Wytwarzanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego do stosowania w obrazowaniu 2-fotonowym

Preparatyka komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego stanowi doskonałe źródło komórek prezentujących antygen, które mogą być wykorzystane do eksperymentów in vitro lub in vivo w dwóch dodatkowych obrazach układu odpornościowego. Wprowadzenie komórek prezentujących antygen pozwala na badanie interakcji komórkowych specyficznych dla antygenu w kontekście żywego węzła chłonnego. Tutaj pokazujemy sterylną izolację szpiku kostnego i techniki hodowli w celu wytworzenia dojrzałych komórek dendrytycznych.

Ponadto śledzimy rozwój komórek dendrytycznych od pierwszego do 11 dnia. Rozwój ten jest przedstawiony za pomocą nieruchomych obrazów i filmów inkubatora wykonanych przy użyciu technologii zapachowych inkuba. Na koniec pokazujemy komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego prezentujące antygen zatoczkowy do OT dwóch limfocytów T w lustrzanym węźle chłonnym.

Cześć, nazywam się Melanie Matthew i pracuję w laboratorium Micah Halena na pobliskim Uniwersytecie Kalifornijskim. Czy zastanawiałeś się kiedyś, co dzieje się w środku podczas próby, podczas gdy twoje komórki rosną? Dzisiaj?

W ramach naszego protokołu pokażemy Ci, jak korzystać z niektórych instrumentów na miejscu. Atramentowe miejsce pozwala śledzić wzrost kultur komórkowych w inkubatorze. W tym protokole pokażemy, jak wyizolować i przygotować komórki pochodzące ze szpiku kostnego i grupujące je od myszy.

Więc pierwszą rzeczą, którą pokażę, jak to zrobić, to usunąć kości udowe i odizolować szpik kostny. Następnie zwilż zwierzę 70% etanolem. Wykonaj pierwsze nacięcie wzdłuż linii środkowej zwierzęcia.

Następnie przeciąć nogę, jak ci tutaj pokazuję. Aby odsłonić tkankę mięśniową powyżej kości udowej, powinieneś być w stanie odciągnąć mięsień na bok i chwycić dużą kość udową za pomocą pęsety preparcyjnej. Trzymając kość pęsetą preparacyjną, przesuń się w dół kości i wykonaj pierwsze cięcie tuż pod stawem.

Następnie przesuwaj nożyczkami wzdłuż kości udowej i spraw, aby cięła jak najbliżej ciała. Może to spowodować niewielką ilość krwi, zwłaszcza jeśli przetniesz tętnicę udową. Podczas usuwania kości udowej niezwykle ważne jest, aby kość pozostała nienaruszona.

Jak widać tutaj, końce kości nie zostały przecięte ani uszkodzone. Po usunięciu kości udowej odetnij dodatkową tkankę i umieść kość udową w małym naczyniu z naszymi pożywkami PMI. Podczas usuwania dodatkowej tkanki należy upewnić się, że kość udowa nie wysycha.

W tym momencie kości udowe należy przenieść do naczynia zawierającego 70% etanolu i umieścić na lodzie na pięć do 10 minut. Na potrzeby tego filmu będziemy kontynuować na stole laboratoryjnym. Jednak na tym etapie eksperymentu wszystko powinno zostać przeniesione do kaptura do hodowli tkankowej.

Po namoczeniu kości w etanolu można je przenieść do większego naczynia ze sterylnym podłożem w celu usunięcia szpiku kostnego. Teraz jesteśmy gotowi do usunięcia i ponownego zawieszenia szpiku kostnego. Napełnij strzykawkę insulinową sterylnym podłożem i odłóż na bok do późniejszego użycia.

Chwyć kość sterylną pęsetą. Przytrzymaj go na małej płytce na wyrzucone kawałki i odetnij nasadę lub końce kości z każdej strony. Umieść strzykawkę insulinową po jednej stronie kości i wypłucz szpik z kości do 15 milicali pożywki.

Umyj kość jeszcze raz lub dwa razy, aż cały szpik zostanie wypłukany. Gdy szpik zostanie wypłukany z kości, będzie prawie całkowicie biały. Umieść czystą kość w naczyniu do odrzutów i powtórz proces z drugą kością udową.

Po zakończeniu należy delikatnie rozbić wszelkie kawałki szpiku, które nie zostały rozbite w procesie mycia, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Zajmie to od pięciu do 10 minut pipetowania. Umieść zawiesinę jednokomórkową w stożkowej probówce o grubości 50 mil, umyj płytkę co najmniej trzy razy 10 mililitrami pożywki.

Za każdym razem odwiruj ogniwa, usuń pożywkę i ponownie zawieś ogniwa, mocno i energicznie ocierając palcami o dno tuby. Aby usunąć czerwone krwinki lub erytrocyty, przeprowadzamy lizę wody. Inną metodą usuwania czerwonych krwinek jest liza chlorku amonu.

Obie metody zostały opisane w poprzednich artykułach wideo JoVE. Izolacja limfocytów T CD czterech dodatnich z węzłów chłonnych myszy przy użyciu oczyszczania Milan max JoVE wydanie dziewiąte i przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T z cytów szczura JoVE. Wydanie 10.

Po usunięciu krwinek czerwonych jesteście teraz gotowi do samodzielnej hodowli. Zanim więc przeprowadzę Cię przez hodowlę komórek dendri, chciałbym przedstawić Ci stronę z kowadełkami. Miejsce kowadełka pozwoli na odjęcie przewidywanego wzrostu hodowli komórkowych w inkubatorze, dzięki czemu będziemy mogli obserwować, jak się zachowują lub nieprawidłowo.

Po ustawieniu kultury umieszczasz ją na tacy o odpowiednim rozmiarze i zamykasz miejsce kowadełka. Następnie na swoim komputerze po prostu ustawiasz przedział czasu, a następnie wybierasz dołki, które chcesz obrazować i pozwól, aby atramentowa strona zbierała dla Ciebie dane. Filmy pokażą Ci w tym protokole, pokażą zmiany morfologii komórek dendrytycznych in vitro.

Te filmy zostały wyeksportowane bezpośrednio z programu Incus site. Ponieważ komórki dendrytyczne rozwijają się od pierwszego do 11 dnia, można zauważyć prawdziwą zmianę morfologii, gdy powiększają się i przyjmują fenotyp komórek dendrytycznych. Po lizie, erytrocytach i ich usunięciu, komórki są myte w pierwotnych pożywkach komórek dendrytycznych i powlekane w ilości 5 milionów na promil.

Komórki te powinny być początkowo hodowane w pierwotnych pożywkach do hodowli komórek dendrytycznych, a następnie hodujemy je w wtórnych pożywkach prądu stałego, które są uzupełniane o 40 nanogramów na promil IL cztery i sto nanogramów na promil TNF alfa. Cytokiny te pomogą w rozwoju dojrzałych komórek dendrytycznych, które przypominają komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów. Teraz pokażę wam, jak wyglądają kultury w miarę ich rozwoju i jak je utrzymać w czasie.

Po posianiu komórek można hodować komórki dendrytyczne przez 72 godziny przed pierwszą zmianą podłoża. Oto, jak będzie wyglądać Twoja typowa hodowla zaraz po pokryciu komórek płytką pierwszego dnia. A oto spojrzenie na komórki.

Trzeciego dnia można zauważyć, że komórki zaczęły przylegać do płytki, ale nie przybrały klasycznego fenotypu komórek dendrytycznych. Czwartego dnia usuń pożywkę i dodaj 10 mililitrów świeżej aspiracji pierwotnego nośnika DC nośnika. Czwartego dnia usuniemy limfocyty z innych komórek, które nie przylegają.

Teraz możecie umieścić się z powrotem w inkubatorze na kolejne trzy dni, siedem dni po pierwszym posiewie. Oto, jak będzie wyglądać Twoja typowa kultura. Możesz powiedzieć, że nadszedł czas, aby podzielić komórki i je ponownie odtworzyć.

W siódmym dniu komórki dendrytyczne są usuwane z płytki przez zasysanie pożywki, a następnie dodanie 300 milimolowych sterylnych EDTA i inkubację przez pięć minut. Następnie płytkę wielokrotnie przepłukuje się, trzymając ją pod kątem 45 stopni i pipetując roztwór EDTA do tylnej części płytki. Odbywa się to przez kilka minut, aby upewnić się, że usunąłeś wszystkie przylegające komórki dendrytyczne.

Komórki zbiera się w stożkowej probówce o średnicy 50 mili i dwukrotnie przemłukuje wtórnymi mediami prądu stałego. Komórki są następnie ponownie zawieszane i platerowane w ilości 5 milionów komórek na płytkę. Świeżo posiane komórki dendrytyczne z siódmego dnia szybko osiadają na dnie płytki, przylegają i zaczynają się rozprzestrzeniać.

Jak można zobaczyć tutaj na filmie ze strony Zichy, ten film został nagrany w inkubatorze w ciągu dwóch dni, aby pokazać rozwój komórek dendrytycznych od początkowego ponownego posiewu wykonanego w siódmym dniu do wczesnego dnia dziewiątego. Komórki dendrytyczne morfologii mogą być aktywowane w impulsie antygenu, dodając tutaj dwa mikrogramy na LLPS ze stu mikrogramami dla komórek jajowych do stosowania z komórkami T oczyszczonymi z OT dwóch myszy, które mają specyficzne dla komórek jajowych CD cztery dodatnie limfocyty T. Jeśli używasz innego antygenu, ważne jest, aby upewnić się, że używasz optymalnego stężenia antygenu do pulsowania dcs tutaj, OV i LPS są dodawane do pożywek pierwotnych tak, że końcowe stężenie LPS wyniesie dwa mikrogramy na promil na 20 milsów, a komórki jajowe wyniosą sto mikrogramów na promil na 20 mils.

Oto zdjęcie pokazujące, jak wygląda typowa hodowla komórek dendrytycznych w 10 dniu. Na tym zdjęciu widać, że morfologia jest bardzo typowa dla komórki prezentującej antygen. Procentową zawartość komórek dendrytycznych CD 11 C dodatnich należy zawsze sprawdzić faksem.

Ma to na celu upewnienie się, że masz stosunkowo czystą kulturę komórek dendrytycznych do wykorzystania w swoich eksperymentach. Tutaj używamy atramentowego miejsca z instrumentów SEN do monitorowania aktywacji komórek dendrytycznych, które były traktowane LPS w impulsie antygenu w dniu 10. Ten film obejmuje okres 24 godzin bezpośrednio po dodaniu LPS oraz val i peptydu, a w nim komórki dendrytyczne stają się bardziej aktywne i zachodzą pewne oczywiste zmiany morfologiczne.

Gdy twoje komórki dendrytyczne zostaną aktywowane w impulsie antygenu, możesz je ponownie zebrać przez inkubację z 300 milimolowym EDTA i umycie płytki. Teraz odkręć komórki, umyj je dwukrotnie 50 mililitrami pożywki RPMI, aby usunąć dodatkowy antygen i oznacz je odpowiednim barwnikiem do śledzenia komórek. W tym eksperymencie będę obrazował komórki w pachwinowym węźle chłonnym.

Będziemy musieli wstrzyknąć od dwóch do 5 milionów komórek dendrytycznych do skóry w obszar boku myszy pokazanej tutaj. Następnie pozostawiamy 24 godziny, aby komórki dendrytyczne zadomowiły się w trenującym węźle chłonnym. Tutaj, w tym filmie, komórki dendrytyczne są oznaczone CMF two hc, niebieskim barwnikiem śledzącym komórki.

Możesz zobaczyć, jak komórki dendrytyczne oddziałują ze znakowanymi limfocytami T, które są antygenem specyficznym dla woliny. Te limfocyty T są znakowane ccf SE. Możesz także użyć C-M-T-M-R lub dowolnego innego barwnika do śledzenia komórek do sond molekularnych. Jest to wczesna faza aktywacji limfocytów T oddziałujących z prądem stałym.

Ponieważ są one specyficzne dla antygenu, można zobaczyć, że limfocyty T przyklejają się do wąsów oznaczonych na niebiesko dcs. Na tym kończy się nasz protokół demonstrujący przygotowanie i zastosowanie komórek dendrytycznych szpiku kostnego pochodzących od myszy w eksperymencie z dwoma bottonami. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we własnych eksperymentach.