Izolacja jąder neuronalnych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej

Aby zbadać interakcje DNA chromatyny, które regulują ekspresję genów specyficznych dla neuronów w ludzkim mózgu, należy najpierw uzyskać czystą populację jąder neuronalnych, aby to zrobić. Pośmiertna ludzka tkanka mózgowa jest homogenizowana, a całkowite jądra są izolowane za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Następnie jądra są znakowane specyficznymi dla neuronów przeciwciałami wyizolowanymi za pomocą sortowania metrycznego przepływu, a na koniec zagęszczane za pomocą ultrawirowania.

Cześć, nazywam się Anish Matan i pracuję w laboratorium dr Sharon mc Barian na wydziale psychiatrii University of Massachusetts Medical School. Dzisiaj pokażę Wam procedurę izolacji jąder neuronalnych z pośmiertnej tkanki mózgowej człowieka. Więc zacznijmy.

Dla każdej próbki jąder, która ma być sortowana, zacznij od tysiąca miligramów zamrożonej pośmiertnej tkanki mózgowej. Przy takiej ilości można uzyskać około 5 milionów jąder neuronalnych po sortowaniu aktywowanym fluorescencją. Aby rozpocząć ekstrakcję jąder, umieść 250 miligramów tkanki mózgowej w puchu zawierającym pięć mililitrów buforu do lizy i umieść go na lodzie.

Gdy tkanka rozmrozi się, przez minutę na lodzie. Po upuszczeniu przenieś homogenizowaną tkankę do przezroczystej probówki ultrawirówki o grubości 15 mil, a następnie umieść probówkę na lodzie. Powtórzyć tę homogenizację dla pozostałej tkanki.

Następnie ostrożnie odpipetuj dziewięć mililitrów roztworu sacharozy na dno probówek ultrawirówek, aby ustawić gradient stężeń tak, aby homogenizowany roztwór tkankowy znalazł się na wierzchu roztworu sacharozy. Teraz zważ probówki ultrawirówkowe, aby upewnić się, że są zrównoważone podczas ultrawirowania. Dokonaj dowolnych korekt masy, dodając bufor do lizy do górnej warstwy Po zważeniu probówek umieścić je w ultrawirówce za pomocą próbek z ultrawirówki wirnika SW 28 o temperaturze RCF 107163.6 na 2,5 godziny w temperaturze czterech stopni.

Po zakończeniu wirowania należy odessać snat, a także warstwę zanieczyszczeń znajdujących się w gradiencie stężeń. Uważaj, aby nie naruszyć osadu na dnie probówki, która zawiera jądra. Następnie dodaj 500 mikrolitrów jednego XPBS do każdej granulki i pozostaw na lodzie na 20 minut.

Po 20 minutach resus zawiesić granulki, pipetując w górę iw dół. Inkubacja na lodzie pozwala granulkom trochę się rozpuścić, co ułatwia ponowne zawieszenie jąder, zmniejszając w ten sposób ilość naprężeń, jakich doświadczają jądra. Następnie przenieś zawiesinę resusu i jądra do dwóch probówek wirówkowych.

Połącz roztwór nukleinowy z dwóch ultra centowych probówek z każdą probówką mikrowirówki i ponownie umieść próbki na lodzie. Teraz, gdy ekstrakcja nukleinowa została zakończona, przejdę do etapu barwienia immunologicznego, aby w rzeczywistości wyizolować jądra neuronów, sortowanie próbki zawierającej jądra będzie inkubowane z mieszaniną do barwienia immunologicznego składającą się z przeciwciała pierwszorzędowego i wtórnego, a także ogniw blokujących, aby uzyskać mieszaninę barwienia immunologicznego w 1,2 mikrolitra nowego przeciwciała specyficznego dla neuronów N do 300 mikrolitrów jednego XPBS. Następnie dodaj sto mikrolitrów mieszanki blokującej, która zawiera 0,5% BS, A i 10% normalnej surowicy kodowej w jednym XPBS.

Na koniec dodaj jeden mikrolitr przeciwciała drugorzędowego o nazwie LOR 4 88. Przygotuj również barwienie immunologiczne dla ujemnej próbki kontrolnej dla tej mieszaniny barwienia immunologicznego. Wyklucz nowy koniec przeciwciała pierwotnego i zastąp go 1,2 mikrolitra jednego XPBS.

Teraz wiruj mieszaniny immunobarwiące i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, podczas gdy mieszaniny barwiące są inkubowane. Przygotować próbki jąder kontrolnych do ujemnej próbki kontrolnej Eloqua 20 mikrolitrów jąder o rozpiętości resus do probówki o grubości dwóch mil zawierającej 980 mikrolitrów jednego XPBS. Przygotować również niebarwioną kontrolę, która zawiera tylko roztwór jąder i PBS.

Teraz Eloqua 20 mikrolitrów jąder do innej probówki i zwiększ objętość z powrotem do jednego mila za pomocą jednego XPBS. Następnie umieść wszystkie próbki z powrotem na lodzie. Do tej pory mieszanki do barwienia immunologicznego są gotowe.

Podczas inkubacji dodać 401 mikrolitrów mieszaniny do odpowiedniej próbki. Do próbki jąder trafiła mieszanina zawierająca zarówno nowe, jak i LOR 4 88. W ujemnej próbie kontrolnej otrzymano mieszaninę zawierającą tylko przeciwciało drugorzędowe LOR 4 88, podczas gdy do niebarwionej próbki kontrolnej nie dodaje się barwienia immunologicznego.

