Name: Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metody izolacji i hodowli komórek somatycznych jajnika mysiego, w tym tworzenie organoidów bez rusztowania. Model ten zachowuje różnorodność komórkową i umożliwia badanie fizjologii jajnika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To dzieło zostało sfinansowane przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka (R01HD093726 dla F.E.D. i T32HD094699 dla S.S.D. i E.J.Z.), Narodowy Instytut Raka (F31CA257300 dla S.S.D.), oraz fundusze start-upowe z Departamentu Położnictwa i Ginekologii (dla F.E.D.). Chcemy wyrazić wdzięczność dr Candace Tingen oraz laboratorium dr Teresy Woodruff, a także dr Jennifer Rowley, za ich podstawowe badania i optymalizację metod izolowania pierwotnych mysich komórek somatycznych jądra i charakterystykę tych komórek.

<ol><li>Thomas, F. H., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+interactions+during+mouse+follicular+development%3A+regulation+of+kit+ligand+expression+and+its+role+in+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell interactions during mouse follicular development: regulation of kit ligand expression and its role in oocyte growth.</a> Reprod Biol Endocrinol. 4 (1), 19(2006).</li>
<li>Robker, R. L., Hennebold, J. D., Russell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+ovulation+and+oocyte+maturation%3A+a+good+egg+at+the+right+time%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Coordination of ovulation and oocyte maturation: a good egg at the right time.</a> Endocrinology. 159 (9), 3209-3218 (2018).</li>
<li>Casey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones+and+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nurs+N+Z%22%5BJournal%5D)">Sex hormones and health.</a> Nurs N Z. 23 (1), 24-28 (2017).</li>
<li>Kinnear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ovarian+stroma+as+a+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">The ovarian stroma as a new frontier.</a> Reproduction. 160 (3), R25-R39 (2020).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+a+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Spector, I., Derech-Haim, S., Boustanai, I., Safrai, M., Meirow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+signaling+in+the+ovary+involves+stromal+fibroblasts%3A+a+study+in+humans+and+mice+provides+novel+insights+into+the+role+of+ovarian+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone signaling in the ovary involves stromal fibroblasts: a study in humans and mice provides novel insights into the role of ovarian stroma.</a> Hum Reprod. 39 (11), 2551-2564 (2024).</li>
<li>Kedem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+ovarian+endothelial+cells+promote+early+follicular+development+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ovarian+Res%22%5BJournal%5D)">Activated ovarian endothelial cells promote early follicular development and survival.</a> J Ovarian Res. 10 (1), 64(2017).</li>
<li>Converse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multinucleated+giant+cells+are+hallmarks+of+ovarian+aging+with+unique+immune+and+degradation-associated+molecular+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Multinucleated giant cells are hallmarks of ovarian aging with unique immune and degradation-associated molecular signatures.</a> PLoS Biol. 23 (6), e3003204(2025).</li>
<li>Bafor, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+cells+from+individual+mouse+ovaries+for+flow+cytometry+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of single cells from individual mouse ovaries for flow cytometry and functional analysis.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102710(2023).</li>
<li>Shepherd, T. G., Thériault, B. L., Campbell, E. J., Nachtigal, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Beschta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+robust+method+for+the+cryopreservation+of+human+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and robust method for the cryopreservation of human granulosa cells.</a> Histochem Cell Biol. 156 (5), 509-517 (2021).</li>
<li>Tingen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+and+theca+cell-enriched+stromal+cell+population+influences+growth+and+survival+of+immature+murine+follicles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A macrophage and theca cell-enriched stromal cell population influences growth and survival of immature murine follicles in vitro.</a> Reproduction. 141 (6), 809-820 (2011).</li>
<li>O'Mara, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+mirabegron+treatment+increases+human+brown+fat%2C+HDL+cholesterol%2C+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Chronic mirabegron treatment increases human brown fat, HDL cholesterol, and insulin sensitivity.</a> J Clin Invest. 130 (5), 2209-2219 (2020).</li>
<li>Zink, N., Stock, A. -K., Vahid, A., Beste, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+neurophysiological+mechanisms+underlying+the+adaptability+to+varying+cognitive+control+demands%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the neurophysiological mechanisms underlying the adaptability to varying cognitive control demands.</a> Front Hum Neurosci. 12, 411(2018).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+the+current+status+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22MedComm%22%5BJournal%5D)">Organoids: the current status and biomedical applications.</a> MedComm. 4 (3), e274(2023).</li>
<li>Alzamil, L., Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+systems+to+study+the+human+female+reproductive+tract+and+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Organoid systems to study the human female reproductive tract and pregnancy.</a> Cell Death Differ. 28 (1), 35-51 (2021).</li>
<li>Pierson Smela, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+iPSCs+to+functional+ovarian+granulosa-like+cells+via+transcription+factor+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human iPSCs to functional ovarian granulosa-like cells via transcription factor overexpression.</a> eLife. 12, e83291(2023).</li>
<li>Dipali, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+ovarian+somatic+organoids+preserve+cellular+heterogeneity+and+reveal+cellular+contributions+to+ovarian+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organizing ovarian somatic organoids preserve cellular heterogeneity and reveal cellular contributions to ovarian aging.</a> Aging Cell. 25 (1), e70333(2026).</li>
<li>Di Nisio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-ovarioids%3A+establishment+and+characterization+of+a+human+ovarian+primary+cell+3D-model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Open%22%5BJournal%5D)">Silk-ovarioids: establishment and characterization of a human ovarian primary cell 3D-model system.</a> Hum Reprod Open. 2025 (3), hoaf042(2025).</li>
<li>Nikanfar, S., Leonel, E. C. R., Damdimopoulou, P., Flaws, J. A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phthalate+exposure+on+human+ovarian+extracellular+matrix+composition%3A+insights+from+a+3D+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of phthalate exposure on human ovarian extracellular matrix composition: insights from a 3D spheroid model.</a> Environ Res. 279, 121797(2025).</li>
<li>Briley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+age-associated+fibrosis+in+the+stroma+of+the+mammalian+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary.</a> Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).</li>
<li>Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+folliculogenesis+and+oogenesis+outside+the+body%3A+encapsulated+in+vitro+follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth.</a> Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2023).</li>
<li>Dean, M., Jin, V., Russo, A., Lantvit, D. D., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+the+extracellular+matrix+and+colonization+of+the+ovary+in+metastasis+of+fallopian-tube-derived+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Exposure of the extracellular matrix and colonization of the ovary in metastasis of fallopian-tube-derived cancer.</a> Carcinogenesis. 40 (1), 41-51 (2019).</li>
<li>Charalambous, C., Webster, A., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+in+mammalian+oocytes+and+the+impact+of+maternal+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy in mammalian oocytes and the impact of maternal ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (1), 27-44 (2023).</li>
<li>Rowley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+molecular+weight+hyaluronan+induces+an+inflammatory+response+in+ovarian+stromal+cells+and+impairs+gamete+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Low molecular weight hyaluronan induces an inflammatory response in ovarian stromal cells and impairs gamete development in vitro.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 1036(2020).</li>
<li>Amargant, F., Vieira, C., Pritchard, M. T., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+low-dose+anti-fibrotic+treatment+attenuates+ovarian+aging+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic low-dose anti-fibrotic treatment attenuates ovarian aging in the mouse.</a> Geroscience. 47 (3), 3475-3495 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów interesów do ujawnienia.

W niniejszym artykule opisano metody izolacji pierwotnych komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji wzbogaconej w stromę jajnika, w sposób zachowujący heterogeniczność komponentu somatycznego jajnika. Pierwotne komórki somatyczne jajnika mysiego mogą być hodowane w 2D monowarstwie lub wykorzystywane do generowania organoidów somatycznych jajnika za pomocą bezoporowych form mikromatryc mikromolowych z agarozy. Mikroformy z agarozy zawierają 96 mikrodołków do tworzenia organoidów i pasują do pojedynczej komórki płytki...

Chociaż oocyt, czyli komórka płciowa żeńska, jest niezbędny do powstania kolejnego pokolenia, komórki somatyczne w jajniku odgrywają kluczowe role w rozwoju gamet, produkcji hormonów steroidowych i homeostazie jajnika. Oocyty, otoczone komórkami somatycznymi granulozy i teca, tworzą funkcjonalne jednostki jajnika znane jako mieszki. Komórki granulozy są fizycznie połączone z oocytem poprzez projekcje transzonalne i dostarczają oocytowi wsparcia metabolicznego i składników odżywczych, oprócz regulacji zatrzymania mejozy1,2. Ponadto, w odpowiedzi na gonadotropiny, komórki granulozy i teca produkują hormony steroidowe, w tym estrogen, progesteron i androgeny, które mają wpływ poza układem rozrodczym, wpływając na układ krążenia, mięśniowo-szkieletowy i nerwowy, a tym samym wpływając na ogólne zdrowie kobiet3. Mieszki jajnikowe rozwijają się w obrębie niejednorodnego stromy jajnika, złożonej z naczyń krwionośnych, komórek odpornościowych, kilku populacji fibroblastów interstycjalnych i komórek mezenchymalnych, a także wysoce uporządkowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)4. To środowisko stromalne zapewnia fizyczne i chemiczne sygnały, które wpływają na wzrost mieszków, owulację i luteinizację4.
Istnieje kilka metod izolowywania i hodowania gamet i mieszków in vitro, a metody te poszerzyły naszą wiedzę na temat ooogenezy i folikulogeneza5. Jednak kompartyment somatyczny jajnika jest stosunkowo słabo zbadany, częściowo z powodu braku solidnych modeli in vitro. Obecne modele kompartymentu somatycznego jajnika są w dużej mierze ograniczone do pojedynczego typu komórek, takich jak fibroblasty, komórki nabłonkowe powierzchni jajnika, komórki śródbłonka, odpornościowe lub granulozy6,7,8,9,10,11. Hodowla szeroko definiowanych pierwotnych komórek somatycznych jajnika w dwuwymiarowej (2D) hodowli sprzyja populacjom makrofagów z czasem, co prowadzi do utraty różnorodności komórkowej12. Ponadto, tradycyjna dwuwymiarowa (2D) kultura monowarstwowa nie pozwala na zróżnicowane interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, które są obecne w jajniku. Eksplanty tkanki jajnikowej zachowują złożoność komórkową i strukturalną natywnej tkanki, ale różnią się składem w zależności od tego, skąd w jajniku zostały pobrane13,14.
Organoidy to trójwymiarowe (3D), wielokomórkowe, miniaturyzowane wersje narządów lub tkanek, które naśladują organizację i funkcje in vivo15,16. Organoidy mogą być generowane z komórek macierzystych lub komórek pierwotnych izolowanych z tkanki normalnej lub chorej15. W kontekście żeńskiego układu rozrodczego, organoidy zostały wygenerowane do modelowania endometrium, jajowodu, szyjki macicy i łożyska17. Jednakże, jeśli chodzi o jajnik, aż do niedawna, modele organoidalne były ograniczone do pojedynczego typu komórek, takich jak nabłonek powierzchni jajnika lub komórki nowotworowe, lub zostały wygenerowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby przypominać struktury mieszków, a nie stromę jajnika17,18. Ostatnie badania wygenerowały i scharakteryzowały organoidy za pomocą niejednorodnych populacji komórek somatycznych izolowanych z tkanki jajnikowej myszy, makaki rezonansowej i ludzkiej19,20,21. Te modele organoidalne umożliwiły badanie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw starzenia się jajników, a także wpływu narażenia na ftalany na skład ECM19,21.
Biorąc pod uwagę krytyczne znaczenie komórek somatycznych, zarówno w mieszku, jak i stromie, dla funkcji jajnika, opisujemy metody izolowania komórek somatycznych z frakcji wzbogaconej w stromę mysich jajników i ich hodowania in vitro przy użyciu tradycyjnej kultury monowarstwowej lub w modelu organoidalnym. Za pomocą bezszachownicowych mikromoldów agarozowych, komórki somatyczne jajnika tworzą organoidy w ciągu 1-3 dni. Organoidy zachowują kluczowe populacje komórek jajnikowych, w tym fibroblasty, makrofagi i komórki steroidogenne, i mogą być kultywowane przez okres do 3 tygodni z wysoką żywotnością. Organoidy somatyczne jajników sprzyjają ocenie transkryptomu i histologicznej, analizie pożywienia uwarunkowanego, współhodowli z innymi typami komórek i metodom przesiewowym związków. Ogólnie rzecz biorąc, te organoidy są solidnym modelem do in vitro badania i modyfikacji kompartymentu somatycznego jajnika i mogą być zastosowane do badań nad rozwojem jajnik

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m, Polyethersulfone syringe filter</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>MIDSCI</td><td>PR-MCT15</td><td></td></tr><tr><td>100 mL glass beaker</td><td>Fisherbrand</td><td>FB100100</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339651&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates (TC-treated)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>28-gauge insulin needles</td><td>Exel International</td><td>26027</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>3&beta;-HSD antibody</td><td>Cosmo Bio</td><td>K0607</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>1574100</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m cell strainer</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>45 mm watch glass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7054345</td><td></td></tr><tr><td>50 mL concial tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 mL sterile syringe</td><td>Air-Tite</td><td>ML60</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC-treated plates</td><td>Corning</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates (TC-treated)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Hoefer</td><td>GR140-500</td><td>Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 &deg;C</td></tr><tr><td>Autoclave sterilization pouch</td><td>Fisherbrand</td><td>01-812-55</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200-1.5</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Rat IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9400-1.5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Bluing reagent</td><td>Fisherbrand</td><td>23-245681</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall X1R Pro-MD</td><td></td></tr><tr><td>Class II biosafety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9579T</td><td>1:250</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i CO2 Incubator</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type IV, powder</td><td>Gibco, Fisher Scientific</td><td>17-104-019</td><td></td></tr><tr><td>C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit</td><td>RayBiotech</td><td>AAM-CYT-3-8</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>Epredia</td><td>83124</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Millipore Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dissecting microscissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI-14003</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI-15922</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica</td><td>MZ9.5, S9 series</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco, Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td>pH 7.0&ndash;7.3</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Fisherbrand</td><td>23-314631</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497G</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tipped dissecting forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI-14098</td><td></td></tr><tr><td>FOXL2 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab246511</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1105010</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>EK Industries</td><td>EKI 47971GL</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>MedOne</td><td>DHCN015</td><td></td></tr><tr><td>Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EVOS FL Auto</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06005</td><td>Basal medium, Supplements 1 and 2</td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>IVFtech</td><td>IVFtech sterile workstation</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco, Fisher Scientific</td><td>11415114</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Mercedes Scientific</td><td>MER 7255/90/WH/CC</td><td></td></tr><tr><td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z764043-6EA</td><td>Silicone casts for agarose micromolds</td></tr><tr><td>Modified Davidson's Fixative</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>6413350</td><td></td></tr><tr><td>OVCAR8-RFP cells</td><td></td><td></td><td>Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red staining solution</td><td>StatLab</td><td>STPSRPT</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td><td>Gibco, Fisher Scientific</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5430 R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5741S</td><td>1:100</td></tr><tr><td>&alpha;MEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides</td><td>Gibco, Fisher Scientific</td><td>32561102</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2d i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Probing the Ovarian Microenvironment: Methods for Isolation, 2D Culture, and Organoid Culture of Mouse Ovarian Somatic Cells

Jajnik składa się z heterogenicznych populacji komórek somatycznych, zarówno w folikulu, jak i w otaczającej nim stromie, które są kluczowe dla wsparcia funkcji jajnika i wytwarzania wysokiej jakości gamet. Przedstawiamy metody izolacji komórek somatycznych z mysiego jajnika, w tym komórek endotelialnych, nabłonkowych, steroidogennych, stromalnych i odpornościowych. Kiedy te pierwotne komórki somatyczne jajnika są sadzone i hodowane w tradycyjnym układzie kultury 2D, heterogeniczność komórkowa, organizacja oraz interakcje komórka-komórka i komórka-matryca, zwykle występujące w jajniku, są utracone. Dlatego opisujemy również, jak generować mysie organoidy somatyczne jajnika za pomocą podejścia bez szkieletu. Te organoidy samoodpławiają się, utrzymują różnorodne populacje komórek i wytwarzają matrycę pozakomórkową oraz czynniki wydzielane, w tym cytokiny. Organoidy mogą być wykorzystywane do eksperymentów współhodowlanych i mogą być utrzymywane w kulturze przez co najmniej 3 tygodnie z wysoką żywotnością. Ogólnie rzecz biorąc, modele te umożliwiają badanie fizjologii i patologii jajnika z perspektywy komórek somatycznych.

Aby określić skład komórkowy somatycznych organoidów jajnika, przeprowadziliśmy immunohistochemię przekrojów tkanek organoidów po 6 dniach hodowli, wykorzystując przeciwciała przeciwko kluczowym typom komórek jajnika. Organoidy zawierały fibroblasty wykazujące pozytywną reakcję z wimentyną, makrofagi pozytywne dla F4/80, a także populacje komórek steroidogennych (Rysunek 6B)19. Wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko Foxl2 do znakowania komórek ziarnistych i luteinizow...

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

The ovary consists of heterogeneous populations of somatic cells, both within the follicle and the surrounding stroma, which are critical to support ...

probing-ovarian-microenvironment-methods-for-isolation-2d-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu eksperymentalnego do badania rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej. Ten model raka jajnika jest generowany przez ortotopową inokulację ludzkich komórek nabłonkowego raka jajnika do jajników samicy myszy.

Ortotopowa inokulacja komórek raka jajnika do mysiego jajnika: procedura mająca na celu stworzenie mysiego modelu raka jajnika do badania rozsiewu komórek w otrzewnie

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Ten protokół opisuje tworzenie trójwymiarowych (3D) organoidów tkankowych z pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka powierzchniowego jajnika (hOSE). Protokół obejmuje izolację hOSE ze świeżo pobranych jajników, ekspansję komórkową hOSE, procedury krioprezerwacji-rozmrażania oraz wyprowadzanie organoidów. Uwzględniono immunofluorescencję, analizę ilościową i prezentację użyteczności jako platformy przesiewowej.

Organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Poznaj metody izolacji i hodowli komórek somatycznych jajnika mysiego, w tym tworzenie organoidów bez rusztowania. Model ten zachowuje różnorodność komórkową i umożliwia badanie fizjologii jajnika.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Przeglądaj więcej filmów