Obrazowanie limfocytów T pamięci efektorowej w uchu po indukcji adoptywnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej

Witajcie, nazywam się Melanie Matthew. Jestem doktorantką w laboratorium Micah Hollinsa na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, w Katedrze Fizjologii i Biofizyki. Dzisiaj, wspólnie z dr Christine Beaton, pokażemy Państwu, w jaki sposób obrazujemy populację odpowiadających efektorowych lub pamięciowych limfocytów T w uchu szczura.

Dr Christine Beaton wywoła najpierw nadwrażliwość opóźnioną DTH w uchu szczura. Następnie przejdziemy do obrazowania in situ ucha szczura za pomocą dwufotonowej mikroskopii. Dwa dni temu wstrzyknęłam do szczura Lewis w obszar hiperto znakowane GFP albuminowo-specyficzne limfocyty T.

Dzisiaj poddam tego samego szczura działaniu bodźca w uchu. W prawe ucho wstrzyknę albuminę, a w lewe ucho wstrzyknę jedynie PBS.

Dawka wstrzykiwanej albuminy wynosi 20 µg w 20 µL. Stosowana albumina jest mieszanką w stosunku jeden do jednego albuminy znakowanej Texas Red oraz albuminy nieznakowanej. To jest odpowiednia strona, na której pokażę sposób wstrzykiwania.

Używam lewej ręki, ponieważ jestem praworęczny. Zdjąłem rękawiczkę z lewej ręki, aby móc umieścić jeden palec pod uchem, a drugi nad nim, w celu rozciągnięcia skóry; pozwala mi to dokładnie widzieć położenie igły i wprowadzić ją pomiędzy dwie warstwy skóry w obszarze powietrznym, który jest bardzo cienki. W tym celu stosuję igły o rozmiarze 27 G, aby dysponować narzędziem niezwykle cienkim, które można tam wprowadzić.

Zatem jeśli obrócę go, wyraźnie widać, gdzie podano Texas red, a gdzie PBS. Jesteśmy obecnie w 42. godzinie po wyzwaniu i użyję mikrometru z dociskiem sprężynowym do pomiaru grubości ucha. Zmierzę oba uszy: prawe, które zostało poddane wyzwaniu albuminą, oraz lewe, które nie było poddane wyzwaniu. Różnica w grubości ucha pozwoli nam ocenić intensywność stanu zapalnego.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 lub 58 lub 57 lub 57. A drugie ucho 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Cześć. Christine Beaton właśnie przekazała nam szczura, którego usunęła po pomiarze odpowiedzi DTH.

Przetransportowaliśmy je tutaj w lodzie. Jest to lewe ucho szczura. Znajdujemy się teraz w laboratorium Iana Parkera, aby przeprowadzić mikroskopię dwufotonową.

Przygotuję te uszy do obrazowania dwufotonowego in situ. Przygotuję jedno z uszu szczura w jego podstawie. Tkanka jest tam znacznie grubsza i wystają włoski, które mogłyby utrudnić pracę, gdybym zaczął po prostu przecinać tkankę.

W pierwszej kolejności odetnę część włosów. Delikatnie przytrzymuję ucho. Trzymanie tkanki między kciukiem a palcem wskazującym znacznie ułatwia jej kontrolę.

Wolę tę metodę od używania pęsety, ponieważ przy pęsecie po prostu nie czuję tak łatwo, co dzieje się z tkanką, a zawsze obawiamy się jej uszkodzenia. Chcemy zatem czuć, co z nią robimy, dlatego po prostu wolę używać palców.

Jest to warstwa skóry właściwej odchodząca w tym miejscu w uchu szczura. Podczas przycinania włosów mogłem delikatnie usunąć fragmenty skóry właściwej, która po prostu się oddziela. W tym celu użyto bardzo małych nożyczek anatomicznych, konkretnie odpowiednich nożyczek zakrzywionych.

Należy unikać kłucia tkanki; można przesuwać się od podstawy ucha w górę, delikatnie wycinając część warstwy skóry. Do obrazowania nie potrzebujemy bardzo dużego okna. Ten obszar w tym miejscu będzie wystarczający, aby uzyskać dobre obrazy komórek naciekających tkankę.

Jak widać, u podstawy ucha oraz niemal w całej jego długości, aż do samego czubka, znajdują się nienaruszone naczynia krwionośne. Cały ten obszar będzie bardzo odpowiedni do obrazowania DTH. Przystępuję zatem do wycięcia odsłoniętego fragmentu tkanki, aby uzyskać niewielki kawałek, który będziemy mogli przykleić do stolika obrazującego.

