Name: Wsteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez zastosowanie fluoro-złota na powierzchni wzgórka górnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Poznaj technikę wstecznego znakowania komórek zwojowych siatkówki przy użyciu fluoro-złota na wzgórku górnym u szczura. Ta metoda umożliwia ocenę przeżycia komórek i działania leków w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie udzielone przez National Glaucoma Program fundacji American Health Assistant Foundation.

<ol>
<li>Zanurz szczura w narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie ketaminy (80mg/kg) i ksylazyny (8mg/kg) (stosunek objętości 2:1). Nałóż sterylną maść nawilżającą do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówek podczas operacji.</li>
<li>Wygol sierść na głowie (od poziomu oczu do uszu), unieruchom głowę na statywie za pomocą zacisku i umieść siekacze w prowadnicy.</li>
<li>Zdezynfekuj pole operacyjne 10% roztworem powidonu jodowego, a następnie 70% alkoholem.</li>
<li>Nacinaj skórę i mięśnie, aby odsłonić czaszkę i szwy (szew strzałkowy, wieńcowy i poprzeczny) (Rycina 1). Na obszar nacięcia nanieś środek przeciwbólowy, bupiwakainę w formie sprayu (dawka nie może przekroczyć 2 mg/kg).</li>
<li>Wywierć w czaszce otwór (ø 2x2 mm, 0,5 mm od szwu strzałkowego i poprzecznego) po każdej stronie szwu strzałkowego. Unikaj przerwania opon mózgowych oraz zatoki znajdującej się pod szwami. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="Schemat szwów czaszkowych; oznaczone obszary: bregma, lambda, szew wieńcowy, strzałkowy i poprzeczny." width="469" height="317" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Punkty orientacyjne na czaszce żywego szczura."> Rycina 1. Punkty orientacyjne na czaszce żywego szczura. </li>
<li>Przetnij opony mózgowe nożyczkami sprężynowymi, unikając ich rozdarcia.</li>
<li>Ostrożnie odessij za pomocą pompy próżniowej treść mózgową znajdującą się nad powierzchnią grzbietową wzgórka górnego, kierując się trzema punktami kontrolnymi:<ol>
<li>zmiana koloru tkanki mózgowej z szarej na białą, a następnie ponownie na szarą</li>
<li>zaprzestanie aspiracji w momencie pojawienia się bezbarwnego płynu mózgowo-rdzeniowego</li>
<li>ostrożne poziome poszerzenie najniższego poziomu ssania w celu odsłonięcia żółtawego wzgórka górnego pokrytego oponą twardą</ol></li>
<li>Aspiruj treść mózgową nad wzgórkiem górnym, aż cztery krawędzie wzgórka górnego będą widoczne bezpośrednio pod mikroskopem. Usunięta część kory mózgowej powinna być ograniczona do minimum, aby uniknąć niepożądanych skutków ubocznych (np. dysfunkcji ruchowych). Należy uważać, aby nie dotknąć zatoki.</li>
<li>Osusz płyn w otworze za pomocą cienkiego, sterylnego paska bawełny, aby powierzchnia wzgórka górnego była jak najbardziej sucha. Następnie na powierzchnię wzgórka górnego nałóż cienką warstwę gąbki żelatynowej uprzednio nasączonej 6% Fluoro-Gold (FG jest pobierany przez zakończenia aksonów komórek zwojowych siatkówki i transportowany wstecznie obustronnie do ich ciał komórkowych w siatkówce).</li>
<li>Wypełnij otwór gąbką żelatynową i zamknij ranę skórną za pomocą klipsów chirurgicznych.</li>
<li>Zwierzęta pozostawiono do regeneracji pod lampą żarową w celu utrzymania ciepła. Przeciwbólowca, buprenorfinę (100mcg/kg), podawano doustnie w wodzie pitnej przez 5 dni po znakowaniu wzgórka górnego.</li>
</ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol>
<li>Dlaczego w celu zliczenia komórek zwojowych siatkówki stosuje się tę metodę chirurgiczną? U szczura wiadomo, że około 98% komórek zwojowych siatkówki (RGC) rzutuje do przeciwległego wzgórza górnego (SC). Aplikacja fluoro-gold na powierzchnię SC pozwala na oznakowanie niemal wszystkich RGC, dzięki czemu możemy skupić się na tych najbardziej podatnych na uszkodzenia neuronach siatkówki w jaskrze. W porównaniu z transportem wstecznym RGC poprzez umieszczenie FG na kikutcie przeciętego nerwu wzrokowego przez 2 dni, wpływ na prz...

wsteczna znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez aplikację fluoro-gold na powierzchnię wzgórka górnego

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

Liczenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) jest niezbędne do oceny degeneracji siatkówki, szczególnie w przypadku jaskry. Wiarygodne znakowanie RGC jest kluczowe dla oceny efektów każdej terapii. U szczura wiadomo, że około 98% RGC wysyła projekcje do przeciwległego wzgórza górnego (SC) (Forrester i Peters, 1967). Aplikacja fluoro-gold (FG) na powierzchnię SC pozwala oznakować niemal wszystkie RGC, co umożliwia skupienie uwagi na tych najbardziej podatnych na uszkodzenia neuronach siatkówki w przebiegu jaskry. FG jest pobierany przez zakończenia aksonalne komórek zwojowych siatkówki i transportowany drogą retrogradną obustronnie do ich ciał komórkowych w siatkówce. W porównaniu z retrogradnym znakowaniem RGC poprzez umieszczenie FG na kikutie przeciętego nerwu wzrokowego przez 2 dni, w tej metodzie zminimalizowany jest wpływ na przeżywalność RGC. W porównaniu z barwieniem fioletem krezylowym, które barwi RGC, komórki amakrynowe oraz śródbłonek naczyń krwionośnych w warstwie komórek zwojowych siatkówki, ta metoda znakowania jest bardziej specyficzna dla RGC. Niniejsze wideo opisuje metodę retrogradnego znakowania RGC poprzez aplikację FG na powierzchnię SC. Przedstawione zostają procedury chirurgiczne, obejmujące trepanację czaszki, aspirację kory w celu odsłonięcia SC oraz aplikację gąbki żelatynowej na całą grzbietową powierzchnię SC. Podano przydatne wskazówki pozwalające uniknąć masywnego krwawienia wewnątrzczaszkowego oraz aspiracji SC.

W niniejszym filmie opisano metodę znakowania wstecznego komórek zwojowych siatkówki (RGC) poprzez aplikację fluoro-gold (FG) na powierzchnię wzgórka górnego (SC). Technika ta obejmuje wykonanie otworu trepanacyjnego w czaszce, aspirację kory oraz nałożenie gąbki żelatynowej na całą grzbietową powierzchnię SC.

Wsteczna znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez aplikację Fluoro-Gold na powierzchnię wzgórka górnego

Liczenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) jest niezbędne do oceny degeneracji siatkówki, szczególnie w przypadku jaskry. Niezawodne znakowanie RGC ma fundamentalne znaczenie dla...

Cześć, jestem Tu z laboratorium GOSO na Uniwersytecie w Hongkongu. Dzisiaj przedstawię sposób retrogradowego znakowania komórek zwojowych siatkówki szczura.Komórki zwojowe siatkówki zostaną oznakowane metodą retrograde poprzez zastosowanie barwnika fluorescencyjnego na powierzchni kolcolistawki górnej, aby w późniejszym czasie móc policzyć komórki zwojowe na płasko przygotowanej siatkówce w celu oceny śmierci komórek lub efektu zastosowanego leku. Jest to zdjęcie ilustrujące drogę z siatkówki do kolcolistawki górnej. Barwnik fluorescencyjny może być transportowany wstecznie z kolcolistawki górnej poprzez drogę wzrokową.Przeciągnij światłowód przez nerw wzrokowy do siatkówki oka. Do przeprowadzenia zabiegu wykorzystujemy mikroskop operacyjny. Pompa próżniowa służy do aspiracji kory mózgową nad powierzchnią grzbietową, a uchwyt CLE do stabilizacji głowy w odpowiedniej pozycji.Użyto wiertła do szczurów w celu otwarcia czaszki oraz chłonnej gąbki do aplikacji fluorescencyjnego barwnika FG na powierzchnię kory. Instrumenty zostały poddane autoklawowaniu przed operacją, w tym pęseta precyzyjna, nożyczki sprężynowe, igła próżniowa, końcówka wiertła i klipsy do szwów. Skalpel do nacięcia skóry, linijka do pomiarów oraz wata również znajdowały się w stanie sterylnym.Przeanalizowano szczura po wewnątrzżylnym wstrzyknięciu ketaminy i żelu sinegel. Po zgoleniu sierści od poziomu oczu do poziomu uszu zdezynfekowano obszar operacyjny povidonem jodowym, a następnie 70% alkoholem. Następnie umieszczono głowę szczura w odpowiedniej pozycji na podstawie stereotaktycznej.Naciąć skórę wzdłuż linii środkowej głowy, zaczynając od poziomu oczu aż do poziomu uszu. W ten sposób uzyskujemy dobrą ekspozycję szwu wieńcowego, szwu strzałkowego oraz szwu poprzecznego; tutaj znajduje się BMA, a tutaj Lambda. Zaznaczyć miejsce wkręcenia śruby w odległości od 0,5 do 1 mm od końcowego końca szwu poprzecznego, a następnie oznaczyć je symetrycznie po obu stronach, upewniając się, że marka znajduje się w odległości co najmniej 0,5 mm od szwów.Następnie można przystąpić do wiercenia otworu wzdłuż znacznika, kontrolując prędkość i kierunek wiertła, aż do szerokiego przerwania opon mózgowych i wyściółki zatoki pod szwem. Należy zaprzestać wiercenia, gdy średnica osiągnie około dwóch milimetrów. Następnie ponownie sprawdzamy drugą stronę, aby upewnić się, że otwór ma odpowiednią wielkość i znajduje się w prawidłowym miejscu.Przetnij opony mózgowe za pomocą nożyczek sprężynowych. Użyj precyzyjnej pęsety, aby oczyścić otwór z odłamków kostnych. Teraz można rozpocząć aspirację za pomocą pompy próżniowej. Pierwszą warstwą BR jest materia zielona, którą należy wyciąć ponownie wraz z oponami.Następnie można zauważyć, że kolor tcell zmienia się na biały. Jest to istota biała rdzenia kręgowego. Aspirację należy przeprowadzać ostrożnie i powoli.W tej chwili ponownie widzimy istotę szarą. Kolor staje się mniej biały. W dolnej części widać, że jest szara.Rozumiem. Widać tutaj, że wypływa przejrzysty płyn mózgowo-rdzeniowy. Oznacza to, że docieramy do grzbietowej powierzchni górnego zrębu.Ponownie widzimy powiększony otwór na tym poziomie. Na dole można zauważyć, że żółtawa opona twarda pokrywa górny róg. Wykonujemy aspirację poziomą na tej wysokości, aby uniknąć zniszczenia zawartości górnego rogu.Następnie możemy rozpocząć proces w całości. Widać materię w kolorze zielonym. Ma ona w rzeczywistości zielony kolor.Następnie przechodzimy do istoty białej. Tkanka ma biały kolor. Teraz można wyraźnie zauważyć, że płyn mózgowo-rdzeniowy przepływa pod tą szarą warstwą.Usuń ostatnią warstwę istoty szarej, aby odsłonić żółtą oponę twardą. Należy teraz ostrożnie przerwać ciągłość opony twardej nad poszczególnymi klikerami, a następnie powiększyć otwór. Upewnij się, że pod mikroskopem widoczna jest pełna krawędź klikerów.Należy ustawić zacisk głowicy pod różnymi kątami i przeprowadzić końcowe odsysanie, aż cztery krawędzie CLE będą bezpośrednio widoczne pod mikroskopem. Płyn znajdujący się w otworze należy wchłonąć za pomocą cienkiego paska bawełny, aby powierzchnia CLE była jak najmocniejsza. Należy wziąć kawałek żelatyny, uprzednio zabarwionej 6% złotem koloidalnym, i podzielić go na mniejsze części.Nanieś go w postaci cienkiej warstwy, której rozmiar jest nieco większy niż cała powierzchnia grzbietowa górnej części. Ostrożnie nałóż go na powierzchnię górnych klipsów, a następnie na stronę przeciwległą. Umieść go wewnątrz otworu, pokrywając całą powierzchnię klipsów poprzez otwory, z większą dawką rozpylania.Na koniec zamknąć ranę skórną za pomocą klipsów chirurgicznych i oczyścić ranę po operacji, a następnie umieścić szczura w czystej klatce w ciepłych warunkach, aby mógł dojść do siebie. Po przebudzeniu szczur zachowuje się normalnie po zabiegu.Siedem dni po znakowaniu SC wycinamy siatkówkę i przygotowujemy preparat płaski, a następnie zliczamy komórki zwojowe siatkówki przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem UV. Ponieważ 98% komórek zwojowych siatkówki rzutuje do wzgórza górnego, wiarygodne znakowanie ST jest kluczowe dla oceny postępu choroby i działania leku. Jest to przykład retrogradnie znakowanych komórek zwojowych na preparacie płaskim siatkówki.

retrograde-labeling-retinal-ganglion-cells-application-fluoro-gold-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odwrotne znakowanie komórek ganglionicznych siatkówki przez zastosowanie Fluoro-Gold na powierzchni górnego wzgórza

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Dziewięćdziesiąt procent komórek zwojowych siatkówki (RGCs), których aksony zostały całkowicie przecięte (aksotomia), obumiera w ciągu 14 dni po aksotomii. Model ten jest łatwy do manipulacji eksperymentalnych i wykazuje wysoką powtarzalność.

Przecięcie nerwu wzrokowego: Model apoptozy neuronów dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Model ten jest idealny do przeprowadzania szeregu manipulacji eksperymentalnych, które oddziałują na siatkówkę w sposób globalny lub są skierowane bezpośrednio do uszkodzonej populacji neuronów komórek zwojowych siatkówki.

Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Źródło: Inal, M. A. et. al., wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila przy użyciu lipofilowych barwników fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych Drosophila za pomocą barwników lipofilowych. Barwnik dostaje się do aksonu, przemieszcza się wstecz i oznacza neurony na zielono, umożliwiając szczegółową wizualizację ich morfologii i projekcji pod mikroskopem konfokalnym.

Wsteczne znakowanie neuronów ruchowych Drosophila za pomocą fluorescencyjnych barwników lipofilowych

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Wprowadzamy skuteczną metodę wstecznego oznaczania komórek zwojowych siatkówki (RGC) u dorosłych ryb pręgowanych.

Wsteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki u dorosłych danio pręgowanego za pomocą barwników fluorescencyjnych

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Wtórne zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) występuje często w jaskrze. W pracy opisano innowacyjne podejście operacyjne do częściowej transsekcji nerwu wzrokowego. Zastosowanie tego oszczędzającego miejsce podejścia operacyjnego rozszerza zakres zastosowań modelu i umożliwia eksplorację mechanizmów wtórnych uszkodzeń w RGC w nowy sposób.

Częściowa transsekcja nerwu wzrokowego u szczurów: model ustalony z nowym podejściem operacyjnym do oceny wtórnego zwyrodnienia komórek zwojowych siatkówki

Poznaj technikę wstecznego znakowania komórek zwojowych siatkówki przy użyciu fluoro-złota na wzgórku górnym u szczura. Ta metoda umożliwia ocenę przeżycia komórek i działania leków w badaniach neurobiologicznych.

Wsteczna znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez aplikację Fluoro-Gold na powierzchnię wzgórka górnego

Przeglądaj więcej filmów