania nienaruszonych śluzówek jamy ustnej z rzeźni. Zoptymalizowaliśmy techniki przetwarzania t

<table><tbody><tr><td>Komputer / Laptop</td><td>Genérico</td><td>Każdy standardowy system</td><td>&ge;8 GB RAM zalecane</td></tr><tr><td>Skrypt akwizycji danych</td><td>Niestandardowy</td><td>collect.py</td><td>Skrypt akwizycji oparty na Pythonie</td></tr><tr><td>Jednorazowe elektrody z żelem</td><td>Genérico</td><td>Nagrzewane elektrody Ag/AgCl</td><td>Do pojedynczego użytku, klejące</td></tr><tr><td>Moduł akwizycji EEG</td><td>Upside Down Labs</td><td>BioAmp EXG Pill</td><td>Analogowy front-end dla sygnałów biopotencjalnych</td></tr><tr><td>Żel elektrodowy (jeśli używane są elektrody wielokrotnego użytku)</td><td>Genérico</td><td>Żel przewodzący</td><td>Poprawia przewodność sygnału</td></tr><tr><td>Interaktywna aplikacja (gra)</td><td>Genérico</td><td>Każda prosta gra (np. wyścigi)</td><td>Interfejs sterowany klawiaturą</td></tr><tr><td>Przelotki</td><td>Genérico</td><td>Złącza męsko-żeńskie</td><td>Standardowe przewody do płyty do eksperymentów</td></tr><tr><td>Matplotlib / Seaborn</td><td>Open-source</td><td>Najnowsze wersje</td><td>Biblioteki do wizualizacji</td></tr><tr><td>Płytka mikrokontrolera</td><td>Arduino</td><td>Uno / Maker Uno</td><td>10-bit ADC, interfejs USB</td></tr><tr><td>Środowisko programistyczne Python</td><td>Python Software Foundation</td><td>Python &ge;3.8</td><td>Open-source język programowania</td></tr><tr><td>Biblioteka PyTorch</td><td>Meta AI</td><td>Wersja &ge;1.12</td><td>Framework uczenia głębokiego</td></tr><tr><td>Scikit-learn</td><td>Open-source</td><td>Najnowsza stabilna wersja</td><td>Narzędzia ML</td></tr><tr><td>Biblioteki do przetwarzania sygnałów</td><td>SciPy</td><td>Najnowsza wersja</td><td>Filtracja, STFT</td></tr><tr><td>Kabel USB</td><td>Genérico</td><td>USB Type-A do B</td><td>Kabel do przesyłania danych</td></tr></tbody></table>

zstandardyzowany ex vivo model świńskiej błony śluzowej jamy ustnej do oceny przepływów peptydów

