Name: Obrazowanie efektorowych limfocytów T pamięci w uchu po indukcji adoptywnego DTH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę obrazowania efektorowych limfocytów T pamięci w uchu szczura po indukcji adoptywnego DTH przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki komórek T in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Indukcja adopcyjnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej (DTH)
Prosimy o zapoznanie się z artykułem JoVE: <a href="https://www.jove.com/video/325">Indukcja i monitorowanie adoptacyjnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów</a> Christine Beeton, George K. Chandy Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine J. Visualized Experiments, Wydanie 8
W niniejszym przypadku zmodyfikowaliśmy ten protokół, stosując antygen (owalbuminę) sprzężony z Texas-Red w stosunku 1:1 z nieznakowanym antygenem, aby umożliwić wizualizację fagocytujących komórek prezentujących antygen.
Pobieranie tkanki ucha
<ol>
<li>Uśmierć szczura w wybranym punkcie czasowym zgodnie z procedurami opisanymi w zatwierdzonym protokole dotyczącym zwierząt. W tej metodzie stosujemy przedawkowanie środka anestetycznego, izofluranu. Zabieg ten wykonuje się w zamkniętym pojemniku umieszczonym w dobrze wentylowanym wyciągu. Potwierdź śmierć zwierzęcia poprzez dekapitację lub otwarcie klatki piersiowej i przecięcie serca. </li>
<li>Używając dużych nożyczek, usuń ucho jednym cięciem, jak najbliżej ciała zwierzęcia (Rycina 1). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Schemat wstrzykiwania do ucha myszy; zaznaczone miejsce wstrzyknięcia; procedura usuwania ucha." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_1.jpg"> Rycina 1. Usuwanie ucha szczura </li>
<li>Umieść ucho w probówce stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej ~10 ml lodowatego 1x PBS lub RPMI-1640. Przechowuj próbki tkanki na lodzie do momentu przygotowania tkanki do obrazowania. </li>
<li>Wykonaj obrazowanie tkanki jak najszybciej; stwierdziliśmy jednak, że przechowywanie na lodzie przez 1 do 2 godzin nie wywiera zauważalnego wpływu na ruchliwość komórek w tkance w porównaniu do tkanki pobranej i obrazowanej natychmiast.</li>
</ol>
Przygotowanie tkanek do obrazowania
I. Usunięcie warstwy naskórka i skóry właściwej
*Uwaga: Głęboka warstwa skóry właściwej musi pozostać nienaruszona. Przy prawidłowym wykonaniu duże naczynia krwionośne nie zostaną uszkodzone, a chrząstka ucha nie zostanie odsłonięta. Jest to trudna technika, zwłaszcza w przypadku braku stanu zapalnego (warunki kontrolne), dlatego pomocne jest użycie mikroskopu sekcyjnego.
<ol>
<li>Przenieść zarówno tkankę, jak i podłoże z probówki stożkowej do 10 cm naczynia hodowlanego. </li>
<li>W rękawiczkach delikatnie przytrzymaj ucho szczura za jego końcówkę (część dystalna), stroną grzbietową skierowaną do góry (Rysunek 2). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Schemat wstrzykiwania u kota pokazujący miejsce wstrzyknięcia i przycinanie w celu bezpiecznego podania." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_2.jpg"> Rysunek 2. Przycinanie futra z ucha </li>
<li>Kciukiem opierając się na górnej części ucha, unieruchom tkankę, a następnie za pomocą czubka zamkniętych nożyczek Dumont #5 oddziel skórę właściwą od głębokiej warstwy skóry właściwej. Alternatywnie, jeśli krawędź ucha posiada nawis skóry/głębokiej skóry właściwej, można go uchwycić pęsetą i delikatnie odciągnąć, aby oddzielić go od tkanki znajdującej się poniżej (Rysunek 3). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Schemat dyssekcji skóry właściwej; miejsce wstrzyknięcia, rozpoczęcie usuwania skóry właściwej, oddzielanie skóry właściwej od tkanki." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_3.jpg"> Rysunek 3. Usuwanie górnej warstwy skóry właściwej </li>
<li>Po oddzieleniu niewielkiego obszaru skóry od tkanki podścielającej, powtarzaj kroki separacji, naprzemiennie używając nożyczek do rozcinania warstw skóry właściwej oraz pęsety do delikatnego usuwania i odwarstwiania oddzielonej skóry. </li>
<li>Odsłoń obszar tkanki ucha o wymiarach 5 x 5 mm lub większy, znajdujący się w odległości co najmniej 3 mm od początkowego miejsca wstrzyknięcia antygenu (Rysunek 4). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Przygotowanie tkanki do mikroskopii, schemat przedstawia próbkę wyciętą w kwadrat 5 mm do badania obrazowego." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_4.jpg"> Rysunek 4. Tkanka odsłonięta do obrazowania </li>
</ol>
II. Mocowanie tkanki do stolika obrazującego
<ol>
<li>Dotnij plastikową kasetkę do rozmiaru nieco większego niż przygotowana tkanka. </li>
<li>Rozprowadź cienką warstwę bezpiecznego dla tkanek kleju 3M Vetbond™ na szkiełku. </li>
<li>Chwyć róg przygotowanej tkanki (w miejscu, którego prawdopodobnie nie będziesz obrazować), wyjmij ją z medium i osusz spód tkanki za pomocą papieru soczewkowego lub chusteczki Kym wipe, aby usunąć nadmiar medium. </li>
<li>Dotknij krawędzi tkanki szkiełka pokrytego klejem (Vetbond utwardza się natychmiastowo w kontakcie z mokrą tkanką). Delikatnie rozprostuj tkankę na płasko, tak aby przeciwny koniec dotknął szkiełka jako ostatni (Rysunek 5) <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Montaż tkanki na kasetce z Vetbond; schemat ilustrujący proces montażu z etykietami krok po kroku." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_5.jpg"> Rysunek 5. Montaż tkanki do kasetki </li>
<li>Utwardź Vetbond™, odwracając próbkę tkanki/szkiełko i zanurzając je w zbiorniku z medium w taki sposób, aby tkanka i szkiełko znajdowały się stroną skierowaną w dół pod kątem około 45 stopni. Trzymanie tkanki do góry nogami pod kątem pomaga zapobiec utwardzaniu się nadmiaru kleju na odsłoniętej powierzchni tkanki. Klej na powierzchni tkanki zablokuje laser (Rysunek 6). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Kąt styku ok. 45 stopni na powierzchni cieczy, schemat ilustrujący koncepcję dynamiki płynów." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure_6.jpg"> Rysunek 6. Utwardzanie kleju do tkanek Vetbond poprzez zanurzenie w medium Uwaga: Opanowanie kroków 2-5 może wymagać pewnej wprawy. Przed pierwszą próbą warto poćwiczyć na odrzuconych lub dodatkowych fragmentach tkanki. </li>
<li>Nałóż niewielką ilość smaru silikonowego na spód szkiełka. </li>
<li>Umieść szkiełko w komorze perfuzyjnej. Przed dodaniem tkanki upewnij się, że medium perfuzyjne przepływa, ma temperaturę 37°C i jest natlenione. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka, tworząc uszczelnienie ze smarem silikonowym między dnem komory perfuzyjnej a plastikową kasetką.</li>
</ol>
III. Obrazowanie dwufotonowe
<ol>
<li>Korzystając z przeświecania w świetle jasnym, ustaw ostrość na górnej powierzchni tkanki. Wyłącz wszystkie źródła światła. </li>
<li>Włącz laser oraz PMT-y, zgodnie z wymogami systemu mikroskopu wielofotonowego. </li>
<li>Generacja drugiej harmonicznej (SHG) w silnie uporządkowanych białkach włóknistych (kolagenie i miozynie) wytwarza sygnał o połowie długości fali lasera wzbudzającego. Stosujemy wzbudzenie przy 900 nM, co prowadzi do powstania SHG przy 450 nm, którą można wizualizować za pomocą „niebieskiego” kanału mikroskopu. Generacja SHG jest procesem nieliniowym (dwufotonowym), co zapewnia efekt optycznego „przekroju” podobny do dwufotonowego wzbudzenia fluorescencji. Maksymalna wydajność SHG występuje, gdy włókna są prostopadłe do wiązki lasera, natomiast włókna biegnące równolegle nie będą widoczne1. </li>
<li>Zlokalizuj odpowiedni obszar do obrazowania z dużą liczbą komórek; ustaw pole akwizycji tak, aby większość komórek znajdowała się w centrum, a następnie rozpocznij obrazowanie. Uwaga: w reakcjach DTH limfocyty T oraz inne nacieki komórkowe są często skoncentrowane w jednym miejscu, podczas gdy inne obszary są pozbawione komórek naciekających2. W związku z tym przeszukiwanie tkanki w celu znalezienia najlepszego obszaru do obrazowania może zająć trochę czasu. </li>
<li>Sprawdź żywotność komórek, oceniając ich prędkość i polarność podczas obrazowania. Używaj najniższej mocy lasera, która zapewnia akceptowalną jakość obrazu, aby zminimalizować fotouszkodzenia. </li>
<li>W razie potrzeby wymień preparat tkanki na nowy.</li>
</ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

