Name: Test chromatyny dla ludzkiej tkanki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj technikę ChIP do analizy metylacji histonów w tkance mózgowej pośmiertnej. Ta metoda pozwala badać epigenetyczną regulację ekspresji genów w normalnym i chorym mózgu człowieka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant z National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

Procedura:
1st Dzień
1. Homogenizować 50-500 mg zamrożonej tkanki istoty szarej pobranej po śmierci w buforze do homogenizacji (Douncing Buffer).
! UWAGA ! - Tkanki ludzkie należy obchodzić z ostrożnością, w rygorystycznych warunkach bezpieczeństwa. Należy je przetwarzać zgodnie ze standardami bezpieczeństwa poziomu BSL-2 lub wyższego.
<ol>
<li>Wyjąć wcześniej wypreparowany mózg pośmiertny z temperatury -80°C, rozhomogenizować go za pomocą homogenizatora Dounce w 5-krotnej objętości buforu do homogenizacji (Douncing Buffer) i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,0 mL. Pary dopasowanych próbek i kontroli należy przetwarzać jednocześnie.</li>
</ol>
2. Trawienie nukleazą mikrokokkową (MN)
<ol>
<li>Do próbki dodać nukleazę mikrokokkową w stężeniu 5U/mL i wymieszać roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie umieścić na lodzie. *&nbsp;KROK KRYTYCZNY -&nbsp;Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko, ponieważ MN wykazuje aktywność nawet w temperaturze 4°C.</li>
<li>Inkubować próbki przez 7 minut w temperaturze 37°C.</li>
<li>Po 7-minutowej inkubacji dodać EDTA 0.5M do stężenia końcowego 10mM, aby zatrzymać aktywność MNazy.</li>
</ol>
3. Hipotonizacja
<ol>
<li>Przenieść próbki do probówki typu Falcon o pojemności 15 mL. Dodać 10-krotność objętości próbki 0,2mM EDTA, 1/2000 objętości próbki 0,2M benzamidyny oraz 1/1000 objętości próbki 0,1M fenylometanosulfonylofluororku (PMSF). Te dwa ostatnie związki są stosowane jako inhibitory proteaz. *&nbsp;KROK KRYTYCZNY -&nbsp;Ważne jest, aby podczas wszystkich tych etapów przechowywać próbki w lodzie.</li>
<li>Inkubować próbkę przez 1 godzinę, mieszając ją w vortexie co 10 minut.</li>
<li>Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji dodać 1/2000 objętości próbki 3M DTT, który jest kolejnym inhibitorem proteaz.</li>
<li>Ponownie wymieszać próbkę w vortexie i odwirować przy 3175 RCF przez 10 minut w temperaturze 4°C. *&nbsp;KROK OPCJONALNY - Oczyszczanie wstępne za pomocą agarozy z białkiem G.<ol>
<li>Odbrać nadsącz i przenieść go do nowej probówki typu Falcon o pojemności 15 mL.</li>
<li>Dodać 500 µL agarozy z białkiem G.</li>
<li>Mieszać rotacyjnie w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
<li>Odwirować przy 4000 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C.</li>
</ol></li>
<li>Rozdzielić nadsącz w taki sposób, aby 500 µL wykorzystać jako kontrolę Input (zawierającą wyłącznie DNA genomiczne), a pozostałą część podzielić na dwie probówki zawierające po 1600 µL próbki — które posłużą jako próbki do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).</li>
<li>Kontrolę Input umieścić w temperaturze -80°C O/N do czasu dalszego użycia.</li>
<li>Do próbek ChIP dodać 1:10 objętości 10XFSB oraz 4μg przeciwciała, następnie wymieszać próbki w vortexie i inkubować rotacyjnie w temperaturze 4°C przez noc. ! UWAGA ! - Ilość i rozcieńczenie przeciwciała mogą wymagać optymalizacji.</li>
</ol>
2nd Dzień
! UWAGA ! -&nbsp;Rozpocznij 2nd dzień, myjąc agarozę z białkiem G, która zostanie wykorzystana do izolacji DNA nukleosomalnego. Ze względu na wysoką wrażliwość kuleczek agarozowych, podczas pipetowania każdego roztworu zawierającego te kuleczki należy odcinać końcówki końcówek do pipet.
1. Badanie wiązania kuleczek agarozy z białkiem G z DNA
<ol>
<li>Do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL dodać 1,6 mL 1XFSB do 245 µL agarozy z białkiem G (ilość wystarczająca na 4 probówki) (pętla).</li>
<li>Rozdzielić roztwór do dwóch probówek o pojemności 2 mL i uzupełnić każdą do objętości 1,6 mL za pomocą 1X FSB.</li>
<li>Mieszać w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie wirować przy 0,1 RCF przez 30 s.</li>
<li>Usunąć nadsącz za pomocą odsysacza próżniowego.</li>
<li>Ponownie dodać 1,6 mL 1X FSB. Mieszać próbki w rotatorze przez 30 s, a następnie wirować przy 0,1 RCF przez 30 s.</li>
<li>Ponownie usunąć nadsącz, a następnie połączyć zawartość obu probówek z 1,5 mL 1XFSB.</li>
<li>Dodać 15 µL sonikowanego DNA z plemników łososia (10mg/mL). ! UWAGA ! - Krok ten powinien w zasadzie ograniczyć nieswoiste wiązanie immunoprecypitatu z kuleczkami. Jednakże może to również prowadzić do wyników fałszywie dodatnich dla niektórych sekwencji DNA (ludzkiego).</li>
<li>Mieszać w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie wirować przy 0,1 RCF przez 30 s.</li>
<li>Usunąć nadsącz. Dodać 200 μL 1XFSB.</li>
<li>Do każdej próbki ChIP dodać 90 µL kuleczek agarozowych. Mieszać w rotatorze w temperaturze 4°C przez 1 h.</li>
<li>Do pozostałych kuleczek agarozowych dodać 1mL 1XFSB, aby służyły jako kontrola negatywna, i mieszać w rotatorze w temperaturze 4°C przez 1 h.&nbsp;</li>
<li>Po godzinnej inkubacji wirować próbki oraz kontrolę negatywną przy 0,1 RCF przez 30 s. Odrzucić nadsącz.</li>
</ol>
2. Przemywanie kulek
! OSTROŻNIE ! -&nbsp;Bufory do płukania należy przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia i stosować wyłącznie, jeśli nie minął miesiąc od ich przygotowania.
<ol>
<li>Do kulek dodać 1 mL każdego roztworu piorącego i rotować przez 3 min w RT.</li>
<li>Wirować przy 0.1 RCF przez 30 sec.&nbsp;</li>
<li>Usunąć nadsącz za pomocą odsysacza próżniowego.</li>
</ol>
* Każdy roztwór piorący
-- Bufor do płukania z niską zawartością soli
-- Bufor do płukania z wysoką zawartością soli
-- Roztwór chlorku litu - rotować tylko w temperaturze pokojowej przez 1 minutę!
-- bufor TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH=8)
3. Elucja
*&nbsp;KROK KRYTYCZNY - Przed każdym eksperymentem należy przygotować świeży bufor elucyjny w dniu jego użycia.
