ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011278), projekt finansowany z funduszy własnych Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (GDBRI-ZL202602) oraz program wymiany i współpracy akademickiej Chiny-Kanada w zakresie modeli i patogenezy chorób układu sercowo-naczyniowego (MS202500058).

<ol>
	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+a+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J Am Coll Cardiol. , (2000).</li><li>Liu, D., Tian, X., Liu, Y., Song, H., Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREG+ameliorates+the+phenotypic+switching+of+cardiac+fibroblasts+after+myocardial+infarction+via+modulation+of+CDC42.">CREG ameliorates the phenotypic switching of cardiac fibroblasts after myocardial infarction via modulation of CDC42.</a> Cell Death Dis. 12 (4), (2021).</li><li>Contessotto, P., Pandit, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+to+prevent+post-infarction+remodelling:+from+repair+to+regeneration.">Therapies to prevent post-infarction remodelling: from repair to regeneration.</a> Biomaterials. 275, (2021).</li><li>Zhu, R., Sun, H., Yu, K., Zhong, Y., Shi, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-37+and+dendritic+cells+treated+with+interleukin-37+plus+troponin+I+ameliorate+cardiac+remodeling+after+myocardial+infarction.">Interleukin-37 and dendritic cells treated with interleukin-37 plus troponin I ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction.</a> J Am Heart Assoc. 5 (12), (2016).</li><li>Chang, Y., Zhang, J., Huo, X., Qu, X., Xia, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+dictates+colorectal+tumorigenic+cell+stemness+and+metastasis+via+CRAD-dependent+mechanotransduction.">Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction.</a> Cell Rep. 38 (7), (2022).</li><li>Seo, Y., Jang, J., Ko, K. P., Zou, G., Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dysregulation+induces+immune+evasion+via+oxidative+stress-activated+PD-L1+in+gastric+cancer.">Actin dysregulation induces immune evasion via oxidative stress-activated PD-L1 in gastric cancer.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Kim, B., Zhang, S., Huang, Y., Ko, K. P., Jung, Y. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRACD+loss+induces+neuroendocrine+cell+plasticity+of+lung+adenocarcinoma.">CRACD loss induces neuroendocrine cell plasticity of lung adenocarcinoma.</a> Cell Rep. 43 (6), (2024).</li><li>Jung, Y. S., Wang, W., Jun, S., Zhang, J., Srivastava, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+CRAD-controlled+cytoskeleton+initiates+mucinous+colorectal+cancer+via+&#946;-catenin.">Deregulation of CRAD-controlled cytoskeleton initiates mucinous colorectal cancer via &#946;-catenin.</a> Nat Cell Biol. 20 (11), 1303-1314 (2018).</li><li>Liu, Z., Cao, H., Shi, Y., Yang, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIAA1211+plays+an+oncogenic+role+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">KIAA1211 plays an oncogenic role in human non-small cell lung cancer.</a> J Cancer. 10 (26), 6747-6753 (2019).</li><li>Snider, P. L., Snider, E., Simmons, O., Lilly, B., Conway, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uncharacterized+mKiaa1211+expression+during+mouse+development+and+cardiovascular+morphogenesis.">Analysis of uncharacterized mKiaa1211 expression during mouse development and cardiovascular morphogenesis.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 6 (2), (2019).</li><li>Lin, Y. H., Warren, C. M., Li, J., McKinsey, T. A., Russell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibril+growth+during+cardiac+hypertrophy+is+regulated+through+dual+phosphorylation+and+acetylation+of+the+actin+capping+protein+CapZ.">Myofibril growth during cardiac hypertrophy is regulated through dual phosphorylation and acetylation of the actin capping protein CapZ.</a> Cell Signal. 28 (8), 1015-1024 (2016).</li><li>Yang, F. H., Pyle, W. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cardiac+CapZ+protein+protects+hearts+against+acute+ischemia-reperfusion+injury+and+enhances+preconditioning.">Reduced cardiac CapZ protein protects hearts against acute ischemia-reperfusion injury and enhances preconditioning.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (3), 761-772 (2012).</li><li>Tong, C., Huang, G., Ashton, C., Wu, H., Yan, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+cost-effective+gene+targeting+in+rat+embryonic+stem+cells+by+TALENs.">Rapid and cost-effective gene targeting in rat embryonic stem cells by TALENs.</a> J Genet Genomics. 39 (6), 275-280 (2012).</li><li>Cordes, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethyl-N-nitrosourea+mutagenesis:+boarding+the+mouse+mutant+express.">N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69 (3), 426-439 (2005).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Kanke, K. L., Rayner, R. E., Bozik, J., Abel, E., Venugopalan, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+with+internal+base+modifications+mediates+highly+efficient+knock-in+in+primary+cells+using+CRISPR-Cas9.">Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9.</a> Nucleic Acids Res. 52 (22), 13561-13576 (2024).</li><li>Mihos, C. G., Liu, J. E., Anderson, K. M., Pernetz, M. A., O'Driscoll, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speckle-tracking+strain+echocardiography+for+the+assessment+of+left+ventricular+structure+and+function:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Speckle-tracking strain echocardiography for the assessment of left ventricular structure and function: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 152 (10), (2025).</li><li>Garg, P. K., Biggs, M. L., Kizer, J. R., Shah, S. J., Psaty, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+dysregulation+and+subclinical+cardiac+dysfunction+in+older+adults:+the+Cardiovascular+Health+Study.">Glucose dysregulation and subclinical cardiac dysfunction in older adults: the Cardiovascular Health Study.</a> Cardiovasc Diabetol. 21 (1), (2022).</li><li>Asanuma, T., Fukuta, Y., Masuda, K., Hioki, A., Iwasaki, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+myocardial+ischemic+memory+using+speckle+tracking+echocardiography.">Assessment of myocardial ischemic memory using speckle tracking echocardiography.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 5 (1), 1-11 (2012).</li><li>Chong, S. Y., Zharkova, O., Yatim, S. M. J. M., Wang, X., Lim, X. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+cytoplasmic+domain+exacerbates+post-infarct+left+ventricular+remodeling+via+orchestrating+cardiac+inflammation+and+angiogenesis.">Tissue factor cytoplasmic domain exacerbates post-infarct left ventricular remodeling via orchestrating cardiac inflammation and angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (19), 9243-9261 (2021).</li><li>Hung, C. L., Verma, A., Uno, H., Shin, S. H., Bourgoun, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+circumferential+strain+rate,+left+ventricular+remodeling,+and+prognosis+after+myocardial+infarction.">Longitudinal and circumferential strain rate, left ventricular remodeling, and prognosis after myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1812-1822 (2010).</li><li>Labuhn, M., Adams, F. F., Ng, M., Knoess, S., Schambach, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications.">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li><li>Wu, J., Bu, L., Gong, H., Jiang, G., Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heart+rate+and+anesthetic+timing+on+high-resolution+echocardiographic+assessment+under+isoflurane+anesthesia+in+mice.">Effects of heart rate and anesthetic timing on high-resolution echocardiographic assessment under isoflurane anesthesia in mice.</a> J Ultrasound Med. 29 (12), (2010).</li><li>Voigt, J. U., Pedrizzetti, G., Lysyansky, P., Marwick, T. H., Houle, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+for+a+common+standard+for+2D+speckle+tracking+echocardiography:+consensus+document+of+the+EACVI/ASE/Industry+Task+Force+to+standardize+deformation+imaging.">Definitions for a common standard for 2D speckle tracking echocardiography: consensus document of the EACVI/ASE/Industry Task Force to standardize deformation imaging.</a> J Am Soc Echocardiogr. 28 (2), 183-193 (2015).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), (2014).</li><li>Gao, E., Lei, Y. H., Shang, X., Huang, Z. M., Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>R&#246;sner, A., Barbosa, D., Aars&#230;ther, E., Kj&#248;n&#229;s, D., Schirmer, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+frame+rate+on+two-dimensional+speckle-tracking+strain+measurements:+a+study+on+silico-simulated+models+and+images+recorded+in+patients.">The influence of frame rate on two-dimensional speckle-tracking strain measurements: a study on silico-simulated models and images recorded in patients.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (10), 1137-1147 (2015).</li><li>Argiro, A., Bui, Q., Hong, K. N., Ammirati, E., Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+gene+therapy+in+cardiomyopathies.">Applications of gene therapy in cardiomyopathies.</a> JACC Heart Fail. 12 (2), 248-260 (2024).</li><li>Micheletti, R., Plaisance, I., Abraham, B. J., Sarre, A., Ting, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Wisper+controls+cardiac+fibrosis+and+remodeling.">The long noncoding RNA Wisper controls cardiac fibrosis and remodeling.</a> Sci Transl Med. 9 (395), (2017).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Juliano, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+therapeutic+oligonucleotides.">The delivery of therapeutic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6518-6548 (2016).</li></ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym badaniu stworzyliśmy mysz z deficytem Cracd otrzymaną dzięki inżynierii CRISPR/Cas9 oraz opracowaliśmy schemat fenotypowania po zawałach mięśnia sercowego (MI) z wykorzystaniem konwencjonalnej echokardiografii, obrazowania odkształceń metodą śledzenia plamek (speckle-tracking strain imaging) oraz histologii. Protokół pozwolił na uzyskanie osobników z nokautem z potwierdzoną utratą białka CRACD. Myszy z deficytem Cracd wykazały mniejszą dylatację komór, lepszą frakcję wyrzutową (EF) oraz zmniejszoną włóknienie w porównaniu z grupą kontrolną WT po MI, co potwierdza użyteczność tego modelu w badaniu przebudowy serca.
Sukces tego modelu zależy od kilku krytycznych etapów. Projektowanie gRNA oraz walidacja in vitro bezpośrednio wpływają na wydajność edycji zygoty23. Do wyboru gRNA z wynikami CRISPRater ≥ 0,5 wykorzystujemy programy CRISPick lub Benchling, a następnie testujemy wydajność cięcia za pomocą testu Cas9/gRNA in vitro. Do mikroiniekcji przekazywane są wyłącznie gRNA, które osiągają wydajność cięcia &gt; 50%. Równie istotne jest prawidłowe podwiązanie LAD: szew 7‑0 musi przechodzić 2–3 mm od początku LAD na głębokości 0,5–1 mm, aby uniknąć przebicia prawej komory (zbyt głęboko) lub niepełnego zamknięcia naczynia (zbyt płytko); natychmiastowe zblednięcie ściany przedniej potwierdza zamknięcie. Niezbędna jest również kontrola częstości akcji serca podczas echokardiografii24 – utrzymanie wartości 450–550 bpm poprzez regulację stężenia izofluranu (zazwyczaj 1–2%) poprawia powtarzalność pomiarów konwencjonalnych i odkształceń. Na koniec, w przypadku analizy speckle‑tracking, kluczowa jest ocena wizualna kolorowej siatki25. Siatka musi podążać za granicami mięśnia sercowego bez gwałtownych przesunięć, w przeciwnym razie wymagana jest ręczna korekta; jeśli po trzech próbach jakość pozostaje niska, mysz jest wykluczana z badania.
Nawet przy skrupulatnym przestrzeganiu protokołu mogą wystąpić pewne trudności techniczne. Większość z nich można rozwiązać poprzez systematyczne usuwanie usterek. Niskie wskaźniki transmisji w linii zarodkowej (poniżej 10%) zazwyczaj wskazują na słabą integrację oligonukleotydu donora lub niską aktywność gRNA26. W związku z tym zwiększenie stężenia oligo donora do 20 ng/µL, wydłużenie ramion homologii do 120–200 bp oraz ponowna weryfikacja cięcia gRNA (&gt; 50%) mogą poprawić transmisję. Wysoka śmiertelność po MI (powyżej 30%) często wynika z odmy opłucnowej, krwawienia oraz rozległego zawału27. Dlatego utrzymywanie myszy na ciągłym tlenie aż do momentu wybudzenia oraz stosowanie maty grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała znacząco zmniejsza wskaźniki śmiertelności. Jeśli ściana przednia nie blednie po ligacji, prawdopodobnie błędnie zidentyfikowano LAD lub szew jest zbyt płytki. W takim przypadku ponowne zlokalizowanie LAD (jasnoczerwone naczynie biegnące ukośnie) i ponowne przeprowadzenie igły na głębokość 0,5–1 mm, niekiedy przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, rozwiązuje ten problem. W przypadku słabej jakości speckle-trackingu, zazwyczaj przyczyną jest niska częstotliwość klatek, rozmyte krawędzie lub artefakty ruchowe28. Odpowiednio, zwiększenie częstotliwości klatek, precyzyjne dostrojenie wzmocnienia, ręczna korekta obrysu wsierdzia oraz odrzucenie cykli z arytmią pomagają w rozwiązaniu tych problemów.
Poza tymi kwestiami operacyjnymi, metoda ta posiada wyraźne ograniczenia. Nokaut Cracd ma charakter globalny, zatem białko CRACD nie występuje we wszystkich tkankach. W konsekwencji obserwowana ochrona nie może zostać przypisana wyłącznie kardiomiocytom, ponieważ rolę mogą odgrywać również wkłady systemowe. Aby rozdzielić role specyficzne dla poszczególnych typów komórek, konieczne byłoby zastosowanie nokautu kondycjonalnego. Kolejnym ograniczeniem jest pojedynczy punkt czasowy w 7. dniu; nie dostarcza on informacji na temat przewlekłego przebudowywania. Dlatego w badaniach długoterminowych należy uwzględnić późniejsze punkty czasowe (4 lub 8 tygodni). Powtarzalność zależy również od jakości obrazowania: nie każdy system USG pozwala na uzyskanie wyraźnych granic wsierdzia, a istotne jest doświadczenie operatora. W związku z tym zaleca się, aby wszystkie zabiegi chirurgiczne i pomiary wykonywała osoba przeszkolona zawodowo.
W obliczu tych ograniczeń warto porównać nasze podejście z alternatywnymi strategiami badania funkcji genów w przebudowie po zawale mięśnia sercowego (MI). Manipulacja genetyczna za pośrednictwem AAV oraz oligonukleotydy antysensowne (ASO) to dwie powszechne alternatywy29,30. AAV9 pozwala na specyficzną dla serca, przejściową nadekspresję lub wyciszenie genów bez konieczności krzyżowania osobników, jednak jego limit pakowania (~4,7 kb), zmienna wydajność transdukcji oraz efekty poza docelowe stanowią wady tej metody31. W przeciwieństwie do tego, nasz model knockoutu CRISPR/Cas9 zapewnia trwałą, całkowitą utratę funkcji, co jest korzystne w badaniach długoterminowych. ASO umożliwiają odwracalne, zależne od dawki wyciszenie o szybkim początku działania, co czyni je odpowiednimi do interwencji ostrych; wymagają one jednak wielokrotnego podawania i nie wykazują specyficzności tkankowej32. W związku z tym opisany tutaj konstytutywny knockout jest najlepszym rozwiązaniem dla wstępnych odkryć oraz chronicznego fenotypowania.
Wreszcie, protokół ten można rozszerzyć znacznie poza zakres CRACD. Ten sam schemat postępowania — generowanie myszy z nokautem za pomocą CRISPR/Cas9 w połączeniu z echokardiografią, obrazowaniem odkształceń (strain imaging) oraz histologią — może służyć do oceny dowolnego kandydującego genu w przebiegu przebudowy po zawale mięśnia sercowego (MI). Ramy fenotypowania są również odpowiednie dla innych modeli chorób układu sercowo-naczyniowego, takich jak poprzeczna konstrikcja aorty (przeciążenie ciśnieniowe) czy uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne. Ponadto próbki tkanek uzyskane zgodnie z tym protokołem mogą być wykorzystane do analiz multiomicznych (transkryptomiki, proteomiki, metabolomiki) w celu odkrycia mechanizmów molekularnych. Cracdmodel z deficytem może służyć jako narzędzie do testowania leków: możliwe jest ocenienie związków, których podejrzewa się o działanie poprzez szlak CRACD. Tym samym niniejszy protokół stanowi platformę możliwą do dostosowania do szerokiego zakresu badań mechanistycznych i translacyjnych w badaniach układu sercowo-naczyniowego.

Zawał mięśnia sercowego (MI) pozostaje wiodącą przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, stanowiąc znaczne obciążenie dla globalnego zdrowia układu sercowo-naczyniowego1. Długoterminowe rokowania po zawale MI są determinowane przede wszystkim przez proces przebudowy lewej komory (LV)2, który obejmuje rozszerzenie komory, ścieńczenie ścian oraz włóknienie śródmiąższowe3,4, co jest kluczowym czynnikiem sprzyjającym progresji do niewydolności serca (HF). Globalna zapadalność na HF wynikająca z przebudowy serca po zawale MI dodatkowo pogarsza obciążenie chorobami układu sercowo-naczyniowego5. Pomimo tych ugruntowanych obserwacji klinicznych, brakuje systematycznych badań wykorzystujących czułe i powtarzalne modele in vivo do oceny roli konkretnych genów w przebudowie po zawale MI. Obecnie żaden protokół nie łączy modelu nokautowego opracowanego za pomocą CRISPR/Cas9 z zaawansowanym obrazowaniem odkształceń (strain imaging) w celu oceny regulatora cytoszkieletu, takiego jak CRACD. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania metody umożliwiającej precyzyjną manipulację genetyczną oraz wysokorozdzielcze fenotypowanie serca.
Regulator dynamiki aktyny hamujący białko cappingowe (CRACD), znany również jako KIAA1211, jest regulatorem polimeryzacji aktyny zlokalizowanym głównie w cytozolu, który odgrywa kluczową rolę w dynamice cytoszkieletu6. Pozytywnie reguluje polimeryzację aktyny poprzez wiązanie się z białkami cappingowymi aktyny (CAPZA1, CAPZA2, CAPZB) i zapobieganie ich przyłączaniu do końców szybko rosnących (barbed ends) filamentów aktynowych7. W tkankach nabłonkowych CRACD odgrywa istotną rolę w utrzymaniu morfologii komórek i transdukcji sygnałów poprzez zachowanie integralności cytoszkieletu aktynowego8,9. W komórkach nowotworowych jego dysregulacja wiąże się ze zwiększoną przerzutnością i proliferacją komórek6,10. Rola CRACD w sercu nie jest w pełni poznana. Analizy transkryptomu serca oraz badania z interwencją eksperymentalną wskazują, że ekspresja genu Cracd reaguje na stres patologiczny i może regulować geny związane z dynamiką cytoszkieletu podczas przebudowy komórCventricular remodeling9,11. Co więcej, jego białko hamujące, CapZ, zostało ściśle powiązane z patologią serca: fosforylacja CapZ reguluje wzrost miofibryli podczas hipertrofii indukowanej fenylofryną12. Nasze wcześniejsze badania wskazują, że umiarkowane obniżenie poziomu CRACD zapewnia ochronę przed uszkodzeniem mięśnia sercowego i zachowuje kurczliwość miofilamentów po ostrej ischemii13. Wyniki te sugerują, że CRACD może odgrywać rolę w nieadaptacyjnej przebudowie komór podczas zawale mięśnia sercowego (MI). Brakuje jednak systematycznych badań in vivo nad utratą funkcji, które sprawdzałyby, czy niedobór Cracd moduluje przebudowę po MI, co wynika głównie z braku zwalidowanego, szczegółowego protokołu generowania i fenotypowania myszy z niedoborem Cracd w warunkach stresu niedokrwiennego.
Istnieje kilka podejść do generowania myszy z konstytutywnym nokautem. Tradycyjna rekombinacja homologiczna w embrionalnych komórkach macierzystych (ES) jest precyzyjna, lecz kosztowna, czasochłonna (12–18 miesięcy) i ograniczona do określonych szczepów myszy.14Mutageneza za pomocą ENU (N-etylo-N-nitrozomocznika) powoduje powstawanie losowych mutacji punktowych, co wymaga szeroko zakrojonego krzyżowania wstecznego i sekwencjonowania15W przeciwieństwie do tego, CRISPR/Cas9 oferuje wyraźne zalety praktyczne w niniejszym badaniu: (i) bezpośrednia iniekcja do zygot skraca czas realizacji do 4–6 miesięcy; (ii) umożliwia usunięcie dużego fragmentu genomowego (3153 bp), co zapewnia całkowitą utratę funkcji; (iii) działa bezpośrednio w tle genetycznym C57BL/6N bez konieczności konwersji szczepu; oraz (iv) pozwala uniknąć zastosowania markera selekcyjnego, minimalizując niezamierzone zakłócenia transkrypcyjne. W związku z tym CRISPR/Cas9 jest najwydajniejszym wyborem do wygenerowania Cracdlinia z deficytem [nazwa], odpowiednia do rutynowego fenotypowania układu sercowo-naczyniowego. Technologia ta była szeroko stosowana do przeprowadzania precyzyjnych in vivo badania nad utratą funkcji16,17.