Następnie przenieś próbki do coldronu i obracaj je w ciemności przez 45 minut. Teraz, po zakończeniu 45-minutowej inkubacji, przeniosę próbki do głównego obiektu cytometrii przepływowej University of Massachusetts Medical School, aby przeprowadzić sortowanie aktywowane fluorescencją Podczas transportu do głównego obiektu próbki powinny być przechowywane na lodzie i w ciemności. W centralnym zakładzie cytometrii przepływowej próbki są najpierw filtrowane przez filtr o średnicy 40 mikronów, a następnie przepuszczane przez przyrząd przez kilka minut, utrzymując je w niskiej temperaturze.

Odbywa się to w celu uzyskania wstępnych danych przed sortowaniem. Niebarwiona kontrola określa stopień ujemnej fluorescencji. Na podstawie tych informacji dostosuj czułość urządzenia na fluorescencję.

Zabarwiona kontrola służy do zwalczania grypy. Wszelkie szumy tła spowodowane brakiem fluorescencji w tym momencie ustawiają odpowiednie bramki wymagane do sortowania. Do sortowania próbek używa się kilku różnych bramek.

Oto kilka typowych danych dla pierwszej bramy. Ten wykres analizy faksu przedstawia reprezentatywną próbkę po wyregulowaniu bramki. Pierwsza bramka rozpoznaje wzorce szczątków i żywotnych jąder w oparciu o kombinację ustawień, takich jak fluorescencja i ogólne wrażenia wizualne.

Oś x reprezentuje rozproszenie do przodu, które odpowiada rozmiarowi względnemu, podczas gdy oś Y uwzględnia rozproszenie lokalizacji, które odpowiada za złożoność wewnętrzną, taką jak stopień szczegółowości. Pierwsza bramka może również dać wyobrażenie o wielkości różnych jąder znalezionych w naszej próbce. Pozwala to na oddzielenie szczątków od rzeczywistych jąder, a oto kilka typowych danych z drugiej bramki.

Ten wykres faksu pokazuje przykład drugiej bramki, która pozwala sortować jądra pojedynczo przy jednoczesnym odrzucaniu dowolnych agregatów. Bramka ta analizuje różnice w długościach czasu, jakie jądra potrzebują na przejście przez laser. Te, które są agregatami, zwykle potrzebują więcej czasu, aby przejść.

Ten konkretny parametr jest bardzo ważny, ponieważ włączenie agregatów może zakłócać czystość, ponieważ niektóre jądra fluorescencyjne mogą być związane z jądrami niefluorescencyjnymi. Na koniec typowe dane z trzeciej bramy. Ta bramka jest ustawiona na określoną długość fali fluorescencji pasującą do długości fali fluoronu znajdującego się w naszym przeciwciałie drugorzędowym.

Na tym wykresie faksu widać poziom fluorescencji wzdłuż osi x i detektor kanału w kolorze głębokiej czerwieni, PECY siedem wzdłuż osi Y. Te plamy punktowe dają lepszy obraz, gdy po prostu porówna się je z histogramem pojedynczego koloru. Umieszczenie SCADA pozwala na sortowanie i oddzielanie nowych i dodatnich jąder neuronalnych od nowych i ujemnych jąder nieneuronalnych.

Po wybraniu wszystkich bramek, jądra są sortowane w jeden XPBS. Gdy cała próbka przejdzie przez sortowanie faktów, sprawdź czystość sortowania, przepuszczając Eloqua posortowanej próbki przez urządzenie. Oto przykład optymalnego wyniku.

Tutaj porównaj próbkę wstępną, która zawiera mieszaną populację jąder, z posortowaną Eloqua, która wyeliminowała większość jąder ujemnych. Należy pamiętać, że procenty czystości są oparte na liczbie zdarzeń, które zanieczyszczają próbkę, na podstawie ustawionych bramek. Należy pamiętać, że przy pierwszym przepuszczeniu próbki przez maszynę może wystąpić pewne wybielanie, co powoduje pewne ściemnianie, aby to uwzględnić, może być konieczne dokonanie pewnych korekt.

Po posortowaniu próbki rozpocznij przetwarzanie jąder. Aby to zrobić, weź 10 mililitrów posortowanej próbki i dodaj dwa mililitry roztworu sacharozy, 50 mikrolitrów jednego molowego chlorku wapnia i 30 mikrolitrów jednego molowego octanu magnezu. Jeśli posortowana próbka jest mniejsza niż 10 milicali, zwiększ objętość do 10 milicali, dodając jeden XPBS lub odpowiednio dostosuj dodatkowe materiały.

Następnie odwróć próbkę kilka razy i umieść ją na lodzie na 15 minut. Po 15 minutach próbka z wirówką wirową w wirniku łyżki obrotowej 1, 786 RCF przez 15 minut w czterech stopniach. Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając białego osadu znajdującego się na dnie probówki.

Następnie rozpuść osad w 200 mikrolitrach odpowiedniego roztworu potrzebnego do poprzednich doświadczeń. W tym przypadku rozpuszczamy granulkę i bufor downing w celu przeprowadzenia kolejnego eksperymentu z chipami. Następnie ponownie zawiesić pelety rurą w górę iw dół.

W tym momencie możesz przenieść jądra do mniejszej rurki i umieścić je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do czasu dalszego użycia, cóż, właśnie pokazałem wam, jak wyizolować jądra neuronalne z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Za pomocą tych jąder można przeprowadzić szereg różnych analiz, takich jak immunoprecypitacja chromatyny.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze trzymać próbki na lodzie, ponieważ jądro jest nieutrwalone i może ulec degradacji w wysokiej temperaturze. Ważne jest również, aby obchodzić się z tkankami ludzkimi na poziomie bezpieczeństwa biologicznego na poziomie dwóch lub wyższym standