Name: Podwójna hybrydyzacja in situ wczesnych zarodków piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Naucz się podwójnej hybrydyzacji in situ w zarodkach kurczaka, aby wizualizować wzorce ekspresji dwóch genów jednocześnie. Ta metoda pozwala badaczom analizować interakcje genów w rozwoju zarodkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez Margaret M. Alkek Foundation dla RHF.

Część 1: Fiksacja embrionów

<ol>
<li>Napełnić naczynie do sekcji lodowatym roztworem depc-PBS. Przechowywać w lodzie. Otworzyć jajo, uderzając w skorupkę pęsetą, a następnie usunąć odłamki skorupki.</li>
<li>Usunąć gęste albuminy za pomocą pęsety. Przechylić worek żółtkowy za pomocą pęsety grubościennej tak, aby embrion był skierowany ku górze.</li>
<li>Za pomocą nożyczek wyciąć kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu.</li>
<li>Za pomocą łyżeczki wyjąć embrion z żółtka i umieścić go w lodowatym roztworze depc-PBS.</li>
<li>Pod mikroskopem usunąć błony oraz żółtko i przenieść embrion do naczynia do fiksacji.</li>
<li>Przyszpilić preparat i usunąć depc-PBS. Zastąpić go 4% PFA w depc-PBS i fiksować przez noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Usunąć utrwalacz. Zastąpić go lodowatym roztworem depc-PBS. Za pomocą tępej igły mikrokapiilarnej lub noża do mikrodysekcji wykonać perforacje w obrębie układu nerwowego oraz jam serca, aby zapobiec uwięzieniu sondy.</li>
<li>Przemyć 2x przez 10 mn roztworem depc-PBS z 0,1% Tween-20 (PBT). Odwadniać przez 10 mn w kolejnych stężeniach metanolu w PBT: 25%, 50%, 75%. Odwadniać embriony dwukrotnie w 100% metanolu. Przechowywać w temperaturze -20°C w metanolu.</li>
</ol>
Część 2: Prehybrydyzacja
<ol>
<li>Rehydratuj zarodki przez 10 min każdy w 75%, 50% i 25% metanolu w PBT. Przemyj 2x po 10 min w PBT.</li>
<li>W międzyczasie przygotuj lodowaty utrwalacz (4% paraformaldehyd w PBT). Zastąp PBT roztworem proteinazy K (3 ml/fiolka; stężenie końcowe [5?g/ml] w PBT). Upewnij się, że cała zawartość fiolki ma kontakt z roztworem proteinazy K, delikatnie obracając fiolkę; czasy ekspozycji sprawdź w sekcji Rozwiązywanie problemów.</li>
<li>Za pomocą pipety Pasteura wolnej od RNaz usuń proteinazę K i dodaj utrwalacz (2 ml). Natychmiast umieść na lodzie dokładnie na 20 min.</li>
<li>Wszystkie płukania w temperaturze pokojowej wykonuje się na nutatorze. Przemyj 2x po 10 min w PBT oraz 1x przez 10 min w PBT zawierającym 50% buforu hybrydyzacyjnego.</li>
<li>Przemyj 1x w buforze hybrydyzacyjnym. Inkubuj w 65°C w 2 ml buforu hybrydyzacyjnego przez 4-5 godz.</li>
</ol>
Część 3: Hybrydyzacja zarodków z sondami
<ol>
<li>Synteza sond sprzężonych z DIG i FITC została opisana w dodatku. Sondę, od której oczekuje się silnego sygnału, należy zsyntetyzować z nukleotydów zawierających FITC; sondę słabszą należy zsyntetyzować z nukleotydów zawierających DIG.</li>
<li>Podgrzej wstępnie sondy w buforze do hybrydyzacji (każda w stężeniu 500 ng/ml), używając probówki o pojemności 2 ml. Bezzwłocznie zastąp bufor do hybrydyzacji roztworem sondy. Nie dopuść do wyschnięcia embrionów. Inkubuj przez 16 hr w temperaturze 65°C.</li>
<li>Zastąp sondę buforem do hybrydyzacji, wykonaj 2 płukania po 30 mn każde w temperaturze 65°C. Płucz przez 15 mn w roztworze bufor do hybrydyzacji/MABT (1/1 v/v/) w temperaturze 65°C.</li>
</ol>
Część 4: Inkubacja z przeciwciałami anty-DIG i reakcja barwna
<ol>
<li>Przemyć 2x po 20 mn w MABT. Przemyć przez 1 hr w 2% BBR/MABT. Przemyć przez 5 hr w 2% BBR/20%HISS/MABT (bufor blokujący). Inkubować z przeciwciałem anty-DIG w rozcieńczeniu 1:2000 w buforze blokującym, przez noc (O/N) w temperaturze 4°C na nutatorze.</li>
<li>Przemyć 3x po 10 mn w MABT, a następnie 3x po 1 hr w MABT.</li>
<li>Przemyć 2x po 20 mn w NTMT. Dodać 200ul substratu NBT/BCIP do 10 ml NTMT. Bezzwłocznie usunąć NTMT z probówki i zastąpić go 1-2 ml buforu NBT/BCIP. Przechowywać w ciemności. Monitorować reakcję barwną po 20 mn, a następnie w odstępach 20 mn.</li>
<li>Po wystąpieniu reakcji barwnej (powinien pojawić się kolor niebieski), przemyć w PBS przez 10 mn, przytwierdzić na szalce do fiksacji wypełnionej PBS i zastąpić roztwór 4% PFA w PBS. Utwierdzić przez noc (O/N) w temperaturze 4°C.</li>
<li>Przenieść do nowej probówki scyntylacyjnej. Przemyć w PBST (PBS z 1% Tween-20) 2x po 10 mn. Przemyć w MABT 2x po 10 mn.</li>
<li>Inkubować w MABT przez 30 mn w temperaturze 63°C.</li>
</ol>
Część 5: Inkubacja z przeciwciałem FITC i reakcja barwna
<ol>
<li>Przemywać 2x przez 10 mn w MABT, inkubować przez 1 hr w 2%BBR/MABT, a następnie przez 5 hr w buforze blokującym</li>
<li>Inkubować z przeciwciałem anty-FITC sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (1:500) przez noc (O/N) w 4°C.</li>
<li>Przemywać 3x po 10 mn w MABT, a następnie 3x po 1 hr w MABT.</li>
<li>Przemywać 2x przez 20 mn w TBS pH 8.45 z 0.1% Tween-20 (TBST).</li>
<li>Przygotować roztwór roboczy Vector Red (5 ml) w TBST, używając odczynników 1, 2 i 3 dołączonych do zestawu. Natychmiast usunąć TBST z fiolki i zastąpić go buforem Vector Red. Przechowywać w ciemności. Monitorować reakcję barwną po 40 mn, a następnie w odstępach co 30 mn.</li>
<li>Po wystąpieniu reakcji barwnej (powinien pojawić się kolor czerwony) przenieść embriony do PBS.</li>
</ol>
Część 6: Fixacja i przetwarzanie
<ol>
<li>Przenieść do naczynia do utrwalania zawierającego PBS i utrwalić w 4% PFA przez 20 mn w RT lub przez noc w 4°C.</li>
<li>Przemyć w PBS, 2x 10 mn. W celu przygotowania do fotografii przenieść do 20% glicerolu w PBS (sprawi to, że embriony staną się półprzezroczyste). Aby utworzyć komorę, wyciąć 2 paski taśmy PVC i nałożyć je na siebie na szkiełku. Za pomocą skalpela wyciąć kwadrat w centrum. Usunąć kwadrat pęsetą.</li>
<li>W celu przygotowania do cięcia w wosku przenieść z powrotem do PBS, przemyć 2x 10 mn, a następnie odwodnić w stopniowanych seriach metanolu (25%, 50%, 75% i 100% w PBS, po 10 mn każda).</li>
<li>Zastąpić propanolem, 3mn. Zastąpić 1,2,3,4-tetrahydronaftalenem, 20 mn, a następnie Histoclear (2x 1 h). Zastąpić mieszaniną Histoclear/wosk 1/1 (v/v) w 60°C przez 1 h. Zastąpić woskiem i przetworzyć do badania histologicznego.</li>
</ol>
Część 7: Roztwory
Bufor do hybrydyzacji, przechowywać w -20°C w probówce Falcon, 50 ml: 25 ml formamidu; 3,25 ml (20xSSC); 0,5 ml (0,5M EDTA); 1 ml (10% Tween-20); 2,5 ml (1% SDS); 125 ul (20mg/ml tRNA); 100ul (50 mg/ml heparyny). MABT, przygotować 100mM kwasu maleinowego; dostosować pH do 7,5 za pomocą granulek NaOH. Dodać 150mM NaCl i 0,1% Tween-20.
NTMT (przygotowany bezpośrednio przed użyciem), 50 ml: 1ml (5M NaCl); 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9,5); 1,25 ml (2M MgCl2); 5 ml (10% Tween-20).
TBST: 0.1M Tris-HCl, 0.15M NaCl, pH 8.45, 0.1% Tween-20.
Część 8: Rozwiązywanie problemów
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Problem </td><td>Przyczyna </td><td>Rozwiązanie </td>
</tr>
<tr>
<td valign="top">Zwinięty zarodek</td>
<td valign="top">Niewystarczająca dehydratacja/rehydratacja</td>
<td valign="top">Zachowanie 10 mn odstępów podczas kolejnych etapów dehydratacji/rehydratacji</td>
</tr>
<tr>
<td valign="top">Brak sygnału sondy</td>
<td valign="top">Sonda uległa degradacji z powodu zanieczyszczenia fiolki RNazą</td>
<td valign="top">Przeprowadzić elektroforezę sondy na 1% żelu agarozowym. Upewnić się, że cała zawartość fiolki ma kontakt z roztworem Proteinazy K w kroku 2</td>
</tr>
<tr>
<td valign="top">Sonda znakuje jamy serca i cewkę nerwową</td>
<td valign="top">Sonda została uwięziona</td>
<td valign="top">W kroku 2 należy upewnić się, że wszystkie jamy zostały przebite za pomocą noża do mikrodisekcji lub mikrokapilary</td>
</tr>
<tr>
<td valign="top">Zarodek uległ dezintegracji po hybrydyzacji (krok 3)</td>
<td valign="top">Zbyt długi czas inkubacji z Proteinazą K. Temperatura hybrydyzacji jest zbyt wysoka</td>
<td valign="top">Proteinaza K nie powinna być pozostawiona dłużej niż 1 mn (stadia 3+ i 4), 2 mn (stadia 5 do 7), 3 mn (stadia 8-10), 4 mn (stadia 11-13). Nie przeprowadzać hybrydyzacji w temperaturze To wyższej niż 65 o C</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Część 9: Reprezentatywne wyniki
Poniżej przedstawiono reprezentatywne zarodki: (A) Zarodek (stadium HH7) znakowany sondą DIG-Sox (niebieski) i sondą FITC-delta-1 (czerwony). (B) Zarodek (stadium HH8) znakowany sondą DIG-Pax6 (niebieski) i sondą FITC-Shh (czerwony). Nf, fałd neuronalny, anp, przednia płytka neuronalna, psm, mezoderma presomityczna, n, notochorda, nt, cewka neuronalna). Sondy otrzymane w prezencie z laboratoriów dr C. Tabina, dr M. Goulding, dr D. Henrique oraz dr J. Briscoe. <img src="/files/ftp_upload/old/904_2008_10_20_1/904_Figure-01.png" alt="Ekspresja genów rozwojowych, Sox2/Delta1 i Pax6/Shh, barwione przekroje tkanek, stadia embrionalne." width="303" height="300" data-altupdatedat="1787630408000">

<ol><li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. 406, 74-78 (2000).</li>
<li>Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+Cer-like+protein+Caronte+mediates+the+establishment+of+embryonic+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry.</a> Nature. 401, 243-251 (1999).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
<li>Kawakami, M., Nakanishi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+an+endogenous+PKA+inhibitor%2C+PKIalpha%2C+in+organizing+left-right+axis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation.</a> Development. 128, 2509-2515 (2001).</li>
<li>Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda dwukolorowej hybrydyzacji in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization) jest stosowana do określania przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji jednego lub dwóch wybranych genów. Zastosowania obejmują ocenę wzorców ekspresji nowych genów (np. 1,2), a także zmiany w ekspresji genów po oddziaływaniach czynnikami zewnętrznymi (manipulacje embrionalne 3, mikro-koraliki 4 oraz elektroporacja konstruktów RNA lub DNA 5).

<table><tbody><tr><td>Jaja</td><td>Zwierzę</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny inkubator Marsh</td><td>Narzędzie</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hybrydyzacji</td><td>Narzędzie</td><td>Hybaid</td><td>Micro-4</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik orbitalny Adams Nutator</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-062</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona (1)</td><td>Narzędzie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki precyzyjne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>Łyżeczka</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarna pipeta Pasteura</td><td></td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td></td></tr><tr><td>Rurka mikrokapilarna</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td>Wyciągnąć za pomocą pionowego wyciągacza mikrokapilar; stępić koniec precyzyjną pincetą</td></tr><tr><td>Nóż do mikrodysekcji</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>Użyć do nakłucia jam przed hybrydyzacją in situ</td></tr><tr><td>Szpilki Minuten, średnica 0.2mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Przechowywać szpilki razem za pomocą mieszadła magnetycznego;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikonowy elastomer, utwardzacz i baza</td><td>Odczynnik</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>Wymieszać 1 część utwardzacza i 9 części bazy; pozostawić na noc w 37°C</td></tr><tr><td>Diethylopirokarbonian (depc)</td><td>Odczynnik</td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>Dodać 1ml depc do 1l PBS; wstrząsnąć; autoklawować</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>Odczynnik</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5MG</td><td>Roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml w depc-H₂O w aliquotach 10µl. Przechowywać w -20°C.</td></tr><tr><td>Formamid, dejonizowany</td><td>Odczynnik</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>tRNA drożdżowa-25 mg</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15401-011</td><td>Roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml w depc-H₂O w aliquotach 125µl. Przechowywać w -20°C</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Roztwór zapasowy o stężeniu 50 mg/ml w depc-H₂O w aliquotach 100µl. Przechowywać w -20°C.</td></tr><tr><td>SSC x20 pH5.5</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V4261</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>PR-V4231</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Odczynnik</td><td>Fluka</td><td>63189</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#8211;hringer Blocking Reagent</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Stosować w stężeniu 2% w MABT. Aby przygotować, podgrzewać z MABT przez 20 min w 60°C. Można przygotować roztwór zapasowy i przechowywać w aliquotach 1-5 ml w 20°C.</td></tr><tr><td>Surowica owcza inaktywowana ciepłem</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>013-000-121</td><td>Rozpuścić w 10 ml H₂O; podgrzewać w 55°C przez 30 min. Alikwotować po 1ml, -20°C.</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, fragmenty Fab</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy NBT/BCIP</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-AP, fragmenty Fab</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>2M Tris</td><td>BP1759-500</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td><td>Odczynnik</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>1,2,3,4-tetrahydronaftalen</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429325-100ML</td><td>Pod wyciągiem (dygestorem)</td></tr></tbody></table>

podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Zarodek kurczaka jest cennym narzędziem w badaniach nad wczesnym rozwojem embrionalnym. Jego przezroczystość, dostępność i łatwość manipulacji sprawiają, że jest to idealny model do badania ekspresji genów podczas formowania się pączków mózgu, rurki neuralnej, somytów i serca. Niniejszy film prezentuje poszczególne etapy dwukolorowej hybrydyzacji in situ w preparatach całych (whole mount in situ hybridization). W pierwszej kolejności zarodek zostaje wyjęty z jaja i utrwalony w paraformaldehydzie. Następnie zarodek jest poddawany procedurom prehybrydyzacji. Kolejno przeprowadza się hybrydyzację zarodka z dwiema różnymi sondami: jedną sprzężoną z DIG, a drugą z FITC. Po nocnej hybrydyzacji zarodek inkubuje się z przeciwciałem sprzężonym z DIG. Następnie przeprowadza się reakcję barwną z substratem dla DIG, w wyniku której badany obszar przybiera kolor niebieski. Zarodek jest następnie inkubowany z przeciwciałem sprzężonym z FITC. Następnie przeprowadza się reakcję barwną dla FITC, w wyniku której badany obszar przybiera kolor czerwony. Na koniec zarodek zostaje utrwalony i przygotowany do fotografowania oraz cięcia na sekcje. Przedstawiono również przewodnik rozwiązywania problemów.

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Zarodek kurzęcia jest cennym narzędziem w badaniach nad wczesnym rozwojem embrionalnym. Jego przezroczystość, dostępność oraz łatwość manipulacji sprawiają, że jest on ...

Procedura ta rozpoczyna się od fiksacji, potraktowania embrionów metanolem oraz proteinazą K, a następnie następuje inkubacja przez noc z sondą jedną diggen in or dig i sondą drugą z izotiocyjanianem fluoresceiny lub ZI. Embriony inkubuje się z przeciwciałem anty-dig, po czym następuje reakcja barwna z alkaliczną fosfatazą dig. Aktywność zostaje dezaktywowana, a embriony poddane inkubacji.Po reakcji barwnej przeciwciał FSE embriony zostają utrwalone za pomocą Zi. Cześć, jestem Delphine z laboratorium Ricka Finnela w Center for Environmental and Genomic Medicine na Texas A&amp;M University w Houston. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeprowadzania dwukolorowej hybrydyzacji in situ w embrionie kurczaka.Stosujemy tę procedurę w laboratorium do analizy wpływu leków przeciwpadaczkowych na geny żołądkowe i neuronalne. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby przeprowadzić hybrydyzację in situ w embrionach kurcząt, należy najpierw otworzyć jajo, stukając w skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty. Usuwamy grubą albuminę pęsetą, a następnie, używając nożyczek precyzyjnych, odchylamy worek żółtkowy pęsetą grubą tak, aby embrion był skierowany ku górze.Wytnij kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu

double-whole-mount-in-situ-hybridization-of-early-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podwójne hybrydyzacja in situ z zastosowaniem pełnych preparatów wczesnych zarodków kurcząt

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

W niniejszym filmie zaprezentowano immunohistochemię w preparatach całych (whole mount immunohistochemistry), czyli metodę pozwalającą na wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji antygenu w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.

Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.

Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy

Naucz się podwójnej hybrydyzacji in situ w zarodkach kurczaka, aby wizualizować wzorce ekspresji dwóch genów jednocześnie. Ta metoda pozwala badaczom analizować interakcje genów w rozwoju zarodkowym.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Przeglądaj więcej filmów