Name: Miareczkowanie ludzkich koronawirusów za pomocą testu immunoperoksydazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj metodę immunoperoksydazową do miareczkowania ludzkich koronawirusów bez efektu cytopatycznego. Technika ta zapewnia dokładne wykrywanie i ilościowe oznaczanie wirusów w próbkach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pełny tekst protokołu dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

miareczkowanie ludzkich koronawirusów z wykorzystaniem testu immunoperoksydazowego

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Oznaczanie mian wirusa zakaźnego jest podstawowym i niezbędnym podejściem eksperymentalnym w wirusologii. Klasyczne testy plackowe nie mogą być stosowane w przypadku wirusów, które nie wywołują istotnych efektów cytopatycznych, co ma miejsce w przypadku szczepów prototypowych 229E i OC43 ludzkiego koronawirusa (HCoV). W związku z tym opracowano alternatywny pośredni test immunoperoksydazowy (IPA) do detekcji i miareczkowania tych wirusów, który został tutaj opisany. Podatne komórki w formacie płytki 96-dołkowej inokuluje się seryjnymi rozcieńczeniami logarytmicznymi próbek zawierających wirusa. Po namnożeniu wirusa detekcja metodą IPA pozwala wyznaczyć miano wirusa zakaźnego, wyrażone jako „średnia dawka zakaźna dla hodowli tkankowej 50%” (TCID50). Reprezentuje ona rozcieńczenie próbki zawierającej wirusa, przy którym połowa z serii dołków laboratoryjnych zawiera zakaźnego, replikującego się wirusa. Technika ta zapewnia niezawodną metodę miareczkowania HCoV-229E i HCoV-OC43 w próbkach biologicznych, takich jak komórki, tkanki i płyny. Niniejszy artykuł opiera się na pracy po raz pierwszy opisanej w Methods in Molecular Biology (2008) tom 454, strony 93-102.

W tym filmie prezentujemy alternatywną metodę wykrywania i mianowania wirusów przy użyciu enzymatycznej techniki wykrywania antygenów, znanej jako test immunoperoksydazowy. Pokażemy, jak pobierać próbki wirusowe, przygotować komórki do testów, a następnie przeprowadzić test immunoperoksydazowy z wykorzystaniem rozcieńczeń seryjnych w celu oznaczenia miana wirusa.

Miareczkowanie ludzkich koronawirusów z wykorzystaniem testu immunoperoksydazowego

Wyznaczanie miana wirusów zakaźnych jest podstawowym i niezbędnym podejściem eksperymentalnym w wirusologii. Klasyczne testy plackowe nie mogą być stosowane w przypadku...

