Analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

Witajcie, nazywam się Amish Matan i pracuję w laboratorium dr Sha Mc Barian w wydziale psychiatrii UMass Medical School. Dzisiaj zaprezentuję procedurę immunoprecypitacji chromatyny w tkance mózgowej człowieka pobranej po śmierci. Poniższa procedura nie jest zbyt skomplikowana.

Najbardziej ekscytujące jest to, że do niedawna badania nad ekspresją w ludzkim mózgu ograniczały się do prostego oznaczania ilościowego mRNA i białek. Ta konkretna technika pozwoli nam lepiej zrozumieć mechanistyczne podstawy ekspresji genów zarówno w zdrowym, jak i chorym ludzkim mózgu. Przejdźmy zatem do immunoprecypitacji chromatyny.

Zaczęliśmy od wcześniej wypreparowanej, zamrożonej tkanki mózgu ludzkiego pobranej po śmierci. Ważne jest stosowanie okularów ochronnych oraz praca w wyznaczonym obszarze przeznaczonym do kontaktu z tkanką ludzką. Podczas przetwarzania tych próbek tkanka mózgu jest zalewana buforem down sink w ilości pięciokrotnej objętości mózgu.

Gdy cała tkanka stanie się jednorodna w roztworze, można ją przenieść do probówki o pojemności 2 ml. Po homogenizacji tkanki do próbki należy dodać pięć jednostek na ml mikrokokalnukleazy i wymieszać roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie należy umieścić próbkę w lodzie.

Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko, ponieważ nukleaza mikrokokkowa wykazuje aktywność nawet w temperaturze 4 °C. Po potraktowaniu wszystkich próbek nukleazą mikrokokkową, szybko przenosimy je do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubujemy przez siedem minut.

Po siedmiominutowej inkubacji dodajemy 0,5 M EDTA do stężenia 10 mM, aby zatrzymać aktywność nukleazy mikrokokalnej. W tym momencie możemy przejść do etapu izolacji. Po potraktowaniu próbek nukleazą mikrokokalną, próbki zawierające nukleosomalne DNA zostaną poddane izolacji.

Nava weźmie probówkę Falcon 15 ml, do której dodamy 4,5 ml 0,2 mM EDTA, 2,5 µl 0,2 M benadyny oraz 4,5 µl 0,1 M PMSF. Następnie przeniesiemy do tej probówki naszą próbkę. Teraz inkubujemy próbkę przez jedną godzinę na lodzie, mieszając ją w wirówce typu vortex co 10 minut.

Po godzinnej inkubacji dodajemy 2,5 µL DTT o stężeniu 3 M. Próbkę ponownie mieszamy w wortexie, a następnie wirujemy w rotorze z koszykami przy 3175 RCF przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu supernatant rozdzielamy w taki sposób, aby 500 µL wykorzystać jako kontrolę wejściową, zawierającą wyłącznie DNA genomiczne, a pozostałą część rozdzielamy do dwóch probówek po 1600 µL każdej, które będą stanowiły nasze próbki do immunoprecypitacji chromatyny.

Kontrolę wejściową przechowuje się w temperaturze -80 °C przez noc do czasu dalszego użycia. Następnie dodajemy 160 µL 10 XFSB, co stanowi 1/10 objętości próbki. Do mieszaniny dodajemy 4 µg przeciwciała.

Następnie wymieszaj próbki w wirówce vortex, a potem inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po nocnej inkubacji przemyjemy kulki proteinowe, które posłużą do wyizolowania nukleosomalnego DNA. Ze względu na to, że kulki agro są bardzo delikatne, podczas pracy z nimi konieczne jest odcięcie końcówek tipsów pipetowych.

Ma to na celu zapewnienie większej przestrzeni dla kulek podczas pipetowania. Teraz należy dodać 1,6 µl kulek XFS 1X do 245 µl białek jaguars do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml. Taka ilość powinna wystarczyć dla czterech probówek z próbką.

Następnie podziel roztwór kulek do dwóch probówek o pojemności 2 ml i uzupełnij każdą z nich do objętości 1,6 ml za pomocą jednego XFSB. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund na rotatorze, a następnie odwiruj je przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Po wirowaniu usuń ATE za pomocą próżni.

Dodaj 1,6 ml 1X XFSB. Ponownie rotuj próbki przez 30 sekund na rotatorze, a następnie ponownie odwiruj je przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Po wirowaniu ponownie usuwamy nadsącz i łączymy obie probówki, dodając 1,5 ml 1X XFSB.

Następnie dodaj 15 µL DNA plemników. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając próbkę, a następnie odwiruj przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Usuń nadosad i dodaj 200 µL 1x FSB.

Następnie należy dodać 90 µL agro beads do każdej próbki precypitacji chromatyny, a następnie inkubować je w rotatorze w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. Jako kontrolę negatywną należy dodać 1 mL 1X FSB do pozostałych agro beads i inkubować je wraz z próbką immunoprecypitacji chromatyny w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. W czasie tej jednogodzinnej inkubacji można przygotować świeży bufor do resuspensji.

Zostanie to wykorzystane w późniejszym etapie eksperymentu, po godzinnej inkubacji. Przecentryfuguj próbki oraz kontrolę negatywną z prędkością 0,1 CFS przez 30 sekund i odlej nadsącz. Następnie przemyj kuleczki czterema różnymi rodzajami roztworów płuczących: buforem płuczącym o niskim zasoleniu, buforem płuczącym o wysokim zasoleniu, roztworem chlorku litu, a na koniec buforem TE o pH 8.

W przypadku każdego buforu, z wyjątkiem roztworu chlorku litu, próbki należy rotować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 0.1 R Cs przez 30 sekund. W przypadku przemywania chlorkiem litu próbki rotuj w temperaturze pokojowej tylko przez jedną minutę. Po każdym przemywaniu usuń nadsącz za pomocą próżni.

Teraz możemy przystąpić do elucji naszych próbek. Aby rozpocząć etap elucji, dodajemy 250 µL świeżo przygotowanego buforu do elucji do każdej próbki. Próbki rotujemy przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirujemy z prędkością 0,4 RCF przez jedną minutę.

Następnie należy przenieść nadsącz do probówki typu 2 ml w kolorze pomarańczowym. Do każdej próbki dodać 250 µL buforu do elucji. Ponownie wymieszać wszystkie próbki w vorteksie ręcznie przez kilka sekund.

Następnie wymieszać próbki na wirówce laboratoryjnej przez 15 minut; po 15 minutach wirowania odwirować probówki w wirówce. Ustawić 16 RCF na cztery minuty i przenieść supernatant do tej samej probówki 2 ml. Aby strawić białka w próbkach, do każdej próbki z immunoprecypitacji chromatyny dodać najpierw 10 µL 0,5 M DTA, 25 µL 0,8 M Tris-HCl o pH 6,5 oraz 2,5 µL proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL.

Do każdej próbki kontrolnej (input) dodaj 15 µL buforu do lizy oraz 2,5 µL Proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL. Inkubuj próbki kontrolne oraz próbki z immunoprecypitacji chromatyny w temperaturze 52 °C przez co najmniej trzy godziny. Po zakończeniu trzygodzinnej inkubacji można przejść do ekstrakcji fenolo-chloroformowej.

Po trzechgodzinnej inkubacji do każdej próbki dodajemy 500 µL fenylochloroformu. Czynność tę wykonujemy w dygestorium, ponieważ fenylochloroform jest związkiem organicznym szkodliwym zarówno w przypadku kontaktu ze skórą, jak i przy wdychaniu. Następnie wszystkie próbki mieszamy na wibratorze (vortex) przez kilka sekund, a potem wirujemy z prędkością 13 RCF przez pięć minut.

W probówkach powinny znajdować się dwie fazy. Ponieważ interesuje nas zawartość górnej fazy, pobieramy ją i przenosimy do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 2 ml. Następnie do każdej próbki dodaje się mieszaninę 2 µL glikogenu i 50 µL 3 M octanu sodu wraz z 1,375 ml 100% etanolu.

Wszystkie próbki należy energicznie wymieszać w wirówce typu vortex i pozostawić w temperaturze -80 °C przez noc. Po nocnej inkubacji próbki umieszcza się na lodzie w celu rozmrożenia. Następnie poddaje się je wirowaniu przy 15 RCF przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu ostrożnie usuń nadkład z roztworu natin, nie naruszając osadu na dnie probówki. Następnie do każdej próbki dodaj 1 ml zimnego, 75% etanolu i odwróć probówki od czterech do sześciu razy. Następnie próbki ponownie wiruj przy 18 RCF przez pięć minut w temperaturze 4°C.

Ponownie usuwa się supernatant, a osady pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu osady rozpuszcza się w 50 µL śladowego HCl o stężeniu 4 mM i pH 8, a następnie przechowuje w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. W ten sposób zaprezentowałem, jak przeprowadzić immunoprecypitację chromatyny w zamrożonej tkance mózgu człowieka pobranej po śmierci.

Należy pamiętać, że podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie wszelkich niezbędnych środków ostrożności przy pracy z tkanką mózgu człowieka. Chromatynowe testy immunoprecypitacji mogą zostać wykorzystane do pogłębienia zrozumienia ekspresji genów zarówno w prawidłowym, jak i chorobowo zmienionym mózgu człowieka. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.