obrazowanie limfocytów t pamięci efektorowej w uchu po indukcji adoptywnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) to reakcja immunologiczna, w której główną rolę odgrywają efektorowe i pamięciowe limfocyty T CCR7-. W niniejszym materiale prezentujemy metodę indukowania i rejestrowania przebiegu reakcji DTH w uchu szczura. Następnie przedstawiamy sposób przygotowania tkanki ucha szczura do obrazowania dwufotonowego odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T CCR7-.
Adaptacyjną reakcję nadwrażliwości opóźnionej (DTH) indukuje się poprzez doszpikowe wstrzyknięcie znakowanej GFP linii efektorowych/pamięciowych limfocytów T specyficznych dla Ova i CCR7- (Beeton, C J. Visualized Experiments, Issue 8). Następnie pozostawia się komórki na 48 godzin w organizmie szczura w celu ich equilibracji, po czym przeprowadza się próbę prowokacyjną, wstrzykując do jednego ucha sól fizjologiczną (ucho kontrolne), a do drugiego mieszaninę Ova oraz Ova skoniugowanego z Texas-Red (Ova-TR) w stosunku 1:1, co umożliwia wizualizację rezydentnych komórek prezentujących antygen.
Opisujemy metodę przygotowania tkanki przydatną do obrazowania ruchliwości komórek w głębokiej warstwie skóry właściwej podczas odpowiedzi immunologicznej, w połączeniu z wizualizacją włókien kolagenu za pomocą generacji drugiej harmonicznej. Tkanka ucha jest wycinana w kwadraty o wymiarach 5 x 5 mm (lepiej, jeśli są nieco większe) i montowana na plastikowych szkiełkach nakrywkowych za pomocą Vetbond™, które następnie są mocowane smarem silikonowym w komorze obrazującej i przepłukiwane pożywką hodowlaną nasyconą tlenem w temperaturze 37°C.

