Name: Hodowla szpikowych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj metodę hodowli szpikowych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego myszy. Technika obejmuje izolację komórek z kości udowej i piszczelowej, ich różnicowanie in vitro oraz analizę cytometryczną do oceny dojrzewania i produkcji IL-12.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JB otrzymuje wsparcie w ramach stypendiów z Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC). Wsparcie dla tego projektu zostało zapewnione przez Canadian Institutes of Health Research, grant MOP-67066.

Niniejszy protokół został opracowany na podstawie pracy Lutz i wsp.1
Pozyskiwanie i przetwarzanie szpiku kostnego
<ol>
<li>Izolacja piszczeli i kości udowej: Poddać mysz dawcę eutanazji i spryskać kończyny dolne 70% etanolem. Mocno uchwycić pierwszy staw skokowy tępą pęsetą i rozpocząć odcinanie skóry oraz leżącej pod nią muskulatury, aby odsłonić kość piszczelową. Aby uniknąć uszkodzenia kości, należy ciąć powoli i równolegle do piszczeli, pozostawiając staw kolanowy nienaruszonym. W celu oczyszczenia kości udowej, unieruchomić staw kolanowy, chwytając go tępą pęsetą. Usunąć muskulaturę za pomocą ostrych nożyczek i pęsety zakrzywionej. Kontynuować nacinanie w górę, aż do odsłonięcia stawu biodrowego, tak aby można było umieścić nożyczki pomiędzy głową kości udowej a stawem biodrowym. Wyjąć kości, przecinając tkankę między kością udową a stawem biodrowym, i umieścić je w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) na lodzie.</li>
<li> Usuwanie szpiku kostnego: Oczyścić kości z pozostałości muskulatury za pomocą nożyczek i pęsety zakrzywionej. Odciąć nasady każdej z kości i zlokalizować jamę szpikową. Używając strzykawki 10mL wypełnionej PBS z igłą 25G0.5”, wypłukać szpik kostny do szalki Petriego bez powłoki tkankowej.</li>
<li> Obróbka szpiku kostnego: Użyć gumowego końca tłoka ze strzykawki 1mL do dysocjacji szpiku kostnego do postaci zawiesiny pojedynczych komórek (stosując ruchy góra-dół, nie ruchy skrobiące). Zebrać szpik kostny do stożkowatej probówki typu Falcon i wypłukać pozostałości szpiku za pomocą PBS.</li>
</ol>
Hodowla komórek dendrytycznych
<ol>
<li>Resuspenduj komórki w pożywce DC i policz prekursory DC za pomocą komory licznikowej (Rycina 1). Zauważysz komórki o różnych rozmiarach; prekursory DC są największe i najjaśniejsze. Policz różnicowo tylko te komórki. Z dwóch kości udowych i dwóch kości piszczelowych myszy C57Bl/6 typu dzikiego (w wieku 6-8 tygodni) należy spodziewać się od 25-40 x 106 wszystkich prekursorów DC. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="Mikroskopowy obraz siatki do liczenia komórek; zastosowanie komory licznikowej do oceny gęstości i żywotności komórek." width="218" height="217" data-altupdatedat="1787630408000"> Rycina 1 </li>
<li>Hoduj komórki w gęstości 2 x 105 prekursorów DC/mL w pożywce DC uzupełnionej o 40 ng/mL rekombinowanego GM-CSF mysiego. Wysiej komórki na polistyrenowe płytki Petri niepowlekane tkanką.</li>
</ol>
Dodanie pożywki (dzień 3)
Aby odświeżyć medium, dodaj połowę całkowitej objętości świeżego medium uzupełnionego o 40 ng/mL GM-CSF.
Wymiana jednej trzeciej pożywki (dzień 6) i dojrzewanie
Aby odświeżyć medium, należy ostrożnie usunąć jedną trzecią całkowitej objętości medium i zastąpić ją świeżym medium DC uzupełnionym o 40 ng/mL GM-CSF w 6. dniu hodowli.
W razie potrzeby komórki dendrytyczne można stymulować do dojrzewania, wykorzystując cytokiny lub ligandy receptorów Toll-podobnych. W filmie komórki dendrytyczne dojrzewano poprzez nocną stymulację 5 ng/mL CpG.
Izolacja komórek dendrytycznych
Kultura DC jest zakończona (Rysunek 2). Komórki będą znajdować się zarówno w zawiesinie, jak i słabo przyległe do płytki. Komórki przylegające można usunąć, zeskrobując je z naczynia za pomocą skrobaka do kultur tkankowych i płucząc PBS. Całkowita liczba komórek wzrośnie 5-8 krotnie podczas tygodniowego okresu hodowli i różnicowania, w związku z czym należy spodziewać się uzyskania 1-1,6 x 106 komórek/mL. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej: histogramy ekspresji CD86/CD40; wykresy rozrzutu IL-12 vs CD11c; dojrzewanie komórek." width="407" height="358" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2">
Rysunek 2
Odczynniki
<ol>
<li>Pożywka DC<ol>
<li>Pożywka RPMI-1640, uzupełniona o: </li>
<li>10% płatkowej surowicy bydlęcej </li>
<li>100 IU/mL penicyliny </li>
<li>100 μg/mL streptomycyny </li>
<li>1% L-glutaminy </li>
<li>0.1% 2-merkaptoetanolu </li>
<li>1X nieistotnych aminokwasów </li>
<li>1X pirogronianu sodu </li>
</ol></li>
<li>Rekombinowany mysi GM-CSF <ol>
<li>rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nr katalogowy 315-03) </li>
</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

