Test chromatyny dla ludzkiej tkanki mózgowej

Cześć, nazywam się Amish Matan i pochodzę z laboratorium dr Sha Mc Barian na oddziale psychiatrii UMass Medical School. Dzisiaj pokażę Wam procedurę immunoprecypitacji chromatyny w pośmiertnej tkance mózgowej człowieka. Chociaż poniższa procedura nie jest bardzo skomplikowana.

Najbardziej ekscytujące jest to, że do niedawna badania nad ekspresją w ludzkim mózgu ograniczały się do prostego oznaczania ilościowego mRNA i białka. Ta konkretna technika pozwoli nam lepiej zrozumieć mechanistyczne podstawy ekspresji genów zarówno w normalnym, jak i chorym ludzkim mózgu. Więc zacznijmy Aby immuno wytrącić chromatynę.

Zaczęliśmy od wcześniej wypreparowanej na zamrożonej pośmiertnej tkance ludzkiego mózgu. Ważne jest, aby używać okularów ochronnych i pracować w wyznaczonym miejscu do pracy z tkankami ludzkimi. Podczas przetwarzania tych próbek, tkanka mózgowa jest powalana pięciokrotnie większą objętością mózgu niż bufor zlewu.

Gdy cała tkanka wydaje się być jednorodna w roztworze, możemy przenieść ją do probówki o grubości dwóch mil Po homogenizacji tkanki. Dodać pięć jednostek na promil nukleazy mikrokokalnej do próbki i wymieszać roztwór, pipetując w górę iw dół. Następnie umieść go na lodzie.

Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko. Ponieważ nukleaza mikrokokalna ma zdolność działania nawet w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy wszystkie próbki zostaną potraktowane nukleazą mikrokokalną, szybko przechodzimy do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubujemy próbki przez siedem minut.

Po siedmiominutowej inkubacji dodajemy 0,5 molowego EDTA do stężenia 10 milimoli, aby zatrzymać aktywność nukleazy mikro kokalnej. Więc teraz jesteśmy gotowi, aby przejść do etapu konfiguracji. Po potraktowaniu nukleazy mikro kokalnej rozpoczną się nasze próbki zawierające nasze nukleosomalne DNA.

Nava weźmie 15-milimetrową rurkę Falcona, do której dodamy 4,5 milimilimola EDTA, 2,5 mikrolitra 0,2 molowej benadyny i 4,5 mililitra 0,1 molowego PMSF do tej probówki. Przeniesiemy naszą próbkę. Teraz inkubujemy naszą próbkę przez godzinę na lodzie, wirując ją co 10 minut.

Pod koniec godzinnej inkubacji dodamy 2,5 mikrolitra trzytrzonowego DTT. Próbka jest ponownie wirowana, a następnie jest wirowana w wirniku kubełkowym z odchylanym wirnikiem o temperaturze 3,175 RCF przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu supernatant jest rozprowadzany tak, że 500 mikrolitrów jest używanych jako nasza kontrola wejściowa, która zawierałaby tylko genomowe DNA, a reszta jest dzielona na dwie probówki zawierające 1 600 mikrolitrów próbki każda, które będą naszymi próbkami immunoprecypitacji chromatyny.

Regulator wejściowy jest ustawiany na minus 80 stopni Celsjusza przez noc do dalszego użycia. Następnie dodajemy 160 mikrolitrów 10 XFSB jedną dziesiątą objętości naszej próbki. Wraz z nim dodajemy cztery mikrogramy przeciwciała.

Teraz należy zawirować próbki, a następnie obrócić je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po całonocnej inkubacji umyjemy białko giros, które posłuży do wyizolowania naszego nukleosomalnego DNA. Ponieważ te agrokoraliki są bardzo wrażliwe, podczas pracy z nimi konieczne jest odcięcie główek końcówek pipet.

Ma to na celu zapewnienie, że kulki będą miały więcej miejsca podczas pipetowania. Teraz dodaj 1,6 mililitra jednego koralika XFS do 245 mikrolitrów białkowych jaguarów do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Powinno to wystarczyć na cztery probówki z próbką.

Następnie podziel roztwór kulki na dwie rurki o grubości dwóch mil i napełnij każdą z nich do 1,6 milicala jednym XFSB. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund na rotatorze, a następnie odwiruj je przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Po odwirowaniu usunąć ATE za pomocą próżni.

Dodaj 1,6 milsa jednego XFSB. Ponownie obracaj próbki przez 30 sekund na rotatorze, a następnie odwiruj je ponownie w temperaturze 0,1 RCF FS przez 30 sekund. Po odwirowaniu ponownie usuwamy supernatant i łączymy obie probówki z 1,5 milicala jednego XFSB.

Dodaj również 15 mikrolitrów DNA plemników. Teraz obracaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie wiruj przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Usunąć supernatant i dodać 200 mikrolitrów jednego XFSB.

Teraz dodaj 90 mikrolitrów prędkości agro do każdej próbki wytrącania chromatyny, a następnie obracaj je o cztery stopnie przez godzinę. W celu kontroli ujemnej dodaj jeden mils jednego XFSB do pozostałych prędkości acro i obracaj go wraz z próbką immunoprecypitacji chromatyny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Podczas godzinnej inkubacji możemy skorzystać z okazji, aby zrobić sobie świeży bufor rozdzielczości.

Zostanie to wykorzystane w dalszej części eksperymentu po godzinie trwania. Wirówkę inkubacyjną umieścić w próbkach i kontroli ujemnej przy 0,1 CFS przez 30 sekund i odrzucić supernatant. Następnie umyjemy koraliki czterema różnymi rodzajami roztworów myjących, buforem do płukania o niskiej zawartości soli, buforem do płukania o wysokiej zawartości soli, roztworem chlorku litu i wreszcie buforem TE o pH ósmym.

Dla każdego buforu, z wyjątkiem roztworu chlorku litu, będziemy obracać próbki przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowywać je przy 0,1 R Cs przez 30 sekund. W przypadku mycia chlorkiem litu należy obracać próbki w temperaturze pokojowej tylko przez jedną minutę. Po każdym praniu wyrzuć supinat i użyj odkurzacza.

Teraz jesteśmy gotowi, aby przejść do elucji naszych próbek. Aby rozpocząć etap elucji, do każdej próbki dodajemy 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu elu. Obracaj próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie w temperaturze 0,4 RCF przez jedną minutę.

Teraz zachowaj supernatant w probówce o średnicy dwóch mil. Następnie dodaj 250 mikrolitrów buforu ewolucyjnego do każdej próbki. Jeszcze raz wiruj je wszystkie ręcznie przez kilka sekund.

Następnie wirować próbki przez 15 minut po wirowaniu przez 15 minut, obracać probówki w wirówce. Dodaj 16 RCF przez cztery minuty i zachowaj snat w tych samych dwóch probówkach z oringiem. Aby strawić białko w naszych próbkach, najpierw dodaj 10 mikrolitrów 0,5 mola A DTA 25 mikrolitrów 0,8 molowego skrętu HCL L o pH 6,5 i 2,5 mikrolitrów 10 miligramów na miliproteinazę K do każdej próbki immunoprecypitacji chromatyny.

Obok każdej kontroli wejściowej dodaj 15 mikrolitrów buforu do lizy i 2,5 mikrolitra po 10 miligramów na ml. Proteinaza K inkubuje zarówno próbki wejściowe, jak i immunoprecypitacyjne chromatyny w 52 stopniach Celsjusza przez co najmniej trzy godziny. Teraz, gdy trzygodzinna inkubacja dobiegła końca, możemy kontynuować i rozpocząć ekstrakcję fenylochloro Fromma.

Po trzygodzinnej inkubacji dodajemy 500 mikrolitrów fenylochlorofrommu do każdej próbki. Odbywa się to w kapturze ze względu na fakt, że chloroform fenylowy jest organiczną substancją chemiczną, która jest zarówno szkodliwa, jeśli wejdzie w kontakt ze skórą, jak i wdychana. Następnie wirujemy wszystkie próbki przez kilka sekund i odwirowujemy je w temperaturze 13 RCF przez pięć minut po odwirowaniu.

W probówkach powinny znajdować się dwie fazy. Ponieważ interesuje nas zawartość górnej fazy, wyjmujemy górną fazę i umieszczamy ją w tubie o grubości dwóch mililitrów. Następnie do każdej próbki dodaje się mieszaninę dwóch mikrolitrów glikogenu i 50 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu wraz z 1,375 mililitra stuprocentowego etanolu.

Wszystkie próbki są energicznie wirowane i umieszczane na noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji próbki umieszcza się na lodzie w celu rozmrożenia. Są to gęste wirówki w temperaturze 15 RCF przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij natynkę SUP, nie naruszając osadu na dnie probówki. Następnie dodaj jeden mil zimnego, 75% etanolu do każdej próbki i odwróć je wszystkie cztery do sześciu razy. Probówki są następnie ponownie odwirowywane w temperaturze 18 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Supernatant jest ponownie usuwany, a granulki pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu granulki rozpuszcza się je w 50 mikrolitrach czteromilimolowego śladowego HCL o pH osiem i przechowuje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do czasu dalszego użycia, cóż, właśnie pokazałem wam, jak przeprowadzić wytrącanie immunologiczne chromatyny na zamrożonej ludzkiej tkance mózgowej pośmiertnej.

I pamiętaj, że podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby podjąć wszystkie niezbędne środki ostrożności w przypadku ludzkiej tkanki mózgowej, chromatyny, testy immunoprecypitacji można zastosować, aby dodać dodatkową warstwę zrozumienia ekspresji genów zarówno w normalnym, jak i chorym ludzkim mózgu. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.