Name: Przygotowanie kultur narządów grasicy poddanych działaniu 2-dGuo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj technikę przygotowania kultur narządów grasicy płodowej myszy z zastosowaniem 2-dGuo do selektywnej eliminacji komórek limfoidalnych. Metoda umożliwia badanie rozwoju limfocytów T i interakji ze strumieniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Więcej informacji na temat przygotowania hodowli organowych grasicy ex vivo można znaleźć na stronie <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dguo

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

W grasicy interakcje między rozwijającymi się prekursorami limfocytów T a komórkami zrębowymi, do których należą komórki nabłonka korowego i rdzeniowego, odgrywają kluczową rolę w powstawaniu funkcjonalnie kompetentnej puli limfocytów T. Jednak złożoność rozwoju limfocytów T w grasicy in vivo może ograniczać analizę poszczególnych komponentów komórkowych oraz konkretnych etapów rozwoju. Systemy hodowli in vitro stanowią łatwo dostępny sposób badania wielu złożonych procesów komórkowych. Systemy hodowli organowej grasicy są szeroko stosowanym podejściem do badania wewnątrzgrasiczowego rozwoju limfocytów T w określonych warunkach in vitro. Opisujemy tutaj system, w którym płaty embrionalnej grasicy mysiej mogą zostać pozbawione endogennych elementów krwiotwórczych poprzez wcześniejszą hodowlę organową w 2-dezoksyguanozynie, związku selektywnie toksycznego dla komórek krwiotwórczych. Technika ta, oprócz zapewnienia łatwo dostępnego źródła komórek zrębowych grasicy do badania roli mikrośrodowiska grasiczego w rozwoju i selekcji limfocytów T, stanowi podstawę dla dalszych podejść eksperymentalnych, obejmujących m.in. rekonstrukcję alymfoidalnych płatów grasicy in vitro z określonymi elementami krwiotwórczymi, transplantację alymfoidalnej grasicy do myszy biorców oraz tworzenie reaggregowanych hodowli organowych grasicy. (Artykuł ten opiera się na pracy po raz pierwszy opisanej w Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380, strony 185-196).

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo.

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

W grasicy interakcje między rozwijającymi się prekursorami limfocytów T a komórkami stromy, w tym komórkami nabłonkowymi korowymi i rdzeniowymi, odgrywają znaną rolę w...

Witajcie, jestem Will Jenkinsson z grupy Grahama Andersona i Erica Jenkinsona z MRC Center for Immune Regulation na Uniwersytecie w Birmingham. Dzisiaj zaprezentuję technikę przygotowania płodowych kultur organowych grasicy. Dodatkowo pokażę, jak traktować te kultury organowe dwutlenoksazyną.Jest to substancja wykazująca selektywną toksyczność wobec komórek limfoidalnych w hodowli organowej. Technika ta znajduje wiele zastosowań w laboratorium. Jednym z nich jest wytwarzanie rezagregowanych hodowli organowych.Inne zastosowania obejmują badanie różnych etapów rozwoju komórek, a wykorzystując hodowle organowe grasicy płodowej, jesteśmy w stanie dodawać odczynniki hamujące lub stymulujące poszczególne szlaki, co pozwala nam badać rolę konkretnych cząsteczek w tym procesie. Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w przygotowaniu hodowli organowych grasicy jest pobranie embrionów myszy z 14. lub 15. dnia rozwoju od jednej lub dwóch ciężarnych samic.Najpierw spryskaj uśpioną mysz 70% ethanol. Następnie za pomocą pęsety odciągnij futro i wykonaj nożyczkami nacięcie w kształcie litery V w obszarze brzusznym, zaczynając od pęcherza i prowadząc w górę wzdłuż obu rogów macicy. Wyjmij róg macicy i umieść go w sterylnym 10 centymetrowym naczyniu Petri.Przetnij ścianę macicy wzdłuż jej długości i wyjmij embriony wraz z workami owodniowymi. Umyj je w szalce Petriego zawierającej 10 ml PBS, używając dwóch par precyzyjnych pincet. Ostrożnie rozerwij worek owodniowy i oddziel embrion od worka oraz łożyska.Następnie przenieś embriony do nowej szalki Petriego zawierającej 10 ml mieszaniny PBS z RPMI 1640 w stosunku 50:50. W medium z 10% FCS, pod mikroskopem stereoskopowym, przy zanurzonym w medium embrionie, przeprowadź dekapitację embriona za pomocą pęsety. Otwórz przednią powierzchnię ściany klatki piersiowej, wprowadzając końcówki zamkniętej pęsety do jam klatki piersiowej, a następnie rozewrzyj pęsetę, aby odsłonić jamę klatki piersiowej.Usunąć cały układ klatki piersiowej, serce, płuca, tchawicę i grasicę, delikatnie chwytając poniżej serca, a następnie umieścić je w naczyniu o średnicy 35 mm zawierającym 5 ml pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS w zarodku z 14. lub 15. dnia. Pierwotne płaty grasicy znajdują się tuż nad sercem, po obu stronach tchawicy.Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń poszczególne płaty grasicy, a następnie usuń nadmiar tkanki łącznej oraz wszelką przywarte krew przed przeniesieniem do hodowli organowej. Obecnie próbka jest gotowa do hodowli organowej. Aby przygotować detoks limfoidalny, pobierz roztwór stokowy 2-deoksyglukozy o stężeniu 9 mM i nanieś 600 µL do 90 mm plastikowej szalki Petriego do hodowli bakteryjnych.Dodaj 4 ml podgrzanego wcześniej medium DMEM i zakręć naczyniem, aby cała powierzchnia została pokryta medium. Oczywiście, jeśli chcesz uzyskać kultury limfoidalne do badania rozwoju limfocytów T, usuń dwie dioxazyny za pomocą pęsety. Umieść w naczyniu dwa sterylne kawałki owinięcia art, gąbki, docięte do rozmiaru 1 cm².Pozostaw gąbkę w medium przez około 30 sekund, aby nasiąkła. Następnie odwróć gąbkę, aby zwilżyć obie jej strony. Używając ponownie pęsety, upewnij się, że medium w naczyniu ma dostęp do tkanki.Na powierzchni każdej gąbki umieść wcześniej wysterylizowany filtr o rozmiarze porów 0,8 µm. Filtry należy kłaść błyszczącą stroną do góry na podkładkach z gąbki, aby przenieść płaty grasicy na filtr do hodowli organów. Do wykonania pipet szklanych zaleca się użycie szklanej pipety kontrolnej. Ogrzewaj szklaną rurkę w płomieniu palnika Bunsena, a gdy szkło stanie się plastyczne, wyjmij je z ognia i pociągnij za oba końce, aby rozciągnąć rurkę do długości nieprzekraczającej 10 cm, a następnie pozostaw szkło do ostygnięcia.Następnie pociągnij za oba końce, aby przełamać szkło. W ten sposób powstaną dwie zwężające się szklane pipety. Cienka część każdej z nich ma około pięciu centymetrów długości, a końcówka ma średnicę około 0,5 mm.Aby przygotować zestaw do pipetowania, w drugim końcu rurki umieść plastikowy końcówkę do pipety jako ustnik, a tępy koniec pipety szklanej włóż do rurki. Ostrożnie pobieraj poszczególne płaty grasicy za pomocą pipety ustnej i umieszczaj je na powierzchni filtra o porach 0,8 µm. W przypadku hodowli organów zaleca się umieszczenie od pięciu do sześciu płatów grasicy na każdym filtrze, co daje łącznie od 10 do 12 płatów grasicy na szalkę.Zapewnia to wystarczającą przestrzeń do wzrostu kultur organów i pozwala dwóm doksynom na wyeliminowanie wszystkich endogennych komórek limfatycznych. Po przygotowaniu kultur należy złożyć pokrywkę skrzynki typu „sandwich”, wykorzystując pokrywkę od 10 centymetrowej szalki Petriego jako platformę, a pod poziomem platformy umieścić wodę dwukrotnie destylowaną. Do skrzynki należy włożyć do trzech szalek, a następnie uszczelnić pokrywkę skrzynki za pomocą taśmy.W pokrywce powinny znajdować się dwa otwory powietrzne o średnicy 5 mm, wywiercone w przeciwległych narożnikach. Pudełka należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na okres od pięciu do siedmiu dni, po czym kultury te zostaną rozproszone, a następnie ponownie zagregowane w celuybadania oddziaływań w obrębie niszy zrazikowej grasicy w kontrolowanym środowisku trójwymiarowym. Po okresie hodowli, zazwyczaj wynoszącym od pięciu do siedmiu dni, fragmenty grasicy (F talks) pobiera się poprzez zanurzenie filtrów w medium i delikatne odpychanie płatów za pomocą pęsety. Można zauważyć, że limfoidalne F talks są zazwyczaj mniejsze i torbielowate w porównaniu do płatów limfoidalnych niepoddanych działaniu dioxazine.Właśnie przedstawiłem technikę przygotowania kultur organowych grasicy płodowej. W niniejszym protokole pokazaliśmy, jak traktować kultury organowe grasicy płodowej dwozyną, co prowadzi do usunięcia wszystkich komórek limfoidalnych, zazwyczaj po pięciu do siedmiu dniach hodowli grasicy. Wykorzystujemy te kultury organowe do wytwarzania reaggregowanych kultur organowych.Nie jest to jednak jedyna technika. Stosujemy również niepoddane działaniu dioksazyny hodowle organowe grasicy płodowej w celu ich transferu pod torebkę nerki myszy z grasicą. Ponadto wykorzystujemy limfoidalne hodowle organowe grasicy płodowej do badania rozwoju limfocytów T w kontrolowanych warunkach in vitro, które są wolne od wszelkich efektów wtórnych mogących wystąpić in vivo.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie kultur narządów grasicy poddanych działaniu 2-dGuo