Komórki dendrytyczne (DCs) są użyteczne w badaniach nad interakcjami odporności wrodzonej i nabytej i mogą być wykorzystywane jako wektory szczepionkowe. W tym filmie przedstawiliśmy etapy izolacji szpiku kostnego oraz różnicowania mieloidalnych komórek dendrytycznych in vitro. Po okresie hodowli komórki te można uwidocznić mikroskopowo zarówno jako komórki adherentne, często posiadające dendryty, jak i nieadherentne komórki okrągłe. Komórki DCs można dalej modyfikować w celu prezentacji antygenu poprzez pulsowanie antyg...

<table><tbody><tr><td>rekombinowany GM-CSF mysi</td><td>Odczynnik</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Mieloidalne komórki dendrytyczne (DCs) są często wykorzystywane do badania interakcji między wrodzonymi a adaptacyjnymi mechanizmami odpornościowymi oraz wczesnej odpowiedzi na infekcję. Ze względu na to, że są one najsilniejszymi komórkami prezentującymi antygen, DCs są coraz częściej stosowane jako wektor szczepionkowy w badaniach nad indukcją swoistych dla antygenu odpowiedzi immunologicznych. W niniejszym filmie prezentujemy procedurę pobierania kości piszczelowych i udowych od myszy dawcy, przetwarzania szpiku kostnego oraz różnicowania DCs in vitro. Właściwości DCs zmieniają się po stymulacji: niedojrzałe komórki dendrytyczne są silnymi fagocytami, natomiast dojrzałe DCs są zdolne do prezentacji antygenu i interakcji z limfocytami T CD4+ oraz CD8+. Ta zmiana aktywności funkcjonalnej odpowiada zwiększeniu ekspresji markerów powierzchniowych komórek oraz produkcji cytokin. Do dojrzewania DCs można wykorzystać wiele czynników, w tym cytokiny i ligandy receptorów Toll-podobnych. W tym filmie przedstawiamy porównania cytometryczne przepływowo wyrażania dwóch cząsteczek kostymulujących, CD86 i CD40, oraz cytokiny IL-12 po nocnej stymulacji CpG lub w grupie kontrolnej (mock). Po zróżnicowaniu DCs mogą być dalej modyfikowane w celu wykorzystania ich jako wektora szczepionkowego lub wygenerowania swoistych dla antygenu odpowiedzi immunologicznych poprzez pulsowanie in vitro za pomocą peptydów lub białek, bądź poprzez transdukcję z użyciem rekombinowanych wektorów wirusowych.

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Mieloidalne komórki dendrytyczne (DCs) są często wykorzystywane do badania interakcji między wrodzonymi a adaptacyjnymi mechanizmami odpornościowymi oraz wczesnej odpowiedzi na ...

Nazywam się Jeanette Boudreaux i chciałabym przedstawić Państwu kroki prowadzące do hodowli komórek dendrytycznych mieloidalnych z prekursorów szpiku kostnego. Linia mieloidalnych DC zyskuje coraz większe uznanie w badaniach nad współoddziaływaniem odporności wrodzonej i nabytej, a także jest coraz częściej wykorzystywana jako platforma do opracowywania szczepionek. Dzisiaj przeprowadzimy Państwa przez etapy izolacji komórek prekursorowych, ich wysiewania do hodowli oraz różnicowania ich w komórki dendrytyczne.Następnie przedstawię analizę cytometryczną komórek przed i po dojrzewaniu. W obecności ligandu receptora Toll-podobnego komórki proliferują in vitro podczas okresu hodowli, zatem należy spodziewać się około pięcio- do ośmiokrotnego wzrostu całkowitej liczby komórek w porównaniu do prekursorów wysianych w dniu zerowym. Procedury, które dziś prezentuję, zostaną zademonstrowane na otwartym stole laboratoryjnym, jednak w celu zachowania sterylności zalecam prowadzenie hodowli w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub w laminarnym dyfuzorze powietrza.Na początek będą potrzebne strzykawka 10 ml z igłą 25G wypełniona PBS, zakrzywiony pęset, pęseta prosta, ostry nożyczki oraz tępe

culture-of-myeloid-dendritic-cells-from-bone-marrow-precursors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kultura komórek dendrytycznych szpiku kostnego z prekursorów

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Wytwarzanie in vitro plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj metodę hodowli szpikowych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego myszy. Technika obejmuje izolację komórek z kości udowej i piszczelowej, ich różnicowanie in vitro oraz analizę cytometryczną do oceny dojrzewania i produkcji IL-12.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów