In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu
9 czerwca 2026
Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.
Nasze laboratorium badało różnicowanie, metabolizm i interakcję podzbioru limfocytów T. Treg wpływają na komunikację między komórkami T, utrzymują homeostazę odporności, co czyni badania nad Treg niezbędnymi w leczeniu chorób autoimmunologicznych i zapalnych.
Ten zmodyfikowany protokół ocenia zarówno proliferację, jak i polaryzację jednocześnie. Na początek przygotuj naiwne komórki T, komórki regulacyjne T lub wzbogacone o Treg oraz komórki prezentujące antygen wzbogacone o komórki nie-CD4 dodatnie. Wyśrodkuj zawiesinę naiwnych komórek CD4 dodatnich T przy 350G przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza i wyrzuć nadstan. Aby uzyskać pellet komórek.
Rozcieńcz barwnik proliferacji komórek eFluor 450 w PBS, aby uzyskać stężenie 20 mikromolar przy temperaturze pokojowej. Dodaj 0,5 mililitra PBS na jedno razy 10 w potędze siedmiu komórek do probówki. Trzymaj probówkę pochyloną pod kątem około 45 stopni i delikatnie podawaj komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół 50 razy.
Następnie szybko dodaj równą objętość roztworu barwnika proliferacji komórek do zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikromolar. Trzymaj probówkę pod kątem 45 stopni i pipetuj komórki, aby dokładnie je wymieszać z barwnikiem proliferacji komórek. Natychmiast owiń probówkę centryfugującą w folię aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.
Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, delikatnie wirując co pięć minut, aby zapobiec agregacji komórek. Następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie schłodzonego pożywka kulturalna do probówki centryfugującej i delikatnie wiruj komórki, aby zakończyć barwienie. Następnie wyśrodkuj komórki i wyrzuć nadstan.
Aby umyć komórki, dodaj pięć mililitrów wstępnie schłodzonej pożywka kulturalna do pelletu komórek. Powtórz centryfugację i podawaj pellet w pięciu mililitra pożywka kulturalna. Po zliczeniu komórek wyśrodkuj komórki i podawaj w odpowiedniej objętości pożywka kulturalna, aby uzyskać stężenie komórek dwukrotnie 10 w potędze sześć komórek na mililitr.
Trzymaj probówkę na lodzie. Oblicz liczbę próbek wymaganych do kultury komórek. Przygotuj odpowiednią ilość pożywka kulturalna zawierającą 2,5 mikrograma na mililitr przeciwciała anty-myszy CD3 lub odpowiednie cytokiny indukujące.
Weź przygotowane naiwne komórki T i komórki wzbogacone w Treg i wiruj je. Dodaj 100 mikrolitrów dodatnich CD45.2, dodatnich CD4 naiwnych komórek T i 100 mikrolitrów dodatnich CD45.1 komórek APC wzbogaconych w komórki nie-CD4 dodatnie do płytki 48-dołkowej. Przenieś 100 mikrolitrów dodatnich CD45.1, dodatnich CD4, dodatnich CD25 komórek Treg wzbogaconych w dołki eksperymentalne i 100 mikrolitrów pożywka kulturalna do dołków kontrolnych.
Następnie pipetuj 100 mikrolitrów pożywka kulturalna zawierającą przeciwciało anty-myszy CD3 i 100 mikrolitrów pożywka kulturalna zawierającą odpowiednie cytokiny indukujące do każdego dołka. Dodaj PBS do pozostałych pustych dołków, aby utrzymać wilgotność płytki i zmniejszyć efekty krawędziowe. Inkubuj płytkę 48-dołkową w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w 37 stopniach Celsjusza przez trzy dni.
Delikatnie pipetuj kulturowane komórki, aby je podać i przenieś zawiesinę komórek do probówki centryfugującej 1,5 mililitra. Wycentrifuguj komórki i usuń nadstan. Dodaj 500 mikrolitrów pożywka kulturalna zawierającą forbol 12-myrystan 13-octan, ionomycynę i inhibitor transportu białka GolgiPlug do każdej probówki.
Delikatnie wiruj, aby podać komórki i inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w 37 stopniach Celsjusza przez trzy godziny. Po centryfugacji dodaj 50 mikrolitrów PBS zawierającego jeden test żółtego barwnika zombie i przeciwciała anty-myszy CD16 lub 32 rozcieńczone 1:100 do pelletu. Wiruj próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut, aby oznaczyć martwe komórki i zablokować receptory FC.
Wyśrodkuj komórki przed wyrzutem nadstanu. Dodaj 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał powierzchniowych do próbki, wiruj ją i inkubuj w czterech stopniach Celsjusza w ciemności przez 20 minut. Następnie dodaj jeden mililitr buforu sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie lub FACS do każdej probówki centryfugującej.
Po centryfugacji i usunięciu nadstanu dodaj 300 mikrolitrów roztworu fiksującego i permeabilizującego do każdej probówki centryfugującej i wiruj próbki. Inkubuj próbki w czterech stopniach Celsjusza w ciemności przez 20 minut. Przenieś mililitr buforu permeabilizującego i myjącego do każdej probówki centryfugującej, następnie wyśrodkuj i usuń nadstan.
Po powtórzeniu mycia dodaj 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał cytokinowych do każdej próbki i wiruj próbki. Inkubuj próbki w czterech stopniach Celsjusza w ciemności przez 40 minut. Myj każdą próbkę jednym mililitrą buforu permeabilizującego i myjącego.