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie kultur reaggregatów grasicy traktowanych 2-dGuo.

Reagregacja kultur grasicy

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Ten film demonstruje protokół generowania funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu z niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC za pomocą trójwymiarowego systemu hodowli grasicy. Jednoczesna hodowla niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC z endogennymi płatami grasicy płodowymi myszy zubożonymi w limfocyty spowodowała pomyślne dojrzewanie limfocytów T do utworzenia emigrantów grasicy pochodzących z iPSC CD8αβ + + MHC klasy I + (iTE).

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania emigrantów grasicy pochodzących od iPSC

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Opisujemy przygotowanie wycinków grasicy, które w połączeniu z cytometrią przepływową mogą być użyte do modelowania pozytywnej i negatywnej selekcji rozwijających się limfocytów T. Plastry grasicy można również przystosować do analizy in situ migracji, lokalizacji i sygnalizacji tymocytów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii dwufotonowej.

Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Oferujemy prostą i skuteczną metodę przeszczepiania grasicy leczonej 2'-deoksyguanozyną E18.5 do torebki nerkowej nagiej myszy. Metoda ta powinna pomóc w badaniu zarówno funkcji komórek nabłonka grasicy, jak i dojrzewania limfocytów T.

Podtorebkowe przeszczepienie nerki mysiej grasicy embrionalnej leczonej 2'-deoksyguanozyną u nagich myszy

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

Poznaj technikę przygotowania kultur narządów grasicy płodowej myszy z zastosowaniem 2-dGuo do selektywnej eliminacji komórek limfoidalnych. Metoda umożliwia badanie rozwoju limfocytów T i interakji ze strumieniem.

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Przeglądaj więcej filmów