<ol>
<li>Do każdej próbki dodać 250 µL świeżo przygotowanego buforu elucyjnego.</li>
<li>Inkubować w rotacji przez 15 min w RT, a następnie odwirować przy 0,4 RCF przez 1 min.</li>
<li>Nadpłyn przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,0 mL (pętla).</li>
<li>Do każdej próbki dodać 250 µL buforu elucyjnego i wymieszać ręcznie w wstrząsarze typu vortex przez kilka sekund. Następnie mieszać próbki w wstrząsarzu wieloprzóbkowym przez 15 minut.</li>
<li>Odwirować przy 16 RCF przez 4 minuty i zebrać nadpłyn do tej samej probówki 2,0 mL (pętla).</li>
</ol>
4. Trawienie białka
<ol>
<li>Do każdej próbki ChIP dodać 10 μl 0.5M EDTA, 25 μl 0.8M Tris-HCl, pH 6.5 oraz 10 mg/ml Proteinazy K (1/200 objętości próbki).</li>
<li>Do każdej kontroli Input dodać bufor lizujący do trawienia proteinazą K (1/10 objętości buforu do próbek) oraz 10 mg/ml Proteinazy K (1/200 objętości buforu do próbek).</li>
<li>Inkubować próbki Input i ChIP w temperaturze 52°C przez co najmniej 3 h.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa
! UWAGA ! - Eksperyment wymagający użycia fenolu/chloroformu należy przeprowadzić pod wyciągiem. Podczas pracy z fenolem/chloroformem należy używać rękawiczek nitrylowych.
<ol>
<li>Po 3-godzinnej inkubacji do każdej próbki dodajemy 500 μl fenolu z chloroformem.</li>
<li>Wszystkie próbki mieszamy na wirówce typu vortex przez kilka sekund, a następnie wirujemy przy 13 RCF rpm przez 5 min.</li>
<li>Na tym etapie powstaną dwie fazy, a nas interesuje zawartość fazy górnej.&nbsp; Pobieramy fazę górną i przenosimy ją do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL.</li>
<li>Do każdej próbki dodajemy mieszaninę 2µL glikogenu i 50µL 3M octanu sodu wraz z 1,375 mL 100% etanolu.</li>
<li>Wszystkie próbki intensywnie mieszamy na wirówce typu vortex. Następnie pozostawiamy je w temperaturze -80°C przez noc.</li>
</ol>
Dzień 3rd
<ol>
<li>Wyjąć próbki z temperatury -80°C i umieścić je na lodzie w celu rozmrożenia.</li>
<li>Wirować przy 15 RCF przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Ostrożnie usunąć nadsącz, aby nie naruszyć osadu na dnie probówki.</li>
<li>Do każdej próbki dodać 1 mL zimnego 75% etanolu, &nbsp;następnie odwrócić probówki 4-6 razy.</li>
<li>Wirować przy 18 RCF przez 5 min w temperaturze 4°C.</li>
<li>Ponownie usunąć nadsącz i pozostawić osady do wysuszenia na powietrzu.</li>
<li>Rozpuścić wysuszone osady w 50 µL 4mM Tris-HCl, pH8 i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu jest szczególnie przydatny dla badaczy zainteresowanych sygnaturami metylacji histonów i/lub DNA w ludzkim mózgu, ponieważ te modyfikacje chromatyny mogą być mniej podatne na artefakty pośmiertne w porównaniu z innymi rodzajami modyfikacji, takimi jak acetylacja i fosforylacja (histonów)1, 2. Mózg pośmiertny nadaje się do badania preparatów mononukleosomalnych; DNA pozostaje w dużej mierze związane z histonami rdzeniowymi, przynajmniej w próbkach z reprezentatywnymi od...

