Analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

Witajcie, nazywam się Amish Matan i pochodzę z laboratorium dr Sha Mc Bariana w katedrze psychiatrii UMass Medical School. Dzisiaj zaprezentuję procedurę immunoprecypitacji chromatyny w tkance mózgowej człowieka pobranej po śmierci. Poniższa procedura nie jest zbyt skomplikowana.

Najbardziej ekscytujące jest to, że do niedawna badania ekspresji w ludzkim mózgu ograniczały się do prostej kwantyfikacji mRNA i białek. Ta konkretna technika pozwoli nam lepiej zrozumieć mechanistyczne podstawy ekspresji genów zarówno w zdrowym, jak i chorobowym ludzkim mózgu. Przejdźmy zatem do immunoprecypitacji chromatyny.

Rozpoczęliśmy od wcześniej wypreparowanej, zamrożonej tkanki ludzkiego mózgu pobranej pośmiertnie. Ważne jest stosowanie okularów ochronnych oraz praca w wyznaczonym obszarze przeznaczonym do kontaktu z tkanką ludzką. Podczas przetwarzania tych próbek, tkankę mózgową zalewa się buforem down sink w ilości pięciokrotnie przekraczającej objętość mózgu.

Gdy cała tkanka w roztworze wyda się jednorodna, można ją przenieść do probówki o pojemności dwóch ml. Po homogenizacji tkanki należy dodać do próbki pięć jednostek mikrokokalnukleazy na ml i wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół. Następnie należy umieścić próbkę w lodzie.

Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko, ponieważ nukleaza mikrokokkowa wykazuje aktywność nawet w temperaturze 4 °C. Po potraktowaniu wszystkich próbek nukleazą mikrokokkową szybko przenosimy je do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubujemy przez siedem minut.

Po siedmiominutowej inkubacji dodajemy EDTA o stężeniu 0,5 M do stężenia końcowego 10 mM, aby zatrzymać aktywność nukleazy mikrokokkowej. Teraz możemy przejść do etapu puryfikacji. Po potraktowaniu próbek nukleazą mikrokokkową, próbki zawierające DNA nukleosomalne zostaną poddane puryfikacji.

Nava weźmie probówkę Falcon 15 ml, do której dodamy 4,5 ml 0,2 mM EDTA, 2,5 µl 0,2 M benadyny oraz 4,5 µl 0,1 M PMSF. Następnie przeniesiemy do tej probówki próbkę. Próbkę inkubujemy przez jedną godzinę w lodzie, mieszając ją w wirówce typu vortex co 10 minut.

Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji dodamy 2,5 µL 3 M DTT. Próbkę ponownie wymieszamy w wirówce typu vortex, a następnie odwirujemy w rotorze z koszyczkami przy 3 175 RCF przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu nad supernatant zostanie rozdzielony w taki sposób, aby 500 µL posłużyło jako kontrola wejściowa, zawierająca wyłącznie DNA genomowe, a pozostała część zostanie rozdzielona do dwóch probówek po 1 600 µL każdej, które będą naszymi próbkami do immunoprecypitacji chromatyny.

Kontrolę wejściową umieszcza się w temperaturze -80 °C przez noc do czasu dalszego użycia. Następnie dodajemy 160 µL 10 XFSB, co stanowi jedną dziesiątą objętości naszej próbki. Do tego dodajemy cztery µg przeciwciała.

Następnie wymieszaj próbki w wirówce typu vortex, a potem inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsius overnight. Po nocnej inkubacji przemyjemy kulki białkowe, które zostaną wykorzystane do izolacji nukleosomowego DNA. Ponieważ kulki agro są bardzo delikatne, podczas pracy z nimi konieczne jest odcięcie końcówek końcówek pipet.

Ma to na celu zapewnienie większej przestrzeni dla kulek podczas pipetowania. Teraz należy dodać 1,6 ml kulek XFS 1X do 245 µl białek jaguars do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml. Powinno to wystarczyć na cztery probówki z próbką.

Następnie podziel roztwór kulek do dwóch probówek o pojemności 2 ml i uzupełnij każdą z nich do objętości 1,6 ml za pomocą jednego XFSB. Rotuj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund na rotatorze, a następnie odwiruj je przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Po wirowaniu usuń ATE za pomocą odsysacza próżniowego.

Dodaj 1,6 ml 1X XFSB. Ponownie rotuj próbki przez 30 sekund na rotatorze, a następnie odwiruj je ponownie przy 0,1 RCF FS przez 30 sekund. Po wirowaniu ponownie usuwamy nadsącz i łączymy zawartość obu probówek w 1,5 ml 1X XFSB.

Dodaj również 15 µL DNA plemników. Następnie rotuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a potem wiruj przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Odlej nadsącz i dodaj 200 µL 1X FSB.

Teraz należy dodać 90 µL agro-beads do każdej próbki wytrącania chromatyny, a następnie rotować je w temperaturze 4°C przez jedną godzinę. W celu przygotowania kontroli negatywnej, do pozostałych agro-beads należy dodać 1 mL 1X FSB i rotować je wraz z próbką immunoprecypitacji chromatyny w temperaturze 4°C przez jedną godzinę. Podczas godzinnej inkubacji można wykorzystać czas na przygotowanie świeżego buforu do elucji.

Zostanie to wykorzystane później w eksperymencie, po godzinnej inkubacji. Odwiruj próbki oraz kontrolę negatywną z prędkością 0,1 CFS przez 30 sekund i odlej nadsącz. Następnie przemyj kuleczki czterema różnymi rodzajami roztworów płuczących: buforem płuczącym o niskim stężeniu soli, buforem płuczącym o wysokim stężeniu soli, roztworem chlorku litu, a na koniec buforem TE o pH 8.

W przypadku każdego buforu z wyjątkiem roztworu chlorku litu, próbki należy rotować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przy 0.1 R Cs przez 30 sekund. W przypadku przemywania chlorkiem litu, próbki rotuje się w temperaturze pokojowej tylko przez jedną minutę. Po każdym przemywaniu należy odpić nadsącz za pomocą odsysacza próżniowego.

Jesteśmy teraz gotowi do elucji próbek. Aby rozpocząć etap elucji, dodajemy 250 µL świeżo przygotowanego buforu do elucji do każdej próbki. Próbki rotujemy przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirujemy przy 0,4 RCF przez jedną minutę.

Następnie przenieś nadsącz do probówki typu 2 ml w kolorze pomarańczowym. Do każdej próbki dodaj 250 µL buforu do elucji. Ponownie wymieszaj wszystkie próbki w wirówce typu vortex ręcznie przez kilka sekund.

Następnie wymieszaj próbki w wibratorze przez 15 minut, a po tym czasie wiruj probówki w wirówce. Ustaw 16 RCF na cztery minuty i przenieś nadsącz do tej samej probówki 2 ml. Aby strawić białko w próbkach, do każdej próbki z immunoprecypitacji chromatyny dodaj najpierw 10 µL 0,5 M DTT, 25 µL 0,8 M Tris-HCl o pH 6,5 oraz 2,5 µL proteinazy K w stężeniu 10 mg/mL.

Do każdej kontroli wejściowej dodaj 15 µL buforu do lizy oraz 2,5 µL Proteinazy K w stężeniu 10 mg/mL. Inkubuj zarówno próbki wejściowe, jak i próbki z immunoprecypitacji chromatyny w temperaturze 52 °C przez co najmniej trzy godziny. Po zakończeniu trzygodzinnej inkubacji można przystąpić do ekstrakcji fenolo-chloroformowej.

Po trzechgodzinnej inkubacji do każdej próbki dodajemy 500 µL chloroformu fenylowego. Czynność tę wykonujemy w dygestorium, ponieważ chloroform fenylowy jest związkiem organicznym, który jest szkodliwy zarówno w przypadku kontaktu ze skórą, jak i w drodze wziewnej. Następnie wszystkie próbki mieszamy w wirówce typu vortex przez kilka sekund, a po wirowaniu centrifugujemy je przy 13 RCF przez pięć minut.

W probówkach powinny znajdować się dwie fazy. Ponieważ interesuje nas zawartość fazy górnej, pobierzemy ją i przeniesiemy do probówki typu microcentrifuge o pojemności 2 ml. Następnie do każdej próbki dodaje się mieszaninę 2 µL glikogenu i 50 µL 3 M octanu sodu wraz z 1,375 ml 100% etanolu.

Wszystkie próbki należy energicznie wymieszać w wortexie, a następnie pozostawić w temperaturze -80 °C przez noc. Po inkubacji nocnej próbki należy rozmrozić na lodzie. Następnie poddaje się je wirowaniu przy 15 RCF przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz, nie naruszając osadu na dnie probówki. Następnie do każdej próbki dodaj 1 ml zimnego, 75% etanolu i odwróć wszystkie probówki od czterech do sześciu razy. Następnie probówki ponownie wiruje się przy 18 RCF przez pięć minut w temperaturze 4°C.

Ponownie usuwa się nadsącz i pozwala osadom wyschnąć na powietrzu. Po wyschnięciu osady rozpuszcza się w 50 µL 4 mM śladowego HCl o pH 8 i przechowuje w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. W ten sposób zaprezentowano metodę przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny z zamrożonej tkanki mózgowej człowieka pobranej po śmierci.

I pamiętajcie, że podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie wszelkich niezbędnych środków ostrożności przy pracy z tkanką mózgu człowieka. Analizy immunoprecypitacji chromatyny mogą zostać wykorzystane do pogłębienia wiedzy na temat ekspresji genów zarówno w zdrowym, jak i chorym ludzkim mózgu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.