Obrazowanie odkształceń metodą śledzenia plamek (speckle-tracking strain imaging) jest techniką postprocessingu, która klatka po klatce śledzi ruch naturalnych plamek akustycznych w obrębie mięśnia sercowego, umożliwiając obliczenie parametrów odkształcenia mięśnia sercowego, takich jak odkształcenie (strain – ułamkowa zmiana długości) oraz szybkość odkształcenia (strain rate – tempo deformacji)18. W przeciwieństwie do konwencjonalnej echokardiografii w trybie M lub dwuwymiarowej, która dostarcza globalnych wskaźników funkcjonalnych (frakcja wyrzutowa, frakcyjne skrócenie, wewnętrzna średnica lewej komory) i jest stosunkowo nieczuła na regionalne zaburzenia kurczliwości ścian, obrazowanie odkształceń pozwala na ilościowe określenie segmentowej funkcji skurczowej. Jest to szczególnie istotne we wczesnym okresie po zawałach, kiedy kompensacyjna hiperkineza segmentów niezawałowców może utrzymywać globalną frakcję wyrzutową mimo znacznej dysfunkcji regionalnej. Śledzenie plamek oferuje kilka zalet w porównaniu ze standardowymi punktami końcowymi: pozwala na wyznaczenie segmentowego odkształcenia i szybkości odkształcenia, przemieszczenia oraz prędkości, wykrywając tym samym subtelne zmiany subkliniczne19; może zidentyfikować dyssynchronię i wczesne deficyty skurczowe przed wystąpieniem nieodwracalnego przebudowywania (remodelingu); bezpośrednio bada ono warstwę podwsierdziową, która jest najbardziej podatna na niedokrwienie20. W niniejszym badaniu CRACD jest regulatorem cytoszkieletu, który może wpływać na kurczliwość miofibryli na poziomie mikroskopowym. Konwencjonalne pomiary oparte na objętości jam serca mogłyby łatwo przeoczyć takie lokalne efekty mechaniczne. Zatem zintegrowanie analizy śledzenia plamek z niniejszym protokołem zwiększa możliwość wykrycia wczesnych efektów ochronnych wynikających z niedoboru Cracd. W konsekwencji, włączenie śledzenia plamek do tego protokołu dostarcza czułego i ilościowego narzędzia do oceny remodelingu pozawałowego, zwłaszcza w pierwszym tygodniu po zawale mięśnia sercowego, kiedy pojawia się wczesna dylatacja i dysfunkcja skurczowa21,22.
Niniejszy protokół został opracowany dla badaczy analizujących funkcjonalny wpływ delecji konkretnego genu na ostre (7-dniowe) przebudowywanie serca po zawale mięśnia sercowego (MI), z wykorzystaniem kombinacji konstytutywnego nokautu i obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Jest on odpowiedni dla badań służących do generowania hipotez, w których dopuszczalna jest globalna utrata docelowego genu, a głównym punktem końcowym jest wczesna funkcja skurczowa i zmiany strukturalne. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Po pierwsze, mysz z niedoborem Cracd jest nokautem globalnym; w związku z tym zaobserwowane efekty kardioprotekcyjne nie mogą być przypisane wyłącznie utracie CRACD w kardiomiocytach, ponieważ rolę mogą odgrywać również czynniki systemowe. Do uzyskania delecji specyficznej dla serca niezbędne będą przyszłe badania z wykorzystaniem strategii nokautu warunkowego. Po drugie, protokół koncentruje się na pojedynczym punkcie czasowym (dzień 7.) i nie odnosi się do przewlekłego przebudowywania ani progresji niewydolności serca (HF). Wymagane będą badania podłużne wykraczające poza fazę ostrą. Po trzecie, analiza speckle-tracking wymaga obrazów wysokiej jakości (wyraźnych granic wsierdzia) oraz specjalistycznego oprogramowania, które może nie być dostępne we wszystkich placówkach badawczych. Pomimo tych ograniczeń, protokół zapewnia solidną, powtarzalną platformę do wstępnej charakterystyki funkcjonalnej genów zaangażowanych w przebudowywanie serca po MI.
Celem niniejszego badania było wykorzystanie systemu CRISPR/Cas9 do stworzenia i walidacji modelu myszy z niedoborem Cracd (C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 to c.3352+255 del)) w celu zbadania wpływu niedoboru Cracd na przebudowę serca po zawale mięśnia sercowego (MI) oraz ruch ścian komór. MI indukowano zarówno u myszy typu dzikiego (WT, C57BL/6N), jak i u myszy z niedoborem Cracd, a kompleksowe oceny przeprowadzono tydzień po MI. Oceny obejmowały konwencjonalne parametry echokardiograficzne, analizę odkształceń metodą speckle-tracking oraz ocenę histopatologiczną. Skupiono się szczególnie na wczesnej fazie po MI (dzień 7), aby uchwycić początkowe zdarzenia przebudowy i ustalić, czy niedobór Cracd wpływa na rozszerzenie komór i funkcję skurczową w ostrej fazie MI. Oczekuje się, że uzyskane wyniki dostarczą cennych informacji na temat roli białka CRACD w modulowaniu niekorzystnej przebudowy serca po MI.