Name: In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-09T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę in vitro analizy komórek T regulatorowych u myszy, oceniającą proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych. Protokół obejmuje współkulturę i cytometrię przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było wspierane przez Program Sichuan Science and Technology (NR 2026NSFSC0940), projekt 1·3·5 dla Dyscyplin Doskonałości, Zachodni Szpital Uniwersytecki, Uniwersytet Sichuan (NR. ZYYC25010) oraz Chińską Fundację Naukową dla Doktorantów (NR. 2025M781396). D.Z. szczerze chce upamiętnić Dr. Sang-A Park, który zmarł w 2018 roku. Przepływ eksperymentu został stworzony za pomocą BioRender.com.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt w West China Hospital, Sichuan University (Numery zgody: 20250814006, 20211212A). Wszystkie użyte w tym eksperymencie myszy miały genetyczne tło C57BL/6.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do fluorescynacji aktywowanych komórek (FACS): 1× PBS zawierający 0,5% białka surowicy wołowej (BSA).</li>
	<li>Przygotuj bufor do magnetycznej aktywacji komórek (MACS): 1× PBS zawierający 0,5% BSA i 2 mM kwasu etylenodiamonoteocowego (EDTA).</li>
	<li>Przygotuj środowisko kultury komórkowej: środowisko RPMI 1640 zawierające 10% surowicy wołowej (FBS), 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES, 55 µM β-merkaptoetanol, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie limfocytów myszy C57BL/6
<ol>
	<li>Pod sterylnymi warunkami pobierz śledzionę i obwodowe węzły chłonne (LNs) od 6–8-tygodniowej myszy C57BL/6 (samca lub samicy) i umieść je w 50 mL probówce do wirowania z 5 mL buforu FACS. 
	UWAGA: Sekcja śledziony i węzłów chłonnych powinna być wykonana zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
	<li>Umieść sitko komórkowe o średnicy 70 µm na 50 mL probówce do wirowania, następnie umieść śledzionę i węzły chłonne na sitku i użyj tłoczka strzykawki 5 mL, aby delikatnie zgnieść tkankę przez 1 min. Podczas gniecenia spłucz sitko 3 razy buforem FACS. Upewnij się, że tkankę zgniesiono całkowicie i spłucz komórki do probówki. Po gnieceniu usuń sitko.</li>
	<li>Wiruj w 4 °C, 350 × g przez 7 min.</li>
	<li>Usuń nadstan, resuspęduj pellet komórek w 3 mL buforu do lizy krwinek czerwonych i pozostaw zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 3–5 min.</li>
	<li>Nawczas dodaj bufor FACS do probówki do wirowania do objętości 15–20 mL, aby zakończyć lizę i wiruj w 4 °C, 350 × g przez 7 min.</li>
	<li>Usuń nadstan, dodaj 10 mL buforu FACS i delikatnie resuspęduj pellet komórek.</li>
	<li>Weź 10 µL zawiesiny komórkowej i użyj barwienia trypanowym błękitem do zliczenia żywych limfocytów. 
	UWAGA: Są to limfocyty CD45.2+.</li>
</ol>
3. Przygotowanie limfocytów myszy CD45.1
<ol>
	<li>Pod sterylnymi warunkami pobierz śledzionę i węzły chłonne od 6–8-tygodniowej myszy CD45.1 (samca lub samicy) i umieść je w 50 mL probówce do wirowania z 5 mL buforu FACS.</li>
	<li>Przygotuj limfocyty od myszy CD45.1, stosując się do tych samych kroków, które zostały opisane powyżej. 
	UWAGA: Są to limfocyty CD45.1+.</li>
</ol>
4. Przygotowanie naiwnych komórek T CD45.2+CD4+CD62L+
UWAGA: Cały proces wykorzystuje zestaw do izolacji komórek T CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit for MACS. Bufor MACS jest wstępnie chłodzony w 4 °C, a wszystkie warunki wirowania to 4 °C, 350 × g przez 7 min.
<ol>
	<li>Pobierz zawiesinę komórkową od myszy C57BL/6, wiruj i wyrzuć nadstan, dodaj 400 µL buforu MACS i 100 µL Biotynowanej Mieszanki Przeciwciał do Komórek T CD4+ do probówki do wirowania na każde 1 × 108 początkowych całkowitych komórek. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w 4 °C przez 5 min w ciemności.</li>
	<li>Dodaj 300 µL buforu MACS i 200 µL Przeciwciał przeciwko Biotynie do probówki do wirowania z kroku 4.1 na każde 1 × 108 początkowych całkowitych komórek. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w 4 °C przez 10 min w ciemności.</li>
	<li>Dodaj 10 mL buforu MACS, wiruj i wyrzuć nadstan. Resuspęduj pellet komórek w 2 mL buforu MACS.</li>
	<li>Umieść kolumnę LS na odpowiednim separatorze magnetycznym do sortowania MACS. Użyj 3 mL buforu MACS do spłukania kolumny. Poczekaj, aż bufor w kolumnie całkowicie się spuści, zanim przejdziesz do następnego kroku. 
	UWAGA: Maksymalna pojemność ładowania komórek kolumny LS wynosi 2 × 109 komórek, w tym zarówno dodatnich, jak i ujemnych komórek, a maksymalna liczba dodatnich komórek, którą może uchwycić, to 1 × 108. Zwykle jedna mysz wymaga tutaj jednej kolumny LS.</li>
	<li>Włóż zawiesinę kom