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>EMD Millipore</td><td>9310</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>OmniPur, EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, roztwór 0,5 M, pH 8,0</td><td>OmniPur, EMD Millipore</td><td>4055</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór SDS 10% (m/v)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7277-250G</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (bezwodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2889</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa ze Staphylococcus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755-200UN</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidyna</td><td>Fluka</td><td>12072</td><td></td></tr><tr><td>Fenylometanosulfonylofluorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-1G</td><td></td></tr><tr><td>3M DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza z białkiem G, Fast Flow</td><td>Upstate, Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do DNA z nasienia łososia poddanego sonikacji</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201190</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K z Engyodontium album</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform 1:1</td><td>OmniPur, EMD Millipore</td><td>6810</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen, z małży</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy (100%)</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;silny&gt;Roztwory:&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Bufor do rozbijania tkanek w nChIP: 10 mM Tris, 4 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; dostosować pH do wartości 7,5&lt;/li&gt;&lt;li&gt;10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl, pH dostosować do 7,5&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor do płukania o niskiej zawartości soli: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor do płukania z wysoką zawartością soli: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor chlorku litu: 1% IGEPAL-CA 630, 1% kwasu deoksycholowego, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl&lt;/li&gt;&lt;li&gt;bufor TE: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor elucyjny: 0,1 M NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1% SDS&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor do trawienia proteinazą K (10X): 1 M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2 M NaCl, pH skorygowane do 8,0&lt;/li&gt;&lt;li&gt;3 M octan sodu: 24,61 g bezwodnego octanu sodu (masa cząsteczkowa = 82,03) w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej. pH dostosować do wartości 5,2 za pomocą stężonego kwasu octowego.&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Bufor do rozbijania tkanek w nChIP: 10 mM Tris, 4 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; dostosować pH do wartości 7,5&lt;/li&gt;&lt;li&gt;10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl, pH dostosować do 7,5&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor do płukania o niskiej zawartości soli: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor do płukania z wysokim stężeniem soli: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor z chlorkiem litu: 1% IGEPAL-CA 630, 1% kwasu deoksycholowego, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl&lt;/li&gt;&lt;li&gt;bufor TE: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor elucyjny: 0,1 M NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1% SDS&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor do trawienia proteinazą K (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl, pH dostosowane do 8,0&lt;/li&gt;&lt;li&gt;3 M octan sodu: 24,61 g bezwodnego octanu sodu (masa cząsteczkowa = 82,03) w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej. pH należy dostosować do wartości 5,2 za pomocą stężonego kwasu octowego.&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Uważa się, że przewlekłe schorzenia neuropsychiatryczne, takie jak schizofrenia, choroba afektywna dwubiegunowa i autyzm, wynikają z kombinacji czynników genetycznych i środowiskowych, które mogą prowadzić do epigenetycznych zmian w ekspresji genów oraz innych patologii molekularnych. Tradycyjnie badania ekspresji w materiale mózgu pobranym po śmierci ograniczano jednak do ilościowego oznaczania mRNA lub białek. Ograniczenia występujące w badaniach mózgu postmortem, takie jak zmienność czasu autolizy i stopnia integralności tkanek, prawdopodobnie wpływają również na wszelkie badania struktur chromatyny wyższego rzędu. Niemniej jednak organizacja nukleosomowa DNA genomicznego – w tym wiązanie DNA z histonami rdzeniowymi – wydaje się być w znacznym stopniu zachowana w reprezentatywnych próbkach dostarczanych przez różne banki tkanek mózgowych. W związku z tym możliwe jest badanie wzorców metylacji oraz innych kowalencyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych w określonych loci genomicznych w materiale mózgu postmortem. W niniejszej pracy przedstawiamy uproszczony protokół natywnej immunoprecypitacji chromatyny (NChIP) dla zamrożonych (nigdy nieutrwalanych) preparatów ludzkiego mózgu. Rozpoczynając od trawienia homogenatów mózgowych nukleazą mikrokokkową, procedurę NChIP z następującym po niej qPCR można ukończyć w ciągu trzech dni. Przedstawiona tutaj metodologia powinna być użyteczna w wyjaśnianiu epigenetycznych mechanizmów ekspresji genów w zdrowym i chorym ludzkim mózgu.