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodorku trizny</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>Stosowany do przygotowania buforu do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>Stosowane do trawienia ogona myszy</td></tr><tr><td>Mieszanka Green Taq</td><td>Vazyme, Chiny</td><td>P131</td><td>Stosowane do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>BioFroxx, Niemcy</td><td>1110GR500</td><td>Stosowane do elektroforezy żelowej DNA przy 1&amp;ndash;stężenie 2%</td></tr><tr><td>Marker DNA</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>Stosowany jako drabinka DNA do określania wielkości produktów PCR</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji genomowego DNA TIANamp</td><td>Tiangen Biotech, Chiny</td><td>DP304</td><td>Stosowane do ekstrakcji genomicznego DNA z tkanki ogona myszy</td></tr><tr><td>MEGAshortscript&amp;trade; zestaw do transkrypcji T7</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>Stosowane do transkrypcji in vitro gRNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania RNA</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>Stosowane do oczyszczania transkrybowanego gRNA</td></tr><tr><td>BeyoCRISPR&amp;trade; Zestaw do skriningu sgRNA</td><td>Beyotime, Chiny</td><td>D8412S</td><td>Stosowane do oceny in vitro aktywności cięcia gRNA</td></tr><tr><td>inhibitor RNazy</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>Stosowane w celu zapobiegania degradacji RNA podczas transkrypcji in vitro</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Japonia</td><td>R001A</td><td>Stosowane do genotypowania metodą PCR DNA z ogona myszy</td></tr><tr><td>FERTIUP&amp;reg; Poziomka do preinkubacji plemników mysich: PM</td><td>Cosmo Bio, Japonia</td><td>KYD-002-EX</td><td>Stosowane do kapacytacji plemników przed zapłodnieniem in vitro</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy mRNA T7 ARCA</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Stosowane do transkrypcji in vitro mRNA Cas9</td></tr><tr><td>gonadotropina z surowicy klaczy w ciąży</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>Stosowane do superowulacji, podawane poprzez wstrzyknięcie doszpikowe</td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmórkowa</td><td>ProSpec, Izrael</td><td>HOR-250</td><td>Stosowany do indukcji owulacji, podawany poprzez wstrzyknięcie dosytrojeniowe</td></tr><tr><td>woda wolna od RNaz</td><td>Aladdin, Chiny</td><td>R665526</td><td>Stosowane do rozpuszczania RNA i przygotowania reakcji PCR</td></tr><tr><td>Startery</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>/</td><td>Stosowane do genotypowania</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chirurgia&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>RWD Life Science, Chiny</td><td>R510-22-10</td><td>Stosowany do indukcji i podtrzymywania znieczulenia podczas operacji</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet, Francja</td><td>1000207</td><td>Nanieść na obszar klatki piersiowej w celu usunięcia sierści przed operacją i badaniem ultrasonograficznym</td></tr><tr><td>Szew 7-0</td><td>Lingqiao, Chiny</td><td>LQ7022380206</td><td>Stosowane do trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej (LAD) tętnicy wieńcowej</td></tr><tr><td>Szew 4-0</td><td>Lingqiao, Chiny</td><td>LQ4022380412</td><td>Stosowane do zamknięcia nacięcia skóry po operacji</td></tr><tr><td>Wentylator anestezjologiczny</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Blat laboratoryjny</td><td>Służy do podawania izofluranu i wspomagania oddychania</td></tr><tr><td>Respirator dla małych zwierząt</td><td>Taimeng, Chiny</td><td>HX-101E</td><td>Stosowane do zapewnienia wentylacji ciśnieniowej podczas operacji w otwartej klatce piersiowej</td></tr><tr><td>Mata grzewcza o stałej temperaturze</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>Stosowane do utrzymania temperatury ciała myszy podczas operacji i