Name: Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka z mysiego żółtka i AGM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-27T19:56:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj technikę mikrodisekcji do izolacji wczesnych komórek macierzystych krwi z worka żółtkowego i regionu AGM u myszy. Metoda obejmuje sortowanie cytometryczne przepływowe dla czystych populacji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Disekcja i izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z pęcherzyka żółtkowego oraz obszaru aorta-gonada-meznefros myszy
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem pracy należy przygotować wszystkie odczynniki i narzędzia niezbędne do procedury: 
<ul>
<li>Nożyczki</li>
<li>Pinceta rozmiar 4 oraz chirurgiczna pinceta z zakrzywionym końcem rozmiar 5/45 (opcjonalnie)</li>
<li>Igły 30G z strzykawką</li>
<li>Szalki Petriego 35mm&nbsp; oraz 100mm</li>
<li>PBS z 10% i 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS)</li>
<li>oraz na koniec kolagenaza</li>
</ul>
</li>
<li>Aby rozpocząć sekcję, należy pobrać rogi macicy od ciężarnej samicy w 10,5 dniu po zapłodnieniu.</li>
<li>Zwierzęta są uśmiercane zgodnie z zatwierdzonymi procedurami.&nbsp;Stosujemy uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych.</li>
<li>Brzuch samicy zwilżamy etanolem, a skórę rozcinamy nożyczkami.</li>
<li>Przytrzymując skórę pincetą, wykonujemy dodatkowe nacięcia w celu otwarcia otrzewnej.</li>
<li>Po otwarciu jamy brzusznej widoczne stają się rogi macicy. Przytrzymując rogi macicy pincetą, odcinamy każdy z końców dystalnych oraz środek, aby wyciąć oba rogi.</li>
<li>Rogi macicy umieszcza się następnie w szalce Petriego zawierającej zimny PBS z 10% FBS w celu usunięcia tkanek macicy.</li>
<li>Korzystając z pincety rozmiar 4 i pracując pod mikroskopem, delikatnie usuwamy tkankę endometrium z otoczenia każdego konceptusu embrionalnego, uważając, aby nie przebić łożyska.</li>
<li>Po usunięciu embriony umieszcza się w nowej szalce z zimnym PBS i 10% FBS.</li>
<li>Ostrożnie usuwamy tkankę łożyska, aby odsłonić embrion otoczony pęcherzykiem żółtkowym, używając pincety do odcięcia pęcherzyka z embrionem od łożyska w miejscu ich połączenia.&nbsp;Pęcherzyk żółtkowy zawierający tętnice witelinowe oraz fragment pępowiny można delikatnie oddzielić od embrionu i odstawić na lód do dysocjacji.</li>
<li>Embrion przenosi się do małej szalki Petriego z minimalną ilością PBS z 10% FBS – w ilości wystarczającej do zwilżenia embrionu, ale nie nadmiernej. Optymalny poziom cieczy&nbsp;powoduje, że embrion pozostaje nieruchomy podczas powolnego wstrząsania płytką, co zapewnia stabilne ułożenie embrionu podczas sekcji.</li>
<li>Należy przejść do użycia igieł 30G, które służą&nbsp;do usunięcia górnej i dolnej części embrionu poprzez cięcie powyżej kończyn przednich i poniżej kończyn tylnych.&nbsp;Opanowanie używania igieł jako narzędzi tnących może wymagać pewnej praktyki.&nbsp;Metoda wykonywania powtarzalnych małych nacięć poprzez krzyżowanie&nbsp;igieł pozwoli na rozcięcie tkanki; igła trzymana w dłoni dominującej służy jako prowadnica dla igły trzymanej w dłoni niedominującej.</li>
<li>Usuwamy część grzbietową embrionu.&nbsp;Jest to tkanka zawierająca somity.&nbsp;Delikatnie wycinamy najbardziej grzbietową tkankę, zachowując bezpieczny odstęp od aorty (czerwona linia), aby uniknąć jej uszkodzenia.&nbsp;Przecięcie aorty spowodowałoby utratę krwi i utrudniło wizualizację jej położenia.&nbsp; Ponownie, wykonywanie małych nacięć igłami jest&nbsp;kluczowe dla zachowania precyzji cięcia.</li>
<li>Odsuwamy nadmiar tkanki poza pole widzenia i obracamy embrion, aby wyciąć tkankę brzuszna, ponownie tnąc jak najbliżej aorty, tak aby jej nie uszkodzić.&nbsp; Nacięcia wykonane zbyt daleko od optymalnego miejsca spowodują obecność tkanek brzusznych, które można usunąć po wyizolowaniu AGM.</li>
<li>Ustawiamy embrion stroną&nbsp;grzbietową do dołu lub plecami do płytki.&nbsp;Delikatnie rozkładamy embrion, dociskając boki i lokalizując grzebienie gonadalne.&nbsp;Znajdują się one nieco poza centrum jako struktury rurkowate po obu stronach aorty.</li>
<li>Sekcję kończymy poprzez usunięcie nadmiaru tkanek bocznych, stosując te same techniki cięcia co wcześniej. Po usunięciu tkanki bocznej embrionu, obraca się go do góry nogami, aby usunąć pozostałą tkankę boczną.</li>
<li>Na tym etapie dokonuje się inspekcji AGM pod kątem obecności nadmiaru tkanki, którą można łatwo usunąć za pomocą igieł bez uszkodzenia aorty lub gonad.&nbsp;Usunięcie jak największej ilości nadmiaru tkanek pozwala na lepszą izolację populacji komórek macierzystych, ponieważ do ich oczyszczania wykorzystujemy tylko kilka markerów powierzchniowych.</li>
<li>Używając pincety z zakrzywionym końcem, delikatnie pobieramy każde AGM i umieszczamy w zimnym PBS z 10% FBS do momentu rozpoczęcia dysocjacji.</li>
</ol>
Dysocjacja i analiza FACS
<ol>
<li>Aby rozdzielić tkanki, należy najpierw umieścić worki żółtkowe i obszary AGM w osobnych probówkach.&nbsp; </li>
<li>Krótko wirować, abyt stworzyć osad z tkanek, a następnie usunąć PBS z 10% FBS.</li>
<li>Resuspender tkanki w 0,25% kolagenazie w PBS z 20% FBS, stosując objętość wystarczającą do całkowitego przykrycia tkanek.</li>
<li>Inkubować tkanki w temperaturze 37°C.&nbsp; Przez 25-30 min dla AGM i 35-40 min dla worków żółtkowych.</li>
<li>Po zakończeniu inkubacji delikatnie pipetować tkanki w górę i w dół, aby rozdzielić je do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Przemyć tkanki nadmiarem PBS z 10% FBS, odwirować komórki i resuspender w świeżym sterylnym PBS z 10% FBS.</li>
<li>Do analizy FACS komórki barwi się zgodnie z zaleceniami producenta.&nbsp;Do przeprowadzenia cytometrii przepływowej wykorzystujemy urządzenie FACSAria firmy&nbsp;BD Biosciences. Ze względu na rozmiar i kruchość komórek embrionalnych, aperturę sortowania dostosowuje się do większej średnicy niż w przypadku dorosłych komórek krwiotwórczych, które również badamy w laboratorium. Podobnie ciśnienie jest ustawione na niższe niż wymagane dla dorosłych komórek krwiotwórczych.&nbsp;Na przykład podczas sortowania na urządzeniu FACSAria rozmiar dyszy wynosi 100 mikronów, a ciśnienie sortowania 30 psi.</li>
<li>W analizach komórek macierzystych metodą FACS z worka żółtkowego izoluje się i sortuje komórki potrójnie dodatnie wykazujące markery cKit, CD34 i CD41, natomiast z obszaru AGM izoluje się komórki podwójnie dodatnie (cKit, CD34).&nbsp;Typowy wykres wyglądałby następująco: komórki cKit dodatnie są analizowane pod kątem CD34 i CD41 jednocześnie lub indywidualnie.&nbsp;Zazwyczaj komórki wykazują stopniowalną dodatniość dla każdego markera, przy czym populacja komórek macierzystych stanowi podzbiór populacji dodatnich.&nbsp; Wykresy te wskazują, że uzyskano dobrą wydajność komórek, na poziomie 100-300 komórek na jeden worek żółtkowy i na jeden obszar AGM.</li>
</ol>

izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru agm myszy

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

W embrionie myszy wczesna hematopoeza zachodzi jednocześnie w wielu organach, w tym w worku żółtkowym oraz w regionie aorty, gonad i mezonefry. Obszary te są kluczowe dla ustanowienia układu krwiotwórczego w embrionach, co prowadzi do późniejszej migracji komórek macierzystych do wątroby płodowej, a następnie do rozwoju dorosłych komórek macierzystych w szpiku kostnym. Wczesne hematopoetyczne komórki macierzyste można wyizolować z tych organów poprzez mikrodysekcję embrionu, a następnie sortowanie cytometryczne w celu uzyskania czystszej populacji. Pozostaje niejasne, w jaki sposób populacje tych komórek macierzystych przyczyniają się do tworzenia puli komórek macierzystych płodu i osobników dorosłych. Ponadto nasze laboratorium bada, czym wczesne komórki macierzyste różnią się funkcjonalnie od hematopoetycznych komórek macierzystych płodu i osobników dorosłych. Nasz zespół sortuje również różne populacje hematopoetycznych komórek macierzystych i testuje ich rolę funkcjonalną w kontekście różnorodnych modeli genetycznych. W niniejszym materiale wideo demonstrujemy powszechnie stosowaną przez nas procedurę mikrodysekcji oraz przedstawiamy wyniki typowego wykresu FACS. Po wyizolowaniu tych rzadkich populacji możliwe jest przeprowadzenie szeregu testów funkcjonalnych, w tym testów kolonogennych i przeszczepów szpiku kostnego.

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

W embrionie myszy wczesna hematopoeza zachodzi jednocześnie w wielu organach, w tym w pęcherzyku żółtkowym oraz w regionie aorty, gonad i metanefryka. Te...

W zarodku myszy wczesna hematopoeza zachodzi jednocześnie w wielu organach, w tym w pęcherzyku żółtkowym, w obszarze aorta-gonad-mezonefros. Co ważniejsze, wczesne komórki macierzyste krwi można wyizolować z tych organów poprzez mikrodysekcję zarodka, a następnie sortowanie cytometryczne w celu uzyskania czystszej populacji.W tym filmie demonstrujemy powszechnie stosowaną przez nas procedurę mikrodysekcji, a także prezentujemy wyniki typowego wykresu fax. Cześć, nazywam się Kelly Morgan i pracuję w laboratorium dr. Gary'ego Gillanda w Howard Hughes Medical Institute oraz w Departamencie Medycyny w Brigham and Women's Hospital; przeszłam szkolenie pod kierunkiem Elaine Dza w Erasmus University Medical Center w Rotterdamie. Dzisiaj zaprezentuję procedurę dysekcji embrionalnej w celu uzyskania wczesnych komórek macierzystych krwiotwórczych z pęcherzyka żółtkowego oraz z regionu aorta-gonada-mezonefros (AGM). A ja jestem Michael Care.Również z laboratorium Go. Przedstawię Państwu sposób przygotowania jednokomórkowych zawiesin komórek GM oraz komórek żółtka dla HSC z wykorzystaniem FACS. Procedura ta obejmuje wycięcie wczesnych organów krwiotwórczych z embrionów w stadium E 10,5, dysocj

isolation-early-hematopoietic-stem-cells-from-murine-yolk-sac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja wczesnych komórek macierzystych krwiotwórczych z torbieli żółtkowej i AGM myszy

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten film demonstruje technikę generowania myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS). Krwiotwórcze komórki macierzyste CD34 + (HSC) są izolowane z ludzkich komórek kożucha krwi pępowinowej za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. HSC CD34+ są namnażane w pożywce wzrostowej wzbogaconej o cytokiny i kriokonserwowane. Na koniec rozmrożone HSC wstrzykuje się do mysiego szczeniaka z niedoborem odporności w celu ustalenia mysiego modelu HIS.

Izolowanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wytworzenia myszy z ludzkim układem odpornościowym

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Ten protokół opisuje użycie hodowanych Aorta-Gonad-Mesonephros do analiz ekspresji, jednostek tworzących kolonie w hodowli i śledzionie oraz długoterminowej rekonstytucji w celu określenia wpływu czynników regulacyjnych i szlaków sygnałowych na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykazano, że jest to skuteczny system do badania biologii i funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych.

Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

To badanie ustaliło stabilną i efektywną metodę izolacji, hodowli i funkcjonalnego określania komórek macierzystych CD34+ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych (CD34+ VW-SCs). Ta łatwa do naśladowania i efektywna czasowo metoda izolacji może być wykorzystana przez innych badaczy do badania potencjalnych mechanizmów związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Poznaj technikę mikrodisekcji do izolacji wczesnych komórek macierzystych krwi z worka żółtkowego i regionu AGM u myszy. Metoda obejmuje sortowanie cytometryczne przepływowe dla czystych populacji komórkowych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Przeglądaj więcej filmów