Do niedawna badania nad ekspresją w ludzkim mózgu ograniczały się do ilościowego oznaczania RNA lub białek. Dzięki technikom immunoprecypitacji chromatyny opisanym w niniejszej pracy, możliwe będzie mapowanie metylacji histonów oraz innych epigenetycznych regulatorów ekspresji genów w materiale mózgu pobranym po śmierci.

Analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

Uważa się, że przewlekłe schorzenia neuropsychiatryczne, takie jak schizofrenia, choroba afektywna dwubiegunowa i autyzm, wynikają z kombinacji czynników genetycznych i środowiskowych...

Witajcie, nazywam się Amish Matan i pochodzę z laboratorium dr Sha Mc Bariana w katedrze psychiatrii UMass Medical School. Dzisiaj zaprezentuję procedurę immunoprecypitacji chromatyny w tkance mózgowej człowieka pobranej po śmierci. Poniższa procedura nie jest zbyt skomplikowana.Najbardziej ekscytujące jest to, że do niedawna badania ekspresji w ludzkim mózgu ograniczały się do prostej kwantyfikacji mRNA i białek. Ta konkretna technika pozwoli nam lepiej zrozumieć mechanistyczne podstawy ekspresji genów zarówno w zdrowym, jak i chorobowym ludzkim mózgu. Przejdźmy zatem do immunoprecypitacji chromatyny.Rozpoczęliśmy od wcześniej wypreparowanej, zamrożonej tkanki ludzkiego mózgu pobranej pośmiertnie. Ważne jest stosowanie okularów ochronnych oraz praca w wyznaczonym obszarze przeznaczonym do kontaktu z tkanką ludzką. Podczas przetwarzania tych próbek, tkankę mózgową zalewa się buforem down sink w ilości pięciokrotnie przekraczającej objętość mózgu.Gdy cała tkanka w roztworze wyda się jednorodna, można ją przenieść do probówki o pojemności dwóch ml. Po homogenizacji tkanki należy dodać do próbki pięć jednostek mikrokokalnukleazy na ml i wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół. Następnie należy umieścić próbkę w lodzie.Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko, ponieważ nukleaza mikrokokkowa wykazuje aktywność nawet w temperaturze 4 °C. Po potraktowaniu wszystkich próbek nukleazą mikrokokkową szybko przenosimy je do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubujemy przez siedem minut.Po siedmiominutowej inkubacji dodajemy EDTA o stężeniu 0,5 M do stężenia końcowego 10 mM, aby zatrzymać aktywność nukleazy mikrokokkowej. Teraz możemy przejść do etapu puryfikacji. Po potraktowaniu próbek nukleazą mikrokokkową, próbki zawierające DNA nukleosomalne zostaną poddane puryfikacji.Nava weźmie probówkę Falcon 15 ml, do której dodamy 4,5 ml 0,2 mM EDTA, 2,5 µl 0,2 M benadyny oraz 4,5 µl 0,1 M PMSF. Następnie przeniesiemy do tej probówki próbkę. Próbkę inkubujemy przez jedną godzinę w lodzie, mieszając ją w wirówce typu vortex co 10 minut.Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji dodamy 2,5 µL 3 M DTT. Próbkę ponownie wymieszamy w wirówce typu vortex, a następnie odwirujemy w rotorze z koszyczkami przy 3 175 RCF przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu nad supernatant zostanie rozdzielony w taki sposób, aby 500 µL posłużyło jako kontrola wejściowa, zawierająca wyłącznie DNA genomowe, a pozostała część zostanie rozdzielona do dwóch probówek po 1 600 µL każdej, które będą naszymi próbkami do immunoprecypitacji chromatyny.Kontrolę wejściową umieszcza się w temperaturze -80 °C przez noc do czasu dalszego użycia. Następnie dodajemy 160 µL 10 XFSB, co stanowi jedną dziesiątą objętości naszej próbki. Do tego dodajemy cztery µg przeciwciała.Następnie wymieszaj próbki w wirówce typu vortex, a potem inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsius overnight. Po nocnej inkubacji przemyjemy kulki białkowe, które zostaną wykorzystane do izolacji nukleosomowego DNA. Ponieważ kulki agro są bardzo delikatne, podczas pracy z nimi konieczne jest odcięcie końcówek końcówek pipet.Ma to na celu zapewnienie większej przestrzeni dla kulek podczas pipetowania. Teraz należy dodać 1,6 ml kulek XFS 1X do 245 µl białek jaguars do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml. Powinno to wystarczyć na cztery probówki z próbką.Następnie podziel roztwór kulek do dwóch probówek o pojemności 2 ml i uzupełnij każdą z nich do objętości 1,6 ml za pomocą jednego XFSB. Rotuj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund na rotatorze, a następnie odwiruj je przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Po wirowaniu usuń ATE za pomocą odsysacza próżniowego.Dodaj 1,6 ml 1X XFSB. Ponownie rotuj próbki przez 30 sekund na rotatorze, a następnie odwiruj je ponownie przy 0,1 RCF FS przez 30 sekund. Po wirowaniu ponownie usuwamy nadsącz i łączymy zawartość obu