Wyśrodkuj komórki i usuń nadstan. Podawaj pellet komórek w 300 mikro
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zmodyfikowany test supresyjny limfocytów T regulatorowych (Treg) in vitro, zaprojektowany w celu oceny zarówno proliferacji, jak i różnicowania efektorowych limfocytów T (Teff). Protokół szczegółowo opisuje przygotowanie mysich limfocytów Treg i naiwnych limfocytów T, ich kokulturę oraz późniejszą analizę cytometryczną, zapewniając kompleksowe podejście do badania regulacji immunologicznej pośredniczonej przez komórki Treg.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Komórki Treg są niezbędne do utrzymania homeostazy immunologicznej.
- Dysfunkcja komórek Treg jest powiązana z chorobami autoimmunologicznymi, odrzucaniem przeszczepów, infekcjami oraz nowotworami.
- Manipulowanie komórkami Treg stanowi obiecującą strategię terapeutyczną w stanach zapalnych i chorobach autoimmunologicznych.
- Tradycyjne testy koncentrują się głównie na wpływie komórek Treg na proliferację komórek Teff, a nie na ich różnicowaniu.
Cel badania
- Dostarczenie protokołu do oceny wpływu komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff.
- Umożliwienie badania regulacji polaryzacji komórek Th1 i Th17 zapośredniczonej przez komórki Treg.
- Udoskonalenie analizy funkcjonalnej komórek Treg w warunkach in vitro.
Zastosowane metody
- Izolacja i przygotowanie komórek Treg oraz naiwnych komórek T myszy.
- Współhodowla komórek Treg z komórkami Teff w określonych warunkach.
- Ocena proliferacji i różnicowania komórek Teff (w tym podzbiorów Th1 i Th17).
- Barwienie i analiza cytometryczna przepływowa po współhodowli.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia jednoczesną ocenę proliferacji i różnicowania komórek Teff w odpowiedzi na komórki Treg.
- Pozwala na szczegółowe badanie supresji zależnej od Treg oraz modulacji polaryzacji komórek Teff.
- Ułatwia badanie funkcji Treg w kontekście modeli chorób autoimmunologicznych i zapalnych.
Wnioski
- Ta zmodyfikowana analiza stanowi niezawodne narzędzie do badania funkcji komórek Treg wykraczające poza proliferację, w tym wpływu na różnicowanie komórek Teff.
- Wspiera ona badania nad strategiami terapeutycznymi opartymi na komórkach Treg w chorobach immunologicznych.
- Protokół ten można dostosować do różnych warunków eksperymentalnych związanych z regulacją limfocytów T.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza funkcjonalna regulacyjnych limfocytów T (Treg) jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka w procesie odkrywania leków immunologicznych oraz wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw modulacji odpornościowej. Niniejszy protokół umożliwia zespołom biofarmaceutycznym badanie zarówno proliferacji, jak i różnicowania efektorowych limfocytów T, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów oraz strategiach translacyjnych modulacji odpornościowej. Integracja tych dwóch odczytów wzmacnia proces podejmowania decyzji dotyczących portfolio w programach badawczych nad chorobami autoimmunologicznymi, przeszczepami oraz chorobami zapalnymi.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną analizę supresji pośredniczonej przez komórki Treg oraz wyjaśnienie szlaków odpornościowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez kwantyfikację zarówno proliferacji, jak i różnicowania komórek Teff.
- Zwiększa pewność prognostyczną hipotez dotyczących modulacji odpornościowej w celu selekcji projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy kokultury do późniejszych etapów przepływów pracy w badaniach przesiewowych układu odpornościowego.
- Standaryzuje ilościową ocenę wpływu komórek Treg na polaryzację i proliferację komórek Teff.
- Umożliwia uzyskiwanie powtarzalnych i skalowalnych odczytów do oceny związków w badaniach przesiewowych modulacji immunologicznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje in vitro modulację immunologiczną do istotnej dla choroby polaryzacji limfocytów T (Th1, Th17) w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez powiązanie funkcjonalnej analizy Treg z przedklinicznymi punktami końcowymi odpowiedzi immunologicznej.
- Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka dla strategii terapeutycznych celujących w Treg.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół znajduje zastosowanie na wszystkich etapach – od wczesnych faz odkrywania, poprzez przedkliniczną modulację immunologiczną, aż po walidację celu, opracowywanie testów oraz badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia supresję pośredniczoną przez Treg oraz różnicowanie Teff w celu weryfikacji hipotez i ograniczania ryzyka związanego ze szlakami sygnałowymi.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wyników w celu zapewnienia gotowości i powtarzalności testów immunologicznych.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na cytometrii przepływowej do porównywania efektów Treg w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy polaryzację limfocytów T in vitro z punktami końcowymi układu odpornościowego istotnymi dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do funkcjonalnej analizy Treg w ramach programów modulacji immunologicznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność funkcjonalnych testów immunologicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w zarządzaniu portfolio immunologicznym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w zakresie modulacji immunologicznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie izolacji limfocytów T, kokultury oraz analizy cytometrycznej.
- Wymagany jest dostęp do instrumentacji do cytometrii przepływowej oraz infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu uzyskania powtarzalnych wyników funkcji immunologicznych.
- Metoda jest dostosowalna do różnych modeli mysich i źródeł komórek odpornościowych, zgodnie z zakresem wspieranym przez protokół.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od systemów in vitro oraz zmiennych specyficznych dla danego modelu.