rekonwalescencji</td></tr><tr><td>Rozieracz żebrowy</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Chiny</td><td>LN-18-4101</td><td>Służy do rozdzielenia żeber i odsłonięcia serca w celu podwiązania LAD</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Chiny</td><td>18-0551</td><td>Służy do wykonywania nacięć skóry i wycinania tkanek</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon, Japonia</td><td>SMZ 745</td><td>Służy do zapewnienia powiększonego obrazu podczas operacji podwiązania tętnicy LAD</td></tr><tr><td>Mikrochirurgiczny uchwyt igłowy</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Chiny</td><td>18-2211</td><td>Służy do manipulowania małą igłą szewską 7-0 pod mikroskopem</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odczynniki i substancje chemiczne&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środki sprzęgające do ultrasonografii</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, Chiny</td><td>TM-100</td><td>Nakładany na klatkę piersiową podczas echokardiografii w celu zapewnienia odpowiedniego kontaktu głowicy</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>Stosowane do utrwalania tkanki serca po pobraniu</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Macklin, Chiny</td><td>1330-20-7</td><td>Stosowane do usuwania parafiny i przejrzyszczania tkanek przed barwieniem</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>Barwnik jądrowy, stosowany w barwieniu H&E,</td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>Barwnik cytoplazmatyczny, stosowany w barwieniu HE,</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>Stosowany w barwieniu Massona do barwienia cytoplazmy</td></tr><tr><td>Kwas fosfomolibdowy</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Stosowane w barwieniu Massona jako zaprawa i do różnicowania</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu anilinowego</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>Stosowane w barwieniu Massona do wybarwiania włókien kolagenowych (na niebiesko)</td></tr><tr><td>przeciwciało CRACD</td><td>Absea, Chiny</td><td>KC-35356</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do wykrywania białka CRACD metodą Western Blot, rozcieńczenie 1:2000</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko GAPDH</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>Przeciwciało do kontroli ładunku w Western Blot, rozcieńczenie 1:5000</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Macklin, Chiny</td><td>64-17-5</td><td>Stosowany do dehydratacji i przygotowania odczynników (stężenia 70%, 80%, 95%, 100%)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sprzęt laboratoryjny&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&amp;trade; Legenda&amp;trade; Wirówka Micro 17</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>Stosowane do rutynowego przygotowania próbek</td></tr><tr><td>Termocykler do PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>Stosowane do amplifikacji DNA</td></tr><tr><td>System mikroiniekcyjny</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>5193000020</td><td>Stosowane do mikroiniekcji odczynników CRISPR/Cas9 do zygot</td></tr><tr><td>System obrazowania Vevo 2100</td><td>VisualSonics, Kanada</td><td>Vevo2100</td><td>System obrazowania wysokiej częstotliwości do nieinwazyjnej oceny funkcji i struktury serca po zawale mięśnia sercowego</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Leica, Niemcy</td><td>DM2500</td><td>Stosowane do obserwacji przekrojów serca barwionych HE oraz metodą Massona</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oprogramowanie do analizy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>Służy do analizy obrazów, w tym do pomiaru powierzchni, kwantyfikacji sygnału oraz przetwarzania obrazów histologicznych (barwienie HE i Massona)</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Kanada</td><td>/</td><td>Oprogramowanie VevoLab do analizy funkcji serca; moduł VevoStrain wykorzystywany do analizy odkształcenia mięśnia sercowego w celu oceny wydolności serca po zawale mięśnia sercowego</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>Wykorzystywany do analizy statystycznej i przygotowywania wykresów</td></tr></tbody></table>