A Standardized Ex Vivo Porcine Oromucosal Model for Evaluating Peptide Fluxes

Podawanie leków przez oromukozę w postaci filmów, tabletek, pastylek i innych form dawkowania zapewnia wygodną drogę podawania systemowego dla pacjentów pediatrycznych i starszych, a także dla pacjentów, którzy nie mogą łatwo połykać kapsułek czy tabletek. Opracowywanie preparatów peptydowych do podawania przez bukkalne i sublingualne wymaga modeli przedklinicznych, które pasują do nierogorytynizowanej struktury nabłonka oromukosalnego człowieka, spośród których świnie i psy są najbardziej odpowiednie. Pobraliśmy odrzucone świeże tkanki oromukosalne świń ze rzeźni. Błony śluzowe zostały oddzielone od podstawnej warstwy mięśni gładkich za pomocą kontrolowanego ogrzewania, a następnie zamontowane albo w komórkach dyfuzyjnych Franza albo w nowatorskich, niskoobjętościowych, 3D-drukowanych wkładkach wykonanych z żywicy. Połączenia peptydów i wzmacniaczy permeacji zostały dodane do strony donora, a permeowane cząsteczki były pobierane z strony odbiorczej i ilościowo analizowane za pomocą ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej (uHPLC). Dla wkładek wartości oporów transepitelialnych (TEER) zamontowanych błon śluzowych były mierzone za pomocą elektrod EVOM. Histologia tkanki była badana po inkubacji zarówno w komórkach dyfuzyjnych Franza jak i w 3D wkładkach. Optymalne stężenie wzmacniacza permeacji zostało wybrane, gdy wodne mieszaniny peptydu i wzmacniacza powodowały wzrost permeacji. Permeacji peptydów wyniosło 4,3% przez 3 h w trójwymiarowych (3D) wkładkach i 1,7% w modelach komórki Hilltop, które symulują bezpośrednie narażenie z filmu bukkalnego. Warstwowiste polimerowe filmy mukoadhezyjne zawierające kombinacje peptyd-wzmacniacz zostały opracowane i zastosowane na tkankach nabłonkowych do badań permeacji za pomocą komór dyfuzyjnych.Ex vivo permeacji peptydów przez świnią błonę bukkalną osiągnęła 2% gdy błony były narażone na optymalną kombinację glikodeoksycholanu (GDC) wkomponowanego w filmy bukkalne. Teex vivo badania przesiewowe zapewniają ścieżkę do późniejszych ewaluacji farmakokinetycznych preparatów peptydowych wprowadzanych przez drogę oromukosalną u świń i ludzi.

