Name: Wytwarzanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego do stosowania w obrazowaniu 2-fotonowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-09T16:32:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli dojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy do zastosowania w obrazowaniu 2-fotonowym interakcji immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stypendium przeddoktoranckie National Institutes of Health Kirchstein Fellowship AI-64128 (MPM), GM-41514 (MDC), GM-48071 (I.P.)

1) Usuń obie kości udowe od jednej myszy
<ol>
<li>Za pomocą nożyczek sekcyjnych odciąć mięśnie, aby odsłonić kość udową powyżej i poniżej stawów (kolanowego i biodrowego). Chwycić środek kości udowej pęsetą sekcyjną i przeciąć powyżej oraz poniżej stawów, pozostawiając nasadę kości w możliwie najmniej zmienionym stanie.</li>
<li>Za pomocą małych nożyczek sekcyjnych usunąć jak największą ilość tkanki mięśniowej. Przenieść kość udową do naczynia z pożywką RPMI.</li>
<li>Od tego momentu wszystkie procedury należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając wyłącznie sterylnych pożywek, narzędzi, końcówek do pipet i naczyń hodowlanych.</li>
</ol>
2) Sterylizacja kości udowych:
<ol>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść kości z medium RPMI do małej szalki hodowlanej wypełnionej 70% etanolem na lodzie.</li>
<li>Pozostawić kości do namoczenia w etanolu na lodzie przez 5 minut.</li>
</ol>
3) Pobierz szpik kostny w warunkach sterylnych:
<ol>
<li>Przenieś kości do małej szalki hodowlanej zawierającej sterylnie filtrowaną pożywkę do hodowli pierwotnych komórek DC.</li>
<li>Za pomocą sterylnej pęsety przytrzymaj kość nad naczyniem lub probówką na odpady i za pomocą sterylnych nożyczek odetnij każdą nasadę (końce kości). Cięcie powinno odsłonić szpik kostny, który w centrum kości ma jaskrawoczerwony kolor.</li>
<li>Za pomocą sterylnej strzykawki (igła o rozmiarze 26-28 G) pobierz około 100-200 mL sterylnej pożywki.</li>
<li>Przytrzymaj kość sterylną pęsetą nad nową szalką ze sterylną pożywką i wprowadź igłę do jednej z części kości. Umieść końcówkę igły w pobliżu górnej części kości i powoli wypłukuj kość sterylną pożywką. Jeśli igła znajduje się w centrum kości, powinna wsunąć się z łatwością.</li>
<li>Szpik kostny wypłukuje się w postaci małych fragmentów lub jednego większego kawałka. Należy go całkowicie wypłukać z kości do szalki ze sterylną pożywką&nbsp;.</li>
<li>Powtarzaj ten krok w razie potrzeby, aż szpik zostanie całkowicie wypłukany z kości.</li>
<li>Gdy kość będzie czysta, stanie się biała i półprzezroczysta.</li>
<li>Powtórz tę procedurę z drugą kością udową. Każdą kość udową wyrzuć po jej oczyszczeniu.</li>
</ol>
4) Ponowne zawieszenie i wirowanie komórek szpiku kostnego:
<ol>
<li>Przenieś komórki do sterylnej probówki typu Falcon.</li>
<li>Jeśli szpik jest nadal w całości, bardzo delikatnie pipetuj pożywkę w górę i w dół w naczyniu, aby rozbić szpik do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Może to zająć kilka minut i powinno być wykonywane powoli, aby uniknąć zniszczenia komórek przez siły ścinające.</li>
<li>Odwiruj komórki w sposób analogiczny do innych komórek ssaków.</li>
</ol>
5) Liza komórek:
<ol>
<li>Po zakończeniu wirowania wyjmij probówkę z wirówki i zlej pożywkę (dekantuj) do małego naczynia na odpady (probówka typu Falcon 50 mL) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Resuspenduj osad, delikatnie uderzając w dno probówki.</li>
<li>Przy użyciu sterylnej filtrowanej wody oraz 10x DPBS lub 10x PBS przeprowadź lizę wodną w celu usunięcia erytrocytów (RBC), stosując następujące objętości: 
<ul>
<li>900 mL sterylnej filtrowanej wody</li>
<li>100 mL 10x DPBS lub 10x PBS</li>
</ul>