Obliczanie mian wirusów zakaźnych jest podstawowym podejściem eksperymentalnym. Jednak klasyczna metoda z użyciem testów plackowych nie jest najbardziej niezawodna w przypadku wirusów, które nie wywołują efektów cytopatycznych, tak jak w przypadku ludzkich koronawirusów. W tym filmie prezentujemy alternatywną metodę detekcji i mianowania wirusa z wykorzystaniem enzymatycznej techniki wykrywania antygenów, znanej jako test immunoperoksydazowy.W niniejszym materiale pokażemy, jak pobierać próbki wirusowe, przygotowywać komórki do testów, a na koniec przeprowadzić test immunoperoksydazowy z wykorzystaniem rozcieńczeń seryjnych w celu oznaczenia miana wirusa. Dzień dobry, nazywam się dr Pierre Albo, jestem dyrektorem Laboratorium Neuroimmunologii w Instytucie AM RIP w Laval, Quebec, Kanada. Dzisiaj zaprezentujemy, jak kwantyfikować szczepy wirusów korony człowieka OT 43 oraz 29E, które są szczepami prototypowymi tych wirusów i nie tworzą placków w hodowli.Opracowaliśmy zatem test, który pozwala rozwiązać ten problem. Jest to test immunoperoksydazy. Aby zaprezentować ten protokół, przedstawię Państwu moją studentkę Gabrielle Marol, mojego technika Francisa Nadera oraz mojego współpracownika naukowego Ellana Jacoba.Zacznijmy zatem. Najpierw musimy przygotować próbki tkanek. Rozpoczynamy od zważenia pustych, sterylnych probówek, których będziemy używać do pobierania poszczególnych organów.Po określeniu masy każdej pustej probówki, szybko przeprowadzi się w warunkach sterylnych sekcję wybranych organów, a następnie umieści je w lodzie. Należy pamiętać o płukaniu narzędzi 70% etanolem pomiędzy każdą sekcją. Po pobraniu organów określa się masę każdej próbki biologicznej.Następnie próbki tkanek będziemy homogenizować w 10% sterylnym PBS za pomocą homogenizatora Polytron w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Włącz homogenizator, a następnie podnoś i opuszczaj probówkę, aby rozbić tkankę. Po homogenizacji każdej próbki przemyj urządzenie raz sterylną wodą, raz 70% etanolem, a na koniec PBS przed przetworzeniem kolejnej próbki tkanki.Po homogenizacji próbek odwiruj probówki w temperaturze 4°C przez 20 minut. Przy 1000 Gs zbierz nadpłyn do nowych sterylnych probówek. Na tym etapie próbki wirusa mogą zostać poddane dalszej obróbce w celu detekcji immunoperoksydazowej.W przeciwnym razie można je natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C i przechowywać do czasu przeprowadzenia analiz. Następnie należy przygotować próbki komórek. Istnieją różne metody przygotowania komórek adherentnych i nieadherentnych, jednak obie obejmują oznaczenie wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych mian wirusa.W celu oznaczenia pozakomórkowej produkcji wirusów w komórkach adherentnych, pobieramy nadsączki do sterylnych probówek z zainfekowanych komórek, które należy przebadać w odpowiednich odstępach czasu po infekcji. Do oszacowania wewnątrzkomórkowych mian wirusa należy najpierw usunąć pożywkę, przemyć komórki ciepłym i sterylnym PBS, a następnie dodać taką samą lub znaną objętość pożywki i przeprowadzić trzy cykle zamrażania i rozmrażania w temperaturze -80 °C. Spowoduje to lizę komórek i uwolnienie cząsteczek wirusa do pożywki.W przypadku komórek nieprzywierających, najpierw wirujemy je przy 1000 ×g przez pięć minut. Po zebraniu komórek w osad, supernatanty przenosimy do sterylnych probówek. Stanowi on pozakomórkową frakcję wirusa zakaźnego.Następnie zawiesinę komórkową resuspendujemy w takiej samej objętości, w jakiej zebrano nadsącz, lub w znanej objętości pożywki hodowlanej. Następnie przeprowadzamy trzy cykle zamrażania i rozmrażania w temperaturze -80 °C, aby zlizować komórki i uwolnić cząstki wirusowe do pożywki. Reprezentuje to wewnątrzkomórkową frakcję wirusa zakaźnego.Po lizie komórek adherentnych lub nieadherentnych należy odwirować je przez pięć minut przy 1000 g. Następnie nadfiltr można zebrać do nowych sterylnych probówek i przeanalizować miana za pomocą testu immunoperoksydazy. Próbkę można również bezzwłocznie zamrozić w temperaturze -80 °C i przechowywać do czasu przeprowadzenia analizy.Aby przetestować wydajność zakażenia ludzkim koronawirusem w naszych próbkach biologicznych, chcemy zastosować test immunoperoksydazowy na komórkach podatnych na koronawirusy. W pierwszej kolejności stosuje się trypsynizację i traktowanie w celu stworzenia zawiesiny komórek podatnych z konfluentnej monowarstwy. W przypadku pracy z ludzkim koronawirusem 2 29 EL 1 32 stosuje się komórki 2 29 EL 1 32 jako komórki podatne, a dla ludzkiego koronawirusa OC 43 po przygotowaniu zawiesiny komórek podatnych wykorzystuje się linię komórkową HRT 18. Następnie są one wysiewane na płytkę 96-dołkową do hodowli tkankowych.W przypadku użycia pipety wielokanałowej należy nanieść 100 µL zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę, stosując odpowiednie stężenie komórek. Liczba podatnych komórek w studzience będzie zależeć od rodzaju użytych komórek oraz czasu przeprowadzenia inokulacji. Po wysianiu komórek prosimy o zapoznanie się z naszym protokołem w wydawnictwie Springer w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji.Przed rozpoczęciem testu immunoperoksydazy należy zainfekować podatne komórki przygotowanymi wcześniej próbkami. Gdy podatne komórki osiągną 70 do 80% konfluencji, należy usunąć medium z każdej płytki 96-dołkowej, owijając płytkę w sterylną chusteczkę i delikatnie potrząsając nią odwróconą stroną do dołu nad innym arkuszem sterylnego papieru. Następnie do każdego dołka należy dodać 100 µL medium alpha MEM uzupełnionego o 1% FBS.Każdą próbkę należy przetestować w czterech sąsiednich kolumnach. Na tej samej płytce, w pierwszym rzędzie, należy umieścić w każdej studzience sto mikrolitrów aliquotów przeznaczonych do badania. Zazwyczaj komórki podatne inokuluje się seryjnymi rozcieńczeniami logarytmicznymi próbek zainfekowanych.Aby to zrobić, należy ponownie dodać 11 µL tej samej próbki na studzienkę w czterech studzienkach. Następnie w drugim rzędzie płytki 96-dołkowej wymieszać zawartość za pomocą pipety wielokanałowej, wykonując trzy razy ruchy zasysania i wydmuchiwania, a następnie przenieść 11 µL z każdej studzienki do trzeciego rzędu i tak dalej, aż do ostatniego rzędu płytki. Po inokulacji komórek płytki należy inkubować w komorze nawilżanej w temperaturze 33 °C przy 5% CO2 w przypadku ludzkich koronawirusów.2290 zainfekowanych komórek inkubuje się przez pięć dni, a komórki zainfekowane ludzkim koronawirusem OC 43 inkubuje się przez cztery dni. Po tym czasie można przystąpić do detekcji wirusa.Po inkubacji możemy przystąpić do wykrywania wirusa. W pierwszej kolejności całkowicie usuwamy medium. Robimy to poprzez szybkie opróżnienie płytek na niesterylne ręczniki papierowe w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Następnie delikatnie płuczemy komórki, ostrożnie wypełniając studzienki PBS. Używamy do tego pipety wielokanałowej. Wylewamy PBS ze studzienek, a pozostałości płynu usuwamy, osuszając każdą płytkę papierowym ręcznikiem.Po przemyciu komórek należy je utrwalić stuprocentowym metanolem zawierającym 0,3% nadtlenku wodoru. Należy dodać mieszaninę metanolu do komórek i pozostawić płytkę na 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30-minutowej inkubacji utrwalacz usuwa się, strzepując zawartość płytek nad zlewem. Pozostałości utrwalacza usuwa się, strzepując je stroną roboczą w dół na kilka ręczników papierowych rozłożonych na blacie.Następnie pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu, stroną górną do góry, przez około 15 do 30 minut, aż komórki wyschną. W tym czasie można przygotować roztwór przeciwciał specyficznych dla wirusa w odpowiednim rozcieńczeniu w PBS. Następnie do każdej studni na płytkach inkubacyjnych należy dodać 100 µL specyficznego przeciwciała przeciwwirusowego i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.Po inkubacji całkowicie usuń medium, wylewając je do zlewu. Przepłucz płytkę, wypełniając studzienki PBS. Następnie wylej zawartość płytki do zlewu i ponownie przepłucz za pomocą PBS.Powtórzyć tę czynność jeszcze dwukrotnie. Usunąć resztki PBS, uderzając dnem płytki o niejałowe ręczniki papierowe rozłożone na blacie. Następnie do każdej studzienki dodać 100 µL przeciwciała wtórnego w rozcieńczeniu 1:1000.Rozcieńczenie w PBS, inkubacja płytki przez dwie godziny w temperaturze 37°C bez CO2 na 30 minut przed końcem inkubacji. Przygotuj odczynnik detekcyjny, który jest mieszaniną DAB z PBS i 0,01% nadtlenku wodoru. Przepłucz płytkę trzy razy w PBS, analogicznie jak poprzednio.Po wypłukaniu płytki do każdej dołki dodaje się 100 µL odczynnika wywołującego. Inkubować przez 10–20 minut w temperaturze pokojowej lub do czasu zabarwienia kontroli dodatniej. Aby zatrzymać reakcję, należy wypłukać płytkę raz wodą, analogicznie jak wcześniej w przypadku PBS, a następnie napełnić każdą dołkę 100 µL wodą dejonizowaną.Na koniec odczytaj płytki za pomocą mikroskopu świetlnego, aby zliczyć wszystkie studnia zawierające zabarwione komórki. Teraz w końcu możemy określić miano naszego wirusa. Można je obliczyć metodą car, której równanie znajduje się w protokole Springer towarzyszącym temu filmowi.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić miareczkowanie ludzkich koronawirusów podczas realizacji tej procedury. Należy pamiętać, że pracuje się z próbkami zawierającymi oba wirusy i konieczne jest zachowanie warunków sterylnych. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

titration-of-human-coronaviruses-using-an-immunoperoxidase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Miareczkowanie ludzkich koronawirusów za pomocą testu immunoperoksydazy

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Ten film demonstruje testy mikroneutralizacji do pomiaru przeciwciał neutralizujących za pomocą komórek nerki Madin-Darby Canine nadekspresji kwasu sjalowego związanego z α2,6 w surowicy ludzkiej. Ten test jest często stosowany w badaniach serologicznych grypy u...

Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Ten film prezentuje test neutralizacji mierzący skuteczność surowicy w neutralizacji wirusów SARS-CoV-2. Obejmuje wirusy pseudotypowane, rozcieńczenie surowicy i kwantyfikację na podstawie luminescencji, ujawniającą miano neutralizacji.

Ocena funkcjonalnych przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Ten protokół pokazuje dokładne i obiektywne podejście do wizualizacji miareczkowania wirusa za pomocą fioletu krystalicznego, porównując go z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.

Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Ten protokół opisuje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) jako platformy do szybkiej oceny zakaźności wariantów SARS-CoV-2 i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące.

Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

Poznaj metodę immunoperoksydazową do miareczkowania ludzkich koronawirusów bez efektu cytopatycznego. Technika ta zapewnia dokładne wykrywanie i ilościowe oznaczanie wirusów w próbkach biologicznych.

Miareczkowanie ludzkich koronawirusów z wykorzystaniem testu immunoperoksydazowego

Przeglądaj więcej filmów