Izolacja i sekcja tkanek nabłonka policzka świni 
Świnia błona śluzowa policzka jest szeroko stosowana jako substytut tkanki dla ludzkiej błony śluzowej jamy ustnej, ponieważ mają porównywalne cechy anatomiczne i właściwości bariery fizjologicznej29. Tkanki nabłonka policzka świni są izolowane metodami chirurgicznymi i grzaniem, jak pokazano na Rycinie 4. Początkowo skalpel jest używany do usunięcia mięśni i głębszych tkanek łącznych z policzków. Izolowane kawałki tkanki z połączonymi i nietkniętymi warstwami błony śluzowej i tkanką łączyną są następnie umieszczane w ciepłym buforze PBS podgrzanym do 65 °C przez 3 min. Tkanka jest usuwana z bufora, a nabłonek i znajdująca się pod nim blaszka właściwa są ściągane za pomocą kleszczy o wielkości 5. Ogrzewanie pozwala na jednolitą grubość w powstałej sekcji nabłonka.
Ex vivo permeacja GLP-1RA przez błonę śluzową policzka świni zamontowaną w FDC i 3D-drukowane wkładki 
Ex vivo permeacja GLP-1RA była oceniana za pomocą błony śluzowej policzka świni zamontowanej w FDC i wkładkach. Aby ocenić optymalny stosunek stężenia GLP-1 RA: GDC, HTC zawierające poduszki bawełniane o powierzchni 12,7 mm zostały przymocowane do strony donora błony śluzowej zamontowanej w FDC, a mieszanina peptyd-wzmacniacz była pipetowana na bawełnianą poduszkę. Kumulatywna permeacja GLP-1 RA osiągnęła około 4,3% w ciągu 3 godzin, gdy GDC był zawierany w proporcji 1:1 (GLP-1RA 25 mg: GDC 25 mg). W przeciwieństwie do tego, w przypadku braku GDC, nie zaobserwowano wykrywalnego przepływu GLP-1RA27. Ilościowe parametry przepuszczalności, w tym Papp są obliczane według następującego wzoru:
Papp = <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/70935/70935eq1.jpg" style="margin: auto;" />
Gdzie: 
Papp: współczynnik pozornej przepuszczalności (cm/s). 
dQ/dt: szybkość transportu GLP-1RA w stanie ustalonym, obliczona jako ilość przetransportowanego peptydu na jednostkę czasu (µg/s). 
A: powierzchnia wkładki 3D (cm2). 
Co: początkowe stężenie peptydu w komorze donorowej (apikalnej) (µg/mL).
Współczynnik pozornej przepuszczalności (Papp) GLP-1RA przez błonę śluzową policzka świni jest przedstawiony na Rycinie uzupełniającej 2. Kiedy stosunek GLP-1RA:GDC był 1:1, te same stężenia jak dla HTC były włączone do dwuwarstwy filmów; jednakże permeacja GLP-1RA przez izolowane tkanki buccalne świni nie była ilościowo wyznaczalna za pomocą konwencjonalnego setupu FDC, ponieważ prezentacja GLP-1RA z filmów do błony śluzowej jest wolniejsza niż z mieszanin w roztworze lub z HTC. Aby przezwyciężyć tę ograniczenie, skonstruowano dostosowane, niskoobjętościowe 3D-drukowano wkładki w celu zmniejszenia objętości odbiornika do 1,5 mL, poprawiając w ten sposób czułość wykrycia. Za pomocą 3D wkładek, kumulatywna permeacja GLP-1RA z filmów buccalnych w ciągu 3 godzin była pomierzalna i osiągnęła około 1,8%, jak pokazano na Rycinie 5. Wartości TEER i przepływy FD-4 były używane do oceny integralności bariery nabłonkowej i przepuszczalności parakomórkowej. Stwierdzono zależne od czasu spadki TEER (Rycina uzupełniająca 3) w grupach leczonych i odpowiadało to zwiększonej permeacji GLP-1RA. PBS i tkanki traktowane filmem blank nie wykazywały zmian TEER, co wskazuje, że dwuwarstwową macierz filmu nie zakłócała bariery. Te dane wskazują na GDC jako głównego współpracownika do efektu zwiększania permeacji.
Histologiczne ocena tkanek świni 
Ocenę histologiczną ex vivo błony śluzowej policzka świni przeprowadzono, aby ocenić wpływ metod izolacji tkanek i sprawdzić integralność nabłonka po 3-godzinnym ekspozycji na GLP-1RA i GDC. Jak pokazano na Rycinie 6, świeżo izolowane tkanki uzyskane metodą ogrzewania zachowały normalną fizjologiczną architekturę nabłonka, z nieszkodzonymi warstwami wielowarstwowymi i ciągłą warstwą śluzu powierzchni i nie wykazywały oznak uszkodzenia strukturalnego. Natomiast tkanki izolowane mechanicznie lub poddane przechowywaniu/zamrażaniu wykazywały nieznaczne zmiany w morfologii komórek nabłonkowych i zmniejszenie grubości warstwy śluzu powierzchni. Błony śluzowe policzka eksponowane na 25 mg GLP-1RA w obecności 25 mg GDC zachowały integralność nabłonka i bardzo przypominały kontrole nietraktowane. Zaobserwowano tylko łagodne obrzęki i powierzchowne erozje nabłonka. Ekspozycja na GLP-1RA samodzielnie lub na blank i załadowany GLP-1RA: GDC dwuwarstwową warstwę filmu nie wywoływała widocznego uszkodzenia tkanki, a ce

Ten protokół opisuje platformę przesiewową wykorzystującą świeżo izolowane śluzówki błony śluzowej tkanki nabłonkowej policzka świń do oceny permeacji peptydów. Metoda integruje permeację GLP-1RA w obecności zwiększacza permeacji z roztworów, komór Hilltop oraz folii w komórkach dyfuzyjnych Franza i 3D-drukowanych wkładkach, wraz z histologiczną oceną śluzówki.

Zstandardyzowany ex vivo model świńskiej błony śluzowej jamy ustnej do oceny przepływów peptydów

Oromucosal administration of drugs in films, tablets, lozenges, and other dosage forms provides a convenient systemic administration route for pediatric ...

Nasze badania opracowują standaryzowany protokół ex vivo z użyciem błony śluzowej policzka świni, aby zachować integralność tkanki i poprawić wiarygodne pomiary przenikania peptydów w czasie. Nasz protokół badań ex vivo może być stosowany w badaniach przedklinicznych dotyczących przenikania peptydów i małych cząsteczek przez modele tkanki policzkowej i podjęzykowej świń. Na początek uzyskaj tkankę policzka świni w lód zimnym PBS o pH 7,4.Za pomocą skalpela oddziel błonę śluzową policzka od tkanki podstawowej. Płucz tkankę trzy razy PBS i wyrzuć błony śluzowe o widocznych uszkodzeniach powierzchni. Następnie zanurz nietknięte błony śluzowe w PBS o 65 stopniach Celsjusza przez trzy minuty.Używając kleszczy złotniczych o rozmiarze 5, oddziel epitelium i tkankę łączną podlegającą od gładkiego mięśnia. Delikatnie osusz przeciętą błonę śluzową na papierze filtrowym z celulozy. Zamontuj przeciętą tkankę śluzową w komórkach dyfuzyjnych Franza z narażoną powierzchnią dyfuzji 1,2 centymetra kwadratowego.Urównoważyć tkankę przez 30 minut z jednym mililitrą PBS o pH 6,8 w komorze donora i 10 mililitrów PBS o pH 7,4 w komorze receptora. Po wyrównowaniu, zastąp roztwór PBS w komorze donora jednym mililitrą PBS zawierającym jeden do jednego stosunek GLP-1RA i GDC, każdy w 25 miligramach na mililitr. Ciągle mieszaj komorę receptora z prędkością 300 obrotów na minutę, utrzymując 10 mililitrów PBS o pH 7,4 i 37 stopniach Celsjusza.Pobieraj próbki po jednym mililitru z komory receptora co 60 minut podczas 180-minutowego eksperymentu. Weź potrójne próbki z komory donora na początku i końcu eksperymentu. Uzupełniaj komory jednym mililitrą PBS po każdym pobraniu próbek.Na koniec eksperymentu, przechowuj tkankę w 10% formalinie do badań histologicznych lub zmieść tkankę, aby określić ilość pozostałego peptydu GLP-1RA w tkankach. Aby potwierdzić efekt zwiększania przenikania GDC przed formowaniem filmu, przeprowadź badania przenikania GLP-1RA przy użyciu komór Hilltop załadowanych roztworem wzmacniacza peptydów. Po potwierdzeniu aktywności wzmacniacza przy użyciu komór Hilltop, oceń ex vivo przenikalność GLP-1RA i GDC z zastosowaniem filmów warstwy dwuwarstwowej o działaniu mukoadhezyjnym na tkankach policzkowych świń w komórkach dyfuzyjnych Franza lub użyj 3D wkładek.Aby ocenić integralność bariery nabłonkowej, dodaj fluoresceinowy izotiocyjanian-dekstran 4000 lub FD-4 w stężeniu 0,05 milimolarnego do komory donora. Zbieraj próbki z komory odbiorczej przez trzy godziny, aby ocenić wycieki tkanki. Po trzech godzinach badania integralności tkanki, zmierzyć stężenie FD-4 za pomocą czytnika płyt.Aby poprawić czułość wykrywania peptydów podczas badań przenikania filmu, użyj wstępnie przygotowanych filmów warstwy dwuwarstwowej z GLP-1RA i GDC. Uzyskaj 3D wkładkę za pomocą żywicy ulewkowej UV i zamontuj tkankę we wkładce. Umieść błonę śluzową policzka świni na obszarze okna 1,4 centymetra kwadratowego między komorą wierzchołkową a boczną.Umieść filmy o powierzchni jednego na jeden centymetr kwadratowy na szczycie tkanki. Po umieszczeniu filmu, za pomocą pipety wleć 0,5 mililitra PBS o pH 6,8 do komory wierzchołkowej, a następnie wleć 1,5 mililitra PBS o pH 7,4 do komory bocznej. Zbieraj po 0,2 mililitra próbek z odbiorczej strony co godzinę przez trzy godziny i zastępuj je równymi objętościami świeżego buforu po każdym pobraniu próbek.Zmierzyć rezystancję transepitelialną za pomocą elektrod stalowych umieszczonych po stronie donora i odbiorczej wkładek, oraz oblicz rezystancję transepitelialną za pomocą prawa Ohma. Aby potwierdzić integralność tkanki nabłonkowej policzkowej i podjęzykowej świń, użyj FD-4 w stężeniu 0,05 milimolarnego jako markera fluorescencyjnego. Po trzech godzinach eksperymentu, zmierzyć przenikanie GLP-1RA i pozostałą zawartość tkanki za pomocą chromatografii cieczowej o ultrawysokiej wydajności.Powtarzaj wszystkie eksperymenty przenikania trzy razy i zmierzyć skumulowane przepływy GLP-1RA. Po fiksacji tkanek w formalinie przez 48 godzin, odwodnij je w 70% etaolu i osadź w parafinie. Przekroj tkanki grubości pięciu mikrometrów za pomocą mikrotonu.Następnie zabarwij sekcje tkankowe hematoksyliną i eozyną, aby sprawdzić ich integralność histologiczną za pomocą mikroskopii świetlnej w powiększeniu 4X. Wreszcie sfotografuj szklanka i analizuj je za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazów. Przenikanie GLP-1RA wzrosło, gdy GDC był zawierany w proporcji jeden do jednego w porównaniu z kontrolami bez GDC.Kiedy kombinacja GLP-1RA i GDC została włączona do filmów dwuwarstwowych, przenikanie GLP-1RA przez izolowane tkanki policzkowe świń nie było ilościowo mierzalne za pomocą konwencjonalnego zestawu komórek dyfuzyjnych Franza. Za pomocą 3D wkładek, skumulowane przenikanie GLP-1RA z filmów policzkowych przez trzy godziny było mierzalne i osiągn