</li>
<li>Dodaj 100 mL 10x PBS od 5 do 10 sekund po dodaniu wody. Bardzo ważne jest, aby zrobić to niezwłocznie, tak aby uległy lizie wyłącznie erytrocyty. Zaleca się, aby obie pipety były napełnione i przygotowane do użycia.</li>
<li>Dodaj 5 mL – 10 mL sterylnej podstawowej pożywki DC.</li>
</ol>
6) Policz komórki:
<ol>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza wymieszać od 6 do 11 ml komórek szpiku kostnego, delikatnie obracając probówką i lekko ją odwracając,&nbsp;nachylenie pod kątem 45 stopni (nie w taki sposób, aby pożywka dotykała górnej części probówki)</li>
<li>Przenieś 10 ml pożywki do sterylnej probówki w celu dokonania odczytu. </li>
<li>Ponownie zakręć probówki z komórkami i raz jeszcze odwiruj je w wirówce.</li>
</ol>
7) Wysiew komórek dendrytycznych:
<ol>
<li>Komórki należy wysiać z gęstością 1 x 106/mL.</li>
<li>Wyjąć komórki z wirówki, odlać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości Primary DC Media w celu wysiania.</li>
<li>Umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych.&nbsp; </li>
</ol>
8) Pielęgnacja i dojrzewanie kultur:
Zawsze należy sprawdzić hodowle przed dodaniem kolejnej porcji pożywki lub wykorzystaniem ich w jakichkolwiek eksperymentach. Należy ocenić ogólną kondycję komórek i sprawdzić, czy nie doszło do zanieczyszczenia.
DZIEŃ 0: Wysianie komórek dendrytycznych.
DZIEŃ 3: Usunąć 75% pożywki oraz nieprzylegających komórek, a następnie ponownie dodać pożywkę do pierwotnych komórek DC.
DZIEŃ 6: Po wstępnym wysiewie komórek: Ponownie wysiej komórki zgodnie z poniższą procedurą:
<ol>
<li>Usunąć medium, które na tym etapie powinno zawierać część nieprzylegających komórek dendrytycznych, i przenieść je do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 ml, pozostawiając płytki lekko wilgotnymi (aby zapobiec wysychaniu komórek przylegających). </li>
<li>Do każdej płytki należy dodać 3 mM EDTA w PBS i odstawić&nbsp;pozostawić na 5 minut. </li>
<li>Trzymając płytkę pod kątem 45 stopni, należy delikatnie pipetować pożywkę w górę i w dół przy dnie płytki, aby łagodnie oderwać nieprzylegające komórki.</li>
<li>Roztwór EDTA/PBS powinien stać się gęstszy, co wskazuje na zbieranie komórek z dna płytki. </li>
<li>Po kilku minutach mieszaninę komórek można przenieść do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. </li>
<li>Po wykonaniu tej procedury dla każdej płytki należy odwirować wszystkie komórki.</li>
<li>Należy policzyć komórki i wysiać je w nowym sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm w pożywce Secondary DC Media z gęstością 1 x 10^6 komórek na płytkę. Następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych.</li>
</ol>
DZIEŃ 10-11
Dojrzałe komórki dendrytyczne gotowe do stymulacji/obciążania antygenem.
9) Stymulacja komórek dendrytycznych:
<ol>
<li>Do aktywacji i ładowania peptydów należy użyć LPS (lipopolisacharydu) w połączeniu z wybranym peptydem. W zależności od źródła LPS, lepsze wyniki mogą przynieść różne warunki stymulacji. Ponadto należy zoptymalizować pożądaną ilość peptydu do prezentacji przez DC. Warunki stymulacji w niniejszym protokole wynosiły 100 ng/mL LPS oraz 100 ug/mL OVA (owalbuminy).&nbsp;</li>
<li>Obciążyć antygenem/traktować LPS przez 18-24 godziny przed zbiorem/użyciem. </li>
</ol>
Pożywka do komórek dendrytycznych: przefiltrować sterylnie po dodaniu wszystkich składników
Przegląd różnych warunków hodowli komórek dendrytycznych oraz wynikającego z nich fenotypu komórek dendrytycznych znajduje się w sekcji dyskusji. Przedstawione warunki hodowli zostały opracowane w celu uzyskania dojrzałych komórek dendrytycznych, które 18-24 godziny po iniekcji podskórnej szybko migrują do drenujących węzłów chłonnych i efektywnie prezentują antygen.
