Obrazowanie efektorowych limfocytów T pamięci w uchu po indukcji adoptywnego DTH

Cześć, nazywam się Melanie Matthew. Jestem studentem studiów magisterskich w laboratorium Micah Hollinsa na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine na Wydziale Fizjologii i Biofizyki. A dzisiaj, razem z dr Christine Beaton, pokażemy wam, jak wyobrażamy sobie efekt odpowiedzi lub populację komórek T pamięci w uchu szczura.

Dr Christine Beaton najpierw wywoła nadwrażliwość typu opóźnionego w uchu szczura. A potem przejdziemy do obrazowania in situ ucha szczura za pomocą dwóch mikroskopów fotograficznych. Dwa dni temu wstrzyknąłem GFP oznaczone albuminą specyficznych dla limfocytów T w hiper do Lewisa.

A dzisiaj zamierzam rzucić wyzwanie temu samemu szczurowi w ucho. Więc do prawego ucha zamierzam wstrzyknąć albuminę. A w lewe ucho zamierzam wstrzyknąć trochę PBS.

Dawka albuminy, którą wstrzykuję, to 20 mikrogramów w 20 mikrolitrach. A albumina, której używam, jest mieszaniną jeden do jednego z Texas Red, oznaczoną albuminą i nieoznaczoną albuminą. Więc to jest po prawej, na której zamierzam pokazać ci, jak zamierzam wstrzykiwać.

Więc mam lewą rękę, jestem praworęczny. Więc lewą ręką zdjąłem rękawiczkę, aby móc włożyć jeden palec pod ucho, a drugi powyżej, aby rozciągnąć skórę tak, że mogłem dokładnie zobaczyć, gdzie jestem z igłą i wejść między dwie warstwy skóry w powietrzu, która jest bardzo cienka. Więc do tego używam igieł o rozmiarze 27, aby mieć coś niezwykle cienkiego, co można tam włożyć.

Więc jeśli to odwrócę, na pewno zobaczycie, gdzie poszła czerwień z Teksasu i gdzie poszła PBS. Tak więc jesteśmy teraz 42 godziny po wyzwaniu tutaj i zamierzam użyć mikrometru sprężynowego do zmierzenia grubości ucha. Zmierzę więc oba uszy, prawe ucho, które zostało zainfekowane albuminą i lewe ucho, które nie zostało zakwestionowane, a różnica w grubości da nam wyobrażenie o intensywności stanu zapalnego.

Och, 62 0 60 0 61, 0 60 lub 58 lub 57 lub 57. A drugie ucho 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Hi.So Christine Beaton właśnie dała nam szczura, którego usunęła po zmierzeniu odpowiedzi DTH.

Przetransportowaliśmy je tutaj na lodzie. To jest lewe ucho szczura. Jesteśmy teraz w laboratorium Iana Parkera i przeprowadzamy badania mikroskopią fotonową.

Zamierzam więc przygotować te uszy do obrazowania in situ dwoma fotonami. Więc zamierzam przygotować jedno z uszu szczura tutaj, u podstawy ucha. Tkanka jest o wiele grubsza i mamy trochę wystających włosów, które będą trochę niechlujne, jeśli po prostu zacznę w nie wcinać.

Więc pierwszą rzeczą, którą zamierzam zrobić, to po prostu obciąć trochę tych włosów. Po prostu delikatnie trzymam się za ucho. Mój palec znacznie ułatwia kontrolowanie tkanki, gdy trzymasz ją między kciukiem a palcem wskazującym.

Wolę to niż używanie kleszczy, ponieważ kleszcze, po prostu, po prostu nie czuję tak łatwo, co robi tkanka i zawsze martwimy się o uszkodzenie tkanki. Chcemy więc móc poczuć, co z tym robimy. Więc po prostu lubię używać palców.

To jest warstwa skórna, która złuszcza się stąd w uchu szczura. Więc kiedy przycinałem część włosów, byłem w stanie delikatnie przyciąć niektóre z tych skór właściwych, które po prostu się złuszczały. Jest kilka bardzo małych nożyczek do preparowania, aby to zrobić, po prostu ładne zakrzywione nożyczki.

Nie chcesz dźgać tkanki i możesz przesuwać się w górę od podstawy ucha do góry, po prostu delikatnie odcinając część warstwy skórnej. Nie potrzebujemy więc bardzo dużego okna do obrazowania. Ten obszar w tym miejscu wystarczy, aby uzyskać kilka ładnych zdjęć komórek infiltrujących tkankę.

Jak więc widzicie, mamy kilka nienaruszonych naczyń krwionośnych wciąż u podstawy ucha i prawie aż do czubka ucha. Cały ten obszar będzie naprawdę dobry do obrazowania DTH. Więc zamierzam iść dalej i wyciąć ten kawałek tkanki, który odsłoniłem, aby stworzyć mały kawałek tkanki, który możemy przykleić do naszego etapu obrazowania.