probówek w 1,5 ml 1X XFSB.Dodaj również 15 µL DNA plemników. Następnie rotuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a potem wiruj przy 0,1 RCF przez 30 sekund. Odlej nadsącz i dodaj 200 µL 1X FSB.Teraz należy dodać 90 µL agro-beads do każdej próbki wytrącania chromatyny, a następnie rotować je w temperaturze 4°C przez jedną godzinę. W celu przygotowania kontroli negatywnej, do pozostałych agro-beads należy dodać 1 mL 1X FSB i rotować je wraz z próbką immunoprecypitacji chromatyny w temperaturze 4°C przez jedną godzinę. Podczas godzinnej inkubacji można wykorzystać czas na przygotowanie świeżego buforu do elucji.Zostanie to wykorzystane później w eksperymencie, po godzinnej inkubacji. Odwiruj próbki oraz kontrolę negatywną z prędkością 0,1 CFS przez 30 sekund i odlej nadsącz. Następnie przemyj kuleczki czterema różnymi rodzajami roztworów płuczących: buforem płuczącym o niskim stężeniu soli, buforem płuczącym o wysokim stężeniu soli, roztworem chlorku litu, a na koniec buforem TE o pH 8.W przypadku każdego buforu z wyjątkiem roztworu chlorku litu, próbki należy rotować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przy 0.1 R Cs przez 30 sekund. W przypadku przemywania chlorkiem litu, próbki rotuje się w temperaturze pokojowej tylko przez jedną minutę. Po każdym przemywaniu należy odpić nadsącz za pomocą odsysacza próżniowego.Jesteśmy teraz gotowi do elucji próbek. Aby rozpocząć etap elucji, dodajemy 250 µL świeżo przygotowanego buforu do elucji do każdej próbki. Próbki rotujemy przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirujemy przy 0,4 RCF przez jedną minutę.Następnie przenieś nadsącz do probówki typu 2 ml w kolorze pomarańczowym. Do każdej próbki dodaj 250 µL buforu do elucji. Ponownie wymieszaj wszystkie próbki w wirówce typu vortex ręcznie przez kilka sekund.Następnie wymieszaj próbki w wibratorze przez 15 minut, a po tym czasie wiruj probówki w wirówce. Ustaw 16 RCF na cztery minuty i przenieś nadsącz do tej samej probówki 2 ml. Aby strawić białko w próbkach, do każdej próbki z immunoprecypitacji chromatyny dodaj najpierw 10 µL 0,5 M DTT, 25 µL 0,8 M Tris-HCl o pH 6,5 oraz 2,5 µL proteinazy K w stężeniu 10 mg/mL.Do każdej kontroli wejściowej dodaj 15 µL buforu do lizy oraz 2,5 µL Proteinazy K w stężeniu 10 mg/mL. Inkubuj zarówno próbki wejściowe, jak i próbki z immunoprecypitacji chromatyny w temperaturze 52 °C przez co najmniej trzy godziny. Po zakończeniu trzygodzinnej inkubacji można przystąpić do ekstrakcji fenolo-chloroformowej.Po trzechgodzinnej inkubacji do każdej próbki dodajemy 500 µL chloroformu fenylowego. Czynność tę wykonujemy w dygestorium, ponieważ chloroform fenylowy jest związkiem organicznym, który jest szkodliwy zarówno w przypadku kontaktu ze skórą, jak i w drodze wziewnej. Następnie wszystkie próbki mieszamy w wirówce typu vortex przez kilka sekund, a po wirowaniu centrifugujemy je przy 13 RCF przez pięć minut.W probówkach powinny znajdować się dwie fazy. Ponieważ interesuje nas zawartość fazy górnej, pobierzemy ją i przeniesiemy do probówki typu microcentrifuge o pojemności 2 ml. Następnie do każdej próbki dodaje się mieszaninę 2 µL glikogenu i 50 µL 3 M octanu sodu wraz z 1,375 ml 100% etanolu.Wszystkie próbki należy energicznie wymieszać w wortexie, a następnie pozostawić w temperaturze -80 °C przez noc. Po inkubacji nocnej próbki należy rozmrozić na lodzie. Następnie poddaje się je wirowaniu przy 15 RCF przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz, nie naruszając osadu na dnie probówki. Następnie do każdej próbki dodaj 1 ml zimnego, 75% etanolu i odwróć wszystkie probówki od czterech do sześciu razy. Następnie probówki ponownie wiruje się przy 18 RCF przez pięć minut w temperaturze 4°C.Ponownie usuwa się nadsącz i pozwala osadom wyschnąć na powietrzu. Po wyschnięciu osady rozpuszcza się w 50 µL 4 mM śladowego HCl o pH 8 i przechowuje w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. W ten sposób zaprezentowano metodę przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny z zamrożonej tkanki mózgowej człowieka pobranej po śmierci.I pamiętajcie, że podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie wszelkich niezbędnych środków ostrożności przy pracy z tkanką mózgu człowieka. Analizy immunoprecypitacji chromatyny mogą zostać wykorzystane do pogłębienia wiedzy na temat ekspresji genów zarówno w zdrowym, jak i chorym ludzkim mózgu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przetłumacz z en na pl. Zachowaj dokładnie wszystkie tagi HTML i formatowanie. Wypisz tylko tłumaczenie.

Przegląd chromatyny dla ludzkiego tkanki mózgowej

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania dynamicznych zmian w matrycy chromatyny, które regulują transkrypcję indukowaną przez szlak przekazywania sygnału.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Źródło: Mendez, F. M.  i inni., Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje izolację kompleksów białko-DNA z komórek neurosfery pochodzących z guza mózgu myszy przy użyciu natywnej immunoprecypitacji chromatyny. Szczegółowo opisuje etapy przygotowania chromatyny, immunoprecypitacji, płukania i trawienia białek w celu uwolnienia DNA do dalszej analizy.

Immunoprecypitacja chromatyny natywnej komórek neurosfery

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Mechanizmy epigenetyczne są często zmieniane w glejaku. Immunoprecypitacja chromatyny może być wykorzystana do badania konsekwencji zmian genetycznych w glejaku, które wynikają ze zmian w modyfikacjach histonów, które regulują strukturę chromatyny i transkrypcję genów. Protokół ten opisuje natywną immunoprecypitację chromatyny na neurosferach mysiego guza mózgu.

Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgu, wykorzystujący barwienie immunofluorescencyjne i metody dot-blot DNA.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Poznaj technikę ChIP do analizy metylacji histonów w tkance mózgowej pośmiertnej. Ta metoda pozwala badać epigenetyczną regulację ekspresji genów w normalnym i chorym mózgu człowieka.

Analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

Przeglądaj więcej filmów