Zatem wystarczy wykonać tutaj nacięcie i obrócić tkankę. Mogę uciąć w tym miejscu. Mamy teraz niewielki fragment tkanki, który możemy przygotować do obrazowania na naszym mikroskopie dwufotonowym.

Są to nierozbijalne plastikowe szkiełka nakrywkowe, które przycinamy do rozmiaru naszej tkanki. Następnie montujemy tkankę na tych szkiełkach, używając kleju Bet Bond. Następnie mocujemy te nierozbijalne plastikowe szkiełka nakrywkowe do naszego stolika do obrazowania in situ za pomocą smaru silikonowego.

Wezmę ten mały fragment tkanki ucha; ma on lekkie zakrzywienie, więc będę musiał go wyprostować podczas przyklejania. Nie jest to idealne, ale zadziała. Należy wziąć jedno z takich szkiełek nakrywkowych i odciąć fragment, szacunkowo dopasowując go do rozmiaru ucha i wycinając kawałek nieco większy, niż wydaje się to być konieczne.

Aby przymocować tkankę do szkiełka cover slip, stosujemy bezpieczny dla tkanek superklej marki Betlong firmy 3M, nakładając kilka jego kropli na szkiełko.

Nie chcę użyć zbyt dużej ilości. Należy również upewnić się, że klej jest rozprowadzony równomiernie. Dlatego wezmę mały kawałek papieru do soczewek i za pomocą jego rogu naniosę klej na szkiełko nakrywkę.

Nałożę niewielką ilość dodatkowego kleju; gdy tylko ten klej zetknie się z wodą, utwardzi się. Należy zatem zachować szczególną ostrożność przy obchodzeniu się z próbką tkanki. Chwycę teraz narożnik tkanki, którego prawdopodobnie nie będziemy obrazować, ponieważ znajduje się on na zakrzywionej części.

Osuszę to tylko odrobinę. Spód, używając papieru do soczewek, aby wszystko było suche. Następnie dotknę krawędzią tej tkanki ucha szczura szkiełka nakrywkowe.

Powinno ono natychmiast zastygnąć w miejscach, których dotknąłem. Resztę po prostu lekko rozpłaszczę, delikatnie naciskając na krawędzie, abyśmy mogli uzyskać ładną ramkę do obrazowania.

W następnym kroku utwardzę klej, zanurzając go w medium. Aby zapobiec dostaniu się kleju na wierzch tkanki, odwracamy ją do góry dnem i powoli zanurzamy najpierw jednym rogiem w zbiorniku z medium; tkanka powinna zostać stabilnie przytwierdzona, co umożliwi obrazowanie w komorze do obrazowania tkanek. Teraz zamocujemy na stoliku przygotowany do obrazowania in situ fragment tkanki z piwa.

Oto nasz fragment tkanki z aplikowanym smarem silikonowym na spodzie; delikatnie umieszczamy go w strumieniu medium. Smar silikonowy powoduje, że tkanka przylega do dna stolika. Uruchamiamy przepływ medium, umieszczając sondę temperatury bezpośrednio obok niego.

A teraz skupimy się na obrazie. Włączę zatem naszą lampę skupiającą, nowe źródło światła, nasze jasne oświetlenie. Następnie wezmę obiektyw 20 x i opuszczę go do komory.

Upewnij się, że nie dotyka tkanki. Spójrz przez okular i ustaw ostrość na tkankę ucha. I oto ona.

Tutaj widoczne są autofluorescencyjne zielone mieszki włosowe w warstwie skóry właściwej ucha szczura. Mieszki włosowe te są otoczone gęstą warstwą kolagenu. Jest to warstwa, którą usuwamy w celu obrazowania fotonowego efektorowych komórek pamięci T.

Autofluorescencyjne mieszki włosowe oraz jasny kolagen górnej warstwy skóry właściwej będą przesłaniać obraz. Tutaj widać, że komórki APC pochłonęły volin sprzężony z Texas Red i znajdują się wzdłuż tych niebieskich włókien kolagenowych. Włókna kolagenowe są niebieskie dzięki generacji drugiej harmonicznej, którą uzyskujemy w obrazowaniu fotonowym wzdłuż włókien kolagenowych.

Posiadamy wysoce ruchliwe limfocyty T. Przesuwają się one w górę i w dół włókien kolagenowych i wchodzą w interakcje z komórkami APC. W tym filmie zobaczyli Państwo, jak dr Christine Beaton indukuje adoptywną reakcję DTH u szczura rasy Lewis.

Następnie zaprezentowaliśmy przygotowanie ucha do obrazowania, responsywne komórki T pamięci efektorowej, ucho szczura oraz zastosowane techniki dwufotonowe.