Więc po prostu zrób tutaj cięcie, odwróć to. Mogę tu ciąć. Mamy ładny kawałek tkanki, który możemy przygotować na naszym dwufotonowym teleskopie do obrazowania.

Są to nietłukące się plastikowe szkiełka nakrywkowe, które przycinamy do rozmiaru naszej tkanki. A następnie montujemy na nich tkankę za pomocą wiązania zakładowego. A następnie zabezpieczamy te nietłukące się plastikowe szkiełka nakrywkowe za pomocą smaru silikonowego do naszego etapu obrazowania insitu.

Wezmę ten mały kawałek tkanki powietrznej, ma trochę krzywizny, więc będę musiał go spłaszczyć podczas przyklejania. Nie jest to idealne rozwiązanie, ale zadziała. Więc po prostu bierzesz jedno z tych szkiełek nakrywkowych i przycinasz je, szacujesz rozmiar swojego ucha i po prostu przycinasz trochę większe niż myślisz, że będzie.

Aby zamocować naszą chusteczkę na szkiełku nakrywkowym. Używamy bezpiecznego dla tkanek super kleju o nazwie bet long. Dostajemy go od 3M i po prostu nakładamy kilka kropel na nasze szkiełko nakrywkowe.

Nie chcę mieć za dużo. Chcesz też mieć pewność, że jest równomiernie rozłożony. Więc po prostu wezmę mały kawałek papieru do soczewek i użyję jego rogu, aby rozprowadzić klej na szkiełku okładkowym.

Idąc trochę w górę przy dodatkowym kleju i jak tylko ten klej dotknie wody, utwardzi się. Dlatego należy bardzo uważać na próbkę tkanki. Zamierzam więc uchwycić ten fragment tkanki, którego prawdopodobnie nie uda nam się sfotografować, ponieważ znajduje się na zakrzywionej części.

Zamierzam go trochę wysuszyć. Spód jest po prostu na papierze do soczewek, więc wszystko jest wysuszone. Dotknę jego rogu, tej tkanki do ucha szczura do szkiełka nakrywkowego.

I powinien natychmiast wyleczyć się w miejscu, w którym go dotknąłem. Resztę zamierzam tylko trochę spłaszczyć, delikatnie naciskając na krawędzie. Miejmy nadzieję, że uda nam się uzyskać ładną oprawę do obrazowania.

Więc teraz zamierzam utwardzić klej, zanurzając go w podłożu. Tak więc, aby klej nie dostał się na tkankę, odwracamy go do góry nogami i powoli zanurzamy go w jednym rogu najpierw w naszym zbiorniku pożywki i powinien być ładnie przyklejony i możemy go zobrazować w naszej komorze obrazowania w tkance. Teraz zamontujemy na scenie kawałek tkanki, który przygotowywaliśmy do obrazowania in situ, kawałek chusteczki piwnej.

Oto nasz kawałek chusteczki higienicznej z smarem silikonowym na spodzie, a my po prostu delikatnie umieszczamy go w strumieniu mediów. Teraz do dna sceny przykleił się smar silikonowy. Rozjaśnij przepływ mediów za pomocą naszej sondy temperatury tuż obok niego.

A teraz się skupimy. Włączę więc nasze skupienie, nowe światło, naszą jasną skórkę. Wezmę więc nasz obiektyw 20 x i opuszczę go do komory.

Upewnij się, że nie dotyka tkanki. Spójrz przez okular i skup się na naszej tkance ucha. I oto jest.

Tutaj widzisz autofluorescencyjne zielone mieszki włosowe w warstwie skórnej ucha szczura. Wokół tych mieszków włosowych znajduje się gęsta warstwa kolagenu. Jest to warstwa, którą usuwamy w celu obrazowania fotonów T komórek pamięci Fectora.

Autofluorescencyjne mieszki włosowe zasłaniają obraz, podobnie jak jasny kolagen górnej warstwy skóry właściwej. Okej, więc tutaj widzicie, że mamy APC, które wchłonęły teksańską czerwoną sprzężoną wolinę i są zagnieżdżone wzdłuż tych niebieskich włókien kolagenowych. Włókna kolagenowe są niebieskie ze względu na generowanie drugiej harmonicznej, którą otrzymujemy w obrazowaniu fotonów wzdłuż włókien kolagenowych.

Mamy bardzo ruchliwą komórkę komórkową. Pełzają w górę iw dół włókien kolagenowych i wchodzą w interakcje z APC. Więc w tym filmie widzieliście dr Christine Beaton, indukującą adopcyjne DTH u szczura Lewisa.

A potem pokazaliśmy wam nasze przygotowanie ucha do obrazowania, responsywne komórki pamięci efektorowej T oraz ucho szczura i nasze dwie techniki fotonowe, które to umożliwiają.