W niniejszym materiale prezentujemy metodę indukowania oraz rejestrowania przebiegu reakcji nadwrażliwości opóźnionej (DTH) w uchu szczura. Następnie demonstrujemy przygotowanie tkanki ucha szczura do obrazowania dwufotonowego odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T.

Obrazowanie limfocytów T pamięci efektorowej w uchu po indukcji adoptywnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) to reakcja immunologiczna, w której główną rolę odgrywają CCR7- efektorowe limfocyty T pamięci. W niniejszej pracy demonstrujemy...

Witajcie, nazywam się Melanie Matthew. Jestem doktorantką w laboratorium Micah Hollinsa na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, w Katedrze Fizjologii i Biofizyki. Dzisiaj, wspólnie z dr Christine Beaton, pokażemy Państwu, w jaki sposób obrazujemy populację odpowiadających efektorowych lub pamięciowych limfocytów T w uchu szczura.Dr Christine Beaton wywoła najpierw nadwrażliwość opóźnioną DTH w uchu szczura. Następnie przejdziemy do obrazowania in situ ucha szczura za pomocą dwufotonowej mikroskopii. Dwa dni temu wstrzyknęłam do szczura Lewis w obszar hiperto znakowane GFP albuminowo-specyficzne limfocyty T.Dzisiaj poddam tego samego szczura działaniu bodźca w uchu. W prawe ucho wstrzyknę albuminę, a w lewe ucho wstrzyknę jedynie PBS.Dawka wstrzykiwanej albuminy wynosi 20 µg w 20 µL. Stosowana albumina jest mieszanką w stosunku jeden do jednego albuminy znakowanej Texas Red oraz albuminy nieznakowanej. To jest odpowiednia strona, na której pokażę sposób wstrzykiwania.Używam lewej ręki, ponieważ jestem praworęczny. Zdjąłem rękawiczkę z lewej ręki, aby móc umieścić jeden palec pod uchem, a drugi nad nim, w celu rozciągnięcia skóry; pozwala mi to dokładnie widzieć położenie igły i wp

imaging-effector-memory-t-cells-ear-after-induction-adoptive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie efektorowych limfocytów T pamięci w uchu po indukcji adoptywnego DTH

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez CCR7-efektorowe limfocyty T pamięci. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak indukować aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) wykazujące ekspresję CCR7. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak aktywować swoiste dla antygenu komórki TEM, indukować adopcyjną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ten raport opisuje metodę wywoływania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewisa poprzez immunizację emulsją ekstraktu z gruczołu łzowego szczura, albuminy jaja kurzego i kompletnego adiuwantu Freunda, a następnie wstrzyknięcie ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych sześć tygodni później.

Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) to mysi eksperymentalny model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD). CHS opiera się na uczuleniu na reaktywny hapten poprzez malowanie ogolonej skóry klatki piersiowej i brzucha, a następnie prowokację skóry ucha rozcieńczonym haptenem, powodując reakcję obrzęku, która jest oceniana na różne sposoby.

Nadwrażliwość kontaktowa jako mysi model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Poznaj metodę obrazowania efektorowych limfocytów T pamięci w uchu szczura po indukcji adoptywnego DTH przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki komórek T in vivo.

Obrazowanie limfocytów T pamięci efektorowej w uchu po indukcji adoptywnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej

Przeglądaj więcej filmów