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

W tej studii wyniki kokultury w warunkach indukcji Th1 są zgodne z poprzednimi raportami, że komórki Treg mogą hamować proliferację i różnicowanie komórek Th117,18. Komórki wzbogacone Treg zahamowały również proliferację komórek Tresp w warunkach indukcji Th17. Jednakże w warunkach polaryzacji Th17 stosowanych tutaj, częstość komórek IL-17A+ Tresp zwiększyła się w obecności komórek wzbogaconych Treg, co różni się od poprzednich raportów, że komórki Tre...

CD4+CD25+Foxp3+ komórki T regulatorowych (Treg) są ważnymi mediatorami homeostazy immunologicznej1. Komórki Treg aktywnie tłumią nadmierną odpowiedź immunologiczną i utrzymują tolerancję immunologiczną, zapobiegając w ten sposób uszkodzeniu normalnych tkanek i narządów przez reakcje immunologiczne2. Manipulowanie komórkami Treg jest uważane za potencjalną strategię terapeutyczną w leczeniu chorób zapalnych, takich jak choroby autoimmunologiczne, odrzucenie przeszczepów narządów, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi oraz choroby alergiczne3,4,5. Z drugiej strony, hamowanie funkcji komórek Treg jest uważane za skuteczną strategię aktywacji odporności przeciwnowotworowej6,7. Badania kliniczne obejmowały adopcyjną terapię komórkami T regulatorowymi lub leczenie małymi dawkami IL-2 w przypadku chorób autoimmunologicznych, przeszczepów narządów i choroby przeszczep przeciw gospodarzowi8,9,10. Co więcej, badania nad inżynieryjnymi komórkami Treg, w tym komórkami CAR (chimeric antigen receptor)-Treg i TCR (T-cell receptor)-Treg, zyskują coraz większą uwagę11,12.
Do tej pory terapia Treg nie została szeroko zastosowana w rutynowym leczeniu klinicznym. Aby wspierać zastosowanie kliniczne terapii Treg, ważne jest przeprowadzenie systematycznych badań i oceny jej funkcji. Powszechną strategią oceny funkcji komórek T regulatorowych in vitro jest badanie tłumienia Treg 13, które może wykryć funkcję tłumiąca komórek Treg na proliferację komórek T efektorowych (Teff). Jednak standardowe in vitro badanie tłumienia Treg nie ocenia różnicowania komórek Teff. Jeśli proliferacja i różnicowanie komórek T efektorowych może być oceniane jednocześnie, można uzyskać więcej informacji o funkcji komórek T regulatorowych.
Przedstawiamy zmodyfikowany in vitro test tłumienia komórek Treg, zwany “in vitro funkcjonalną analizą komórek Treg” (Rysunek 1). Ten protokół zapewnia strategię współkultury in vitro do badania wpływu komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3457IW</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>12.5 &mu;L Filtered Pipette Tips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420043</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>1250 &mu;L Filtered Pipette Tips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420813</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>200 &mu;L Filtered Pipette Tips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420318</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Corning Incorporated</td><td>3548</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>5 mL syringe piston</td><td>Shifeng Medical</td><td>SB2-061(A)</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>50 &mu;L Filtered Pipette Tips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420258</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>70 &mu;m cell strainer&nbsp;</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BS-70-CS</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD28 antibody</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 antibody</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>45-0042-82</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5773-82</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505808</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-7177-82</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>do pozyskiwania danych cytometrii przepływowej próbek komórek odpornościowych</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2064</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Shanghai Model Organisms Center, Inc</td><td>SM-001</td><td>do izolowywania pierwotnych limfocytów i podzbiorów komórek T</td></tr><tr><td>CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0251-83</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-041</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-643</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>CD45.1 mice</td><td>Shanghai Model Organisms Center, Inc</td><td>NM-KI-210226</td><td>do izolowywania pierwotnych limfocytów i podzbiorów komórek T</td></tr><tr><td>CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-0453-85</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>47-0454-82</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-0621-85</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0842-90</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>E1170</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5669701</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>FlowJo 10.6.2</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Human TGF-beta1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21C</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Ionomycin calcium salt</td><td>Millipore Sigma</td><td>I3909</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>LD Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>OctoMACS Separators</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>PE Rat IgG1, &kappa; Isotype Ctrl Antibody</td><td>BioLegend</td><td>400408</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-4321-82</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8139</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/32 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>do sortowania komórek</td></tr><tr><td>Recombinant mouse IL-12 p70</td><td>PEPROTECH</td><td>210-12</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-6</td><td>R&amp;D Systems</td><td>406-ML</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Thermo

in vitro analiza funkcjonalna komórek t regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

In Vitro Functional Analysis of Regulatory T cells: Focus On Proliferation And Differentiation

Komórki T regulatorowe (Treg) odgrywają kluczowe role w utrzymaniu homeostazy immunologicznej. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu komórek Treg są związane z różnymi chorobami, w tym chorobami autoimmunologicznymi, odrzuceniem przeszczepów narządów, infekcjami i rakiem. Manipulowanie komórkami Treg jest uważane za potencjalną strategię terapeutyczną w leczeniu chorób zapalnych, w tym zaburzeń autoimmunologicznych, odrzucenia przeszczepów stałych narządów, choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi i chorób alergicznych. Klasyczne in vitro testy supresji komórek Treg oceniają głównie hamujący wpływ komórek Treg na proliferację komórek T efektorowych (Teff). Jednak oprócz proliferacji, różnicowanie komórek T jest ważne dla wykonywania przez nie funkcji odpornościowych. Dlatego w tym protokole przedstawiono zmodyfikowany in vitro test supresji komórek Treg w celu zbadania wpływu komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff. W tym protokole najpierw przedstawiono przygotowanie mysiej komórek Treg i naiwnych komórek T, a następnie strategię współhodowli do badania regulacyjnych wpływów komórek Treg na proliferację i różnicowanie komórek Teff, w tym komórek Th1 i Th17, i wreszcie przedstawiono strategię barwienia do cytometrii przepływowej po współhodowli. Ta in vitro analiza funkcjonalna komórek Treg może być wykorzystana do zbadania wpływu komórek Treg na proliferację i polaryzację komórek T.

W reprezentatywnym eksperymencie, jako komórki Tresp do badania wpływu komórek wzbogaconych w Treg na proliferację i różnicowanie komórek Th1 i Th17, użyto naiwnych komórek T. W tym eksperymencie komórki Tresp były aktywowane przez anty-mysie CD3 i komórki wzbogacone w APC, niebędące CD4+, a następnie różnicowały się na komórki Th1 pod indukcją IL-12 p70 lub na komórki Th17 pod indukcją TGF-α1 i IL-6. Pod tymi dwoma warunkami indukcji, badano zmiany w proliferacji i różnicowaniu komórek Tresp po dodaniu komóre...

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Regulatory T (Treg) cells play key roles in maintaining immune homeostasis. Abnormalities in Treg cell function are associated with various diseases, ...

Nasze laboratorium badało różnicowanie, metabolizm i interakcję podzbioru limfocytów T. Treg wpływają na komunikację między komórkami T, utrzymują homeostazę odporności, co czyni badania nad Treg niezbędnymi w leczeniu chorób autoimmunologicznych i zapalnych.Ten zmodyfikowany protokół ocenia zarówno proliferację, jak i polaryzację jednocześnie. Na początek przygotuj naiwne komórki T, komórki regulacyjne T lub wzbogacone o Treg oraz komórki prezentujące antygen wzbogacone o komórki nie-CD4 dodatnie. Wyśrodkuj zawiesinę naiwnych komórek CD4 dodatnich T przy 350G przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza i wyrzuć nadstan. Aby uzyskać pellet komórek.Rozcieńcz barwnik proliferacji komórek eFluor 450 w PBS, aby uzyskać stężenie 20 mikromolar przy temperaturze pokojowej. Dodaj 0,5 mililitra PBS na jedno razy 10 w potędze siedmiu komórek do probówki. Trzymaj probówkę pochyloną pod kątem około 45 stopni i delikatnie podawaj komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół 50 razy.Następnie szybko dodaj równą objętość roztworu barwnika proliferacji komórek do zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikromolar. Trzymaj probówkę pod kątem 45 stopni i pipetuj komórki, aby dokładnie je wymieszać z barwnikiem proliferacji komórek. Natychmiast owiń probówkę centryfugującą w folię aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, delikatnie wirując co pięć minut, aby zapobiec agregacji komórek. Następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie schłodzonego pożywka kulturalna do probówki centryfugującej i delikatnie wiruj komórki, aby zakończyć barwienie. Następnie wyśrodkuj komórki i wyrzuć nadstan.Aby umyć komórki, dodaj pięć mililitrów wstępnie schłodzonej pożywka kulturalna do pelletu komórek. Powtórz centryfugację i podawaj pellet w pięciu mililitra pożywka kulturalna. Po zliczeniu komórek wyśrodkuj komórki i podawaj w odpowiedniej objętości pożywka kulturalna, aby uzyskać stężenie komórek dwukrotnie 10 w potędze sześć komórek na mililitr.Trzymaj probówkę na lodzie. Oblicz liczbę próbek wymaganych do kultury komórek. Przygotuj odpowiednią ilość pożywka kulturalna zawierającą 2,5 mikrograma na mililitr przeciwciała anty-myszy CD3 lub odpowiednie cytokiny indukujące.Weź przygotowane naiwne komórki T i komórki wzbogacone w Treg i wiruj je. Dodaj 100 mikrolitrów dodatnich CD45.2, dodatnich CD4 naiwnych komórek T i 100 mikrolitrów dodatnich CD45.1 komórek APC wzbogaconych w komórki nie-CD4 dodatnie do płytki 48-dołkowej. Przenieś 100 mikrolitrów dodatnich CD45.1, dodatnich CD4, dodatnich CD25 komórek Treg wzbogaconych w dołki eksperymentalne i 100 mikrolitrów pożywka kulturalna do dołków kontrolnych.Następnie pipetuj 100 mikrolitrów pożywka kulturalna zawierającą przeciwciało anty-myszy CD3 i 100 mikrolitrów pożywka kulturalna zawierającą odpowiednie cytokiny indukujące do każdego dołka. Dodaj PBS do pozostałych pustych dołków, aby utrzymać wilgotność płytki i zmniejszyć efekty krawędziowe. Inkubuj płytkę 48-dołkową w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w 37 stopniach Celsjusza przez trzy dni.Delikatnie pipetuj kulturowane komórki, aby je podać i przenieś zawiesinę komórek do probówki centryfugującej 1,5 mililitra. Wycentrifuguj komórki i usuń nadstan. Dodaj 500 mikrolitrów pożywka kulturalna zawierającą forbol 12-myrystan 13-octan, ionomycynę i inhibitor transportu białka GolgiPlug do każdej probówki.Delikatnie wiruj, aby podać komórki i inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w 37 stopniach Celsjusza przez trzy godziny. Po centryfugacji dodaj 50 mikrolitrów PBS zawierającego jeden test żółtego barwnika zombie i przeciwciała anty-myszy CD16 lub 32 rozcieńczone 1:100 do pelletu. Wiruj próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut, aby oznaczyć martwe komórki i zablokować receptory FC.Wyśrodkuj komórki przed wyrzutem nadstanu. Dodaj 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał powierzchniowych do próbki, wiruj ją i inkubuj w czterech stopniach Celsjusza w ciemności przez 20 minut. Następnie dodaj jeden mililitr buforu sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie lub FACS do każdej probówki centryfugującej.Po centryfugacji i usunięciu nadstanu dodaj 300 mikrolitrów roztworu fiksującego i permeabilizującego do każdej probówki centryfugującej i wiruj próbki. Inkubuj próbki w czterech stopniach Celsjusza w ciemności przez 20 minut. Przenieś mililitr buforu permeabilizującego i myjącego do każdej probówki centryfugującej, następnie wyśrodkuj i usuń nadstan.Po powtórzeniu mycia dodaj 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał cytokinowych do każdej próbki i wiruj próbki. Inkubuj próbki w czterech stopniach Celsjusza w ciemności przez 40 minut. Myj każdą próbkę jednym mililitrą buforu permeabilizującego i myjącego.Wyśrodkuj komórki i usuń nadstan. Podawaj pellet komórek w 300 mikro

in-vitro-functional-analysis-regulatory-t-cells-focus-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Tutaj opisujemy solidną metodę określania tożsamości i czystości komórek odpornościowych za pomocą sygnatur epigenetycznych wykrytych za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Demetylacja DNA w określonym locus służy jako unikalny identyfikator dla określonego typu komórki i umożliwia identyfikację limfocytów T CD8 +, regulatorowych lub Th17.

Oznaczanie tożsamości i czystości komórek odpornościowych za pomocą epigenetycznego ilościowego PCR

Poznaj zmodyfikowaną metodę in vitro analizy komórek T regulatorowych u myszy, oceniającą proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych. Protokół obejmuje współkulturę i cytometrię przepływową.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Przeglądaj więcej filmów