generowanie i charakterystyka fenotypowa modelu mysiego z deficytem cracd wytworzonego za pomocą crispr/cas9 do badań nad przebudową po zawale mięśnia sercowego

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Niniejszy protokół opisuje generowanie i charakterystykę fenotypową modelu mysiego C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9 w celu zbadania roli białka CRACD w przebudowie serca po zawale mięśnia sercowego.

Generowanie i charakterystyka fenotypowa modelu mysiego z deficytem Cracd wytworzonego za pomocą CRISPR/Cas9 do badań nad przebudową po zawale mięśnia sercowego

Zawał mięśnia sercowego (MI) pozostaje główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Niniejszy protokół opisuje metodę generowania i charakteryzacji ...

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Niewydolność serca jest główną przyczyną hospitalizacji i główną przyczyną śmiertelności. Model trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy stosuje się do badania przebudowy komór i dysfunkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Przedstawiono technikę inwazyjnych pomiarów hemodynamicznych u myszy.

Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy: model przebudowy po zawale mięśnia sercowego i niewydolności serca

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do przeprowadzenia in vivo edycji genów serca u myszy przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pośrednictwem CRISPR. Protokół ten oferuje obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii dystroficznej w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i może być stosowany do generowania specyficznego dla serca nokautu u myszy po urodzeniu.

Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Ten artykuł demonstruje model do badania przebudowy serca po kriouszkodzeniu mięśnia sercowego u myszy.

Model kriouszkodzeń do badania zawału mięśnia sercowego u myszy

Ten protokół przedstawia prosty i spójny sposób na przejściowe zwiększenie wartości interesującego genu za pomocą modRNA po zawale mięśnia sercowego u myszy.

Dostarczanie zmodyfikowanego mRNA w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Opisujemy tutaj, założenie i zastosowanie mysiej linii reporterowej Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (określanej poniżej jako αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) do oceny przeprogramowania serca. Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) wyizolowane ze szczepu myszy są przekształcane w indukowane kardiomiocyty (iCM), co pozwala na wygodną i efektywną ocenę skuteczności przeprogramowania i funkcjonalnego dojrzewania iCM poprzez strumień wapnia (Ca2+).

Ocena in vitro przeprogramowania serca poprzez pomiar specyficznego dla serca strumienia wapnia za pomocą reportera GCaMP3

Istnieje kilka różnic między prawą i lewą komorą. Patofizjologia zawału prawej komory (RVI) nie została jednak wyjaśniona. W niniejszym protokole przedstawiono powtarzalną metodę generowania mysiego modelu RVI, która może dostarczyć środków do wyjaśnienia mechanizmu RVI.

Generowanie i charakterystyka zawału mięśnia sercowego prawej komory serca wywołanego trwałym podwiązaniem prawej tętnicy wieńcowej u myszy

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

Generowanie i charakterystyka fenotypowa modelu mysiego z deficytem Cracd wytworzonego za pomocą CRISPR/Cas9 do badań nad przebudową po zawale mięśnia sercowego

Przeglądaj więcej filmów