a-standardized-ex-vivo-porcine-oromucosal-model-for-evaluating

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Ten protokół opisuje izolację i hodowlę mieszanych mysich komórek jelita cienkiego. Te pierwotne hodowle jelitowe umożliwiają badanie szlaków sygnałowych leżących u podstaw wydzielania peptydów jelitowych przy użyciu wielu technik.

Mieszane pierwotne hodowle mysiego jelita cienkiego przeznaczone do badania wydzielania hormonów jelitowych i obrazowania żywych komórek enteroendokrynnych

Opracowaliśmy nowy model ex vivo, który stosuje stałe napięcie do próbki żołądka świni. Rozwój ten umożliwił dokładną ocenę wydajności (wysokości i czasu trwania uniesienia podśluzówkowego) różnych kart SIM. Wyjaśniono szczegółową metodologię konfiguracji tego nowego modelu.

Nowy model ex vivo do oceny właściwości endoskopowego materiału do iniekcji podśluzówkowej

Tutaj prezentujemy potężny i fizjologiczny model do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wydzielania hormonów jelitowych i wchłaniania jelitowego - izolowane perfundowane jelito cienkie szczura.

Mechanizmy leżące u podstaw wydzielania hormonów jelitowych przy użyciu izolowanego perfuzji jelita cienkiego szczura

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Uznane metody immunochemiczne do pomiaru przekaźników peptydowych in vivo polegają na mikrodializie lub masowym pobieraniu płynów w celu uzyskania próbki do analizy offline. Cierpią one jednak z powodu ograniczeń czasoprzestrzennych. Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie i zastosowanie pojemnościowego bioczujnika immunosondy, który pokonuje ograniczenia istniejących technik.

Czasowo-rozdzielczy pomiar dynamiki neuropeptydów in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni

W tym artykule opisano: (1) dostarczanie cząsteczek testowych do noworodków już od DOL 6; oraz (2) ocenę ex vivo funkcji bariery nabłonkowej okrężnicy w biopsjach od DOL 10 do młodych odstawianych od odstawienia (DOL 20) poprzez ocenę przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej za pomocą komór Ussinga.

Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór

Poznaj zastosowanie zstandardyzowanego modelu ex vivo świńskiej błony śluzowej jamy ustnej do oceny przepływów peptydów. Metoda wykorzystuje komory dyfuzyjne i filmy mukoadhezyjne do badań preklinicznych.

Zstandardyzowany ex vivo model świńskiej błony śluzowej jamy ustnej do oceny przepływów peptydów

Przeglądaj więcej filmów