Podłoże do pierwotnych DC: Przefiltrować sterylnie po dodaniu wszystkich składników
<ul>
<li>500 mL IMDM (odjąć 55-60 mL, aby uzyskać końcową objętość 500 mL)</li>
<li>50 mL inaktywowanej termicznie FBS</li>
<li>5 mL 200 mM L-Gln, końcowe stężenie 2 mM</li>
<li>100 IU/mL penicyliny i 100 mg/mL streptomycyny (5 mL roztworu stokowego 10 000 IU/mL Pen i 10 000 mg/mL Strep)</li>
<li>50 uM B-Me (roztwór stokowy 14,3 M B-Me, rozcieńczyć 1:100 w dygestorium chemicznym, użyć 35 ul na 100 mL medium dla stężenia 50 micromolar)</li>
<li>20-30 ng/mL GM-CSF</li>
<li>100-400 IU/mL IL-4, w przybliżeniu 10- 40 ng/mL</li>
</ul>
Pożywka SecondaryDC do dojrzewania* 
100 ng/mL TNF-alpha (dodać do pożywki dla pierwotnych DC) * Uwaga: GM-CSF + IL-4 powinny prowadzić do powstania niedojrzałych komórek dendrytycznych. Zastosowanie GM-CSF + IL4 (400 IU/ul) + TNF-alpha (100 ug/mL) spowoduje powstanie komórek przypominających dojrzałe komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów. Znane jest, że dojrzałe komórki dendrytyczne nie pobierają antygenu tak efektywnie jak komórki niedojrzałe, a w kulturach może występować endogenny TNF-a uwalniany z komórek zrębu4.

<ol><li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4%2B+T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li>
<li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li>
<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li>
<li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture%2C+but+in+contrast+to+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%2C+without+inducing+their+functional+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li>
<li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signals+in+CD4%2B+T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li>
<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li>
</ol>

Komórki dendrytyczne są kluczowymi mediatorami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i najskuteczniejszymi zidentyfikowanymi do tej pory komórkami prezentującymi antygen. Metody hodowli ludzkich i mysich komórek dendrytycznych opisane w literaturze różnią się rodzajem cytokin stosowanych w celu wpływania na rozwój różnych typów komórek dendrytycznych. W szczególności GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alpha i IFN-gamma są stosowane w różnych kombinacjach w celu wytworzenia in vitro dojrzałych, niedojrzałych, zapalnych oraz ...

generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

W literaturze można znaleźć kilka metod przygotowania mysich komórek dendrytycznych. Przedstawiamy tutaj metodę, która pozwala na uzyskanie w hodowli ponad 85% komórek dendrytycznych CD11c high, które po wstrzyknięciu podskórnym migrują do drenującego węzła chłonnego i prezentują antygen swoistym limfocytom T (patrz wideo). Ponadto wykorzystujemy system Essen Instruments Incucyte do śledzenia dojrzewania komórek dendrytycznych, gdzie w 10. dniu morfologia hodowanych komórek jest typowa dla dojrzałej komórki dendrytycznej, a &lt;85% komórek to komórki CD11chigh. Badanie prezentacji antygenu w obwodowych węzłach chłonnych za pomocą obrazowania dwufotonowego wykazało istnienie trzech odrębnych faz interakcji komórek dendrytycznych z limfocytami T1, 2. Faza I składa się z krótkich, seryjnych kontaktów między wysoce ruchliwymi swoistymi limfocytami T a komórkami dendrytycznymi niosącymi antygen1, 2. Faza druga charakteryzuje się przedłużonymi kontaktami między swoistymi limfocytami T a komórkami dendrytycznymi prezentującymi antygen1, 2. Wreszcie, faza III charakteryzuje się oddzielaniem się limfocytów T od komórek dendrytycznych, odzyskaniem ruchliwości i rozpoczęciem podziałów1, 2. Jest to przykład rodzaju interakcji swoistych dla antygenu, które można analizować za pomocą obrazowania dwufotonowego komórek dendrytycznych obciążonych antygenem i znakowanych barwnikiem typu cell tracker.

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

W literaturze dostępnych jest kilka metod preparowania dendrytycznych komórek odpornościowych myszy. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę, która pozwala na uzyskanie ponad 85% ...

Przygotowanie komórek dendrytycznych z szpiku kostnego stanowi doskonałe źródło komórek prezentujących antygen, które mogą być wykorzystywane w eksperymentach in vitro lub in vivo w obrazowaniu układu odpornościowego w dwóch płaszczyznach. Wprowadzenie komórek prezentujących antygen umożliwia badanie specyficznych dla antygenu interakcji międzykomórkowych w kontekście żywego węzła chłonnego. W niniejszym materiale prezentujemy metodę sterylnej izolacji szpiku kostnego oraz techniki hodowli służące do produkcji dojrzałych komórek dendrytycznych.Ponadto śledzimy rozwój komórek dendrytycznych od pierwszego do jedenastego dnia. Rozwój ten przedstawiono na zdjęciach oraz w filmach z inkubatora wykonanych przy użyciu systemu IncuSite firmy Scent Technologies. Na koniec prezentujemy pochodzące z szpiku kostnego komórki dendrytyczne prezentujące antygen cove limfocytom T OT-II w drenażowym węźle chłonnym.Cześć, jestem Melanie Matthew z laboratorium Micah Halena na pobliskim Uniwersytecie Kalifornijskim. Czy zastanawialiście się kiedyś, co dzieje się wewnątrz podczas proby, gdy Wasze komórki rosną? Dzisiaj?W ramach naszego protokołu pokażemy Państwu, jak korzystać z niektórych instrumentów w miejscu badania. System inky umożliwia monitorowanie wzrostu kultur komórkowych w inkubatorze. W tym protokole pokażemy Państwu, jak izolować i przygotowywać komórki grupowe pochodzące z szpiku kostnego myszy.W pierwszej kolejności pokażę Państwu, jak usunąć kości udowe i wyizolować szpik kostny. Najpierw należy przymocować zwierzę szpilkami. Następnie zwilżyć zwierzę 70% ethanol. Wykonać pierwsze nacięcie wzdłuż linii środkowej ciała zwierzęcia.Następnie wykonaj cięcie wewnątrz nogi, tak jak tutaj pokazuję. Aby odsłonić tkankę mięśniową nad kością udową, należy odsunąć mięsień i chwycić dużą kość udową pęsetą anatomiczną. Trzymając kość pęsetą, przesuń się wzdłuż niej i wykonaj pierwsze cięcie tuż poniżej stawu.Następnie prowadź nożyczki wzdłuż kości udowej i wykonaj cięcie jak najbliżej ciała. Może to spowodować niewielki krwawienie, szczególnie w przypadku przecięcia tętnicy udowej. Podczas usuwania kości udowej niezwykle ważne jest, aby kość pozostała nienaruszona.Jak widać, końce kości nie zostały przecięte ani uszkodzone. Po usunięciu kości udowej należy odciąć wszelkie dodatkowe tkanki i umieścić kość udową w małym naczyniu z naszymi mediami PMI. Podczas usuwania dodatkowych tkanek należy dopilnować, aby kość udowa nie wyschła.Na tym etapie kości udowe należy przenieść do naczynia zawierającego 70% etanol i umieścić na lodzie na okres od pięciu do 10 minut. Na potrzeby tego filmu będziemy kontynuować pracę na blacie laboratoryjnym. Jednak na tym etapie eksperymentu wszystkie czynności powinny być wykonywane w dygestorium do hodowli tkankowej.Po namoczeniu kości w etanolu można je przenieść do większego naczynia z jałową pożywką w celu usunięcia szpiku kostnego. Teraz możemy przystąpić do usunięcia i resuspensji szpiku kostnego. Napełnij strzykawkę insulinową jałową pożywką i odstaw ją na bok do późniejszego użycia.Chwyć kość za pomocą sterylnej pęsety. Trzymaj ją nad małym naczyniem na odpady i odetnij nasadę lub końce kości z każdej strony. Wprowadź strzykawkę insulinową do jednego z końców kości i wypłucz szpik do 15 ml pożywki.Przemyj kość jeszcze jeden lub dwa razy, aż cały szpik zostanie wypłukany. Po wypłukaniu szpiku z kości będzie ona niemal całkowicie biała. Umieść czystą kość w naczyniu na odpady i powtórz cały proces dla drugiej kości udowej.Po zakończeniu tego etapu delikatnie rozbij wszelkie fragmenty szpiku, które nie rozpadły się podczas procesu płukania, aby uzyskać jednorodne zawiesiny pojedynczych komórek. Wymaga to pipetowania przez okres od 5 do 10 minut. Przenieś zawiesinę pojedynczych komórek do stożkowej probówki 50 ml, a płytkę wypłucz co najmniej trzy razy, używając 10 ml pożywki.Za każdym razem odwirować komórki, usunąć medium i resuspender komórki, energicznie i szybko pocierając palcami dno probówki. Aby usunąć erytrocyty (RBC), przeprowadza się lizę wodną. Inną metodą usuwania erytrocytów jest liza chlorkiem amonu.Obie metody zostały opisane w poprzednich artykułach wideo JoVE. Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem systemu Miltenyi Biotec (JoVE, numer 9) oraz przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T z cytokin szczurzych (JoVE, numer 10).Po usunięciu erytrocytów można przystąpić do hodowli komórek. Zanim jednak omówię hodowlę komórek dendrytycznych, chciałbym przedstawić Państwu system Incucyte. System Incucyte umożliwia monitorowanie wzrostu hodowli komórek wewnątrz inkubatora, dzięki czemu możemy obserwować, jak komórki zachowują się w warunkach hodowli.Po przygotowaniu hodowli należy umieścić ją w tacy o odpowiednim rozmiarze i zamknąć system IncuCyte. Następnie w komputerze wystarczy ustawić odstępy czasowe, wybrać studzienki, które mają zostać zobrazowane, i pozwolić systemowi IncuCyte na zbieranie danych. Filmy w niniejszym protokole obrazują zmiany morfologii komórek dendrytycznych in vitro.Filmy te zostały wyeksportowane bezpośrednio z programu witryny Incus. W miarę rozwoju komórek dendrytycznych od pierwszego do jedenastego dnia można zaobserwować rzeczywistą zmianę morfologii, gdy komórki powiększają się i przyjmują fenotyp komórki dendrytycznej. Po lizie i usunięciu RBC, komórki są przemywane w pożywce dla pierwotnych komórek dendrytycznych i wysiewane w zagęszczeniu 5 milionów na ml.Komórki te powinny być początkowo hodowane w pożywce do pierwotnych kultur komórek dendrytycznych, a następnie przeniesione do wtórnej pożywki dla komórek DC, uzupełnionej o 40 ng/ml IL-4 oraz 100 ng/ml TNF-α. Cytokiny te wspomagają powstawanie dojrzałych komórek dendrytycznych, które przypominają komórki dendrytyczne pochodzenia monocytarnego. Teraz pokażę Państwu, jak wyglądają kultury w miarę ich rozwoju oraz jak utrzymywać je w czasie.Po wysianiu komórek można hodować komórki dendrytyczne przez 72 godziny przed pierwszą wymianą pożywki. Oto jak wygląda typowa hodowla tuż po wysianiu komórek w pierwszym dniu. A tutaj przedstawiamy widok komórek.W trzecim dniu można zauważyć, że komórki zaczęły przylegać do płytki, ale nie przyjęły jeszcze klasycznego fenotypu komórek dendrytycznych. W czwartym dniu należy usunąć medium i dodać 10 ml świeżego medium do pierwotnych DC poprzez aspirację medium. W czwartym dniu usuniemy limfocyty oraz wszelkie inne komórki nieprzylegające.Teraz można umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze na kolejne trzy dni, siedem dni po pierwotnym wysianiu. Oto jak wygląda typowa hodowla. W tym momencie można stwierdzić, że nadszedł czas na pasaż i ponowne wysianie komórek.Siódmego dnia komórki dendrytyczne usuwa się z płytki poprzez odessanie pożywki, a następnie dodanie 300 mM sterylnego EDTA i inkubację przez pięć minut. Następnie płytkę wielokrotnie płucze się, trzymając ją pod kątem 45 stopni i pipetując roztwór EDTA o tylną ściankę płytki. Czynność tę powtarza się przez kilka minut, aby upewnić się, że usunięto wszystkie przylegające komórki dendrytyczne.Komórki zbiera się do 50 ml probówki stożkowej i przemywa dwukrotnie pożywką DC secondary. Następnie komórki resuspenduje się i wysiewa w zagęszczeniu 5 milionów komórek na płytkę. Świeżo wysiane siódmego dnia komórki dendrytyczne szybko opadają na dno płytki, przylegają i zaczynają się rozpłaszczać.Jak widać na filmie z witryny Zichy, nagranie to zostało wykonane w inkubatorze w ciągu dwóch dni, aby zaprezentować rozwój komórek dendrytycznych od momentu ponownego wysiania w siódmym dniu do początku dziewiątego dnia. Morfologiczne komórki dendrytyczne mogą zostać aktywowane poprzez puls antygenowy z dodatkiem 2 µg/mL LPS oraz 100 µg/mL OVA do użycia z oczyszczonymi limfocytami T z myszy OT-II, które posiadają swoiste dla OVA limfocyty T CD4+. W przypadku stosowania innego antygenu ważne jest upewnienie się, że do pulsowania komórek dendrytycznych użyto optymalnego stężenia antygenu. Tutaj OVA i LPS są dodawane do pożywki podstawowej w taki sposób, aby końcowe stężenie LPS wynosiło 2 µg/mL w 20 mL, a OVA 100 µg/mL w 20 mL.Oto fotografia przedstawiająca typową hodowlę komórek dendrytycznych w 10. dniu. Na zdjęciu widać, że morfologia jest bardzo charakterystyczna dla komórki prezentującej antygen. Należy zawsze sprawdzać procentowy udział komórek dendrytycznych dodatnich pod kątem CD 11 C za pomocą FACS.Ma to na celu zapewnienie względnie czystej hodowli komórek dendrytycznych do wykorzystania w eksperymentach. W tym przypadku wykorzystujemy system Incucyte firmy SEN Instruments do monitorowania aktywacji komórek dendrytycznych, które w 10. dniu zostały poddane działaniu LPS oraz impulsowi antygenowemu. Niniejsze nagranie obejmuje okres 24 godzin bezpośrednio po dodaniu LPS oraz peptydu; w tym czasie komórki dendrytyczne stają się bardziej aktywne, co objawia się wyraźnymi zmianami morfologicznymi.Po aktywacji komórek dendrytycznych w impulsie antygenowym, można je ponownie zebrać poprzez inkubację z 300 mM EDTA i wypłukanie płytki. Następnie należy odwirować komórki, dwukrotnie przemyć je 50 ml pożywki RPMI w celu usunięcia nadmiaru antygenu, a następnie oznakować odpowiednim barwnikiem cell tracker. W tym eksperymencie będę obrazować komórki w węźle chłonnym pachwinowym.Konieczne będzie podskórne wstrzyknięcie od 2 do 5 milionów komórek dendrytycznych w obszar boku myszy pokazanej tutaj. Następnie odczekujemy 24 godziny, aby komórki dendrytyczne mogły przedostać się do węzła chłonnego szkolącego. W tym filmie komórki dendrytyczne są znakowane CMF two hc, niebieskim barwnikiem do śledzenia komórek.Widoczne są komórki dendrytyczne oddziałujące z oznakowanymi limfocytami T swoistymi dla antygenu volin. Limfocyty T te zostały oznakowane barwnikiem ccf SE. Jako sondy molekularne można również zastosować C-M-T-M-R lub dowolny inny barwnik z serii CellTracker. Przedstawiony etap to wczesna faza aktywacji limfocytów T oddziałujących z komórkami dendrytycznymi.Ze względu na ich swoistość antygenową widać, że limfocyty T przylegają do wypustek niebiesko znakowanych komórek dendrytycznych. To kończy nasz protokół prezentujący przygotowanie i zastosowanie komórek dendrytycznych szpiku kostnego myszy w eksperymencie obrazowania dwukanałowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we własnych eksperymentach.

generation-bone-marrow-derived-murine-dendritic-cells-for-use-2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego do stosowania w obrazowaniu 2-fotonowym

Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w stronę organów odpornościowych, aby zaprezentować przetworzone antygeny limfocytom T. Markowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych organach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Wytwarzanie in vitro plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli dojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy do zastosowania w obrazowaniu 2-fotonowym interakcji immunologicznych.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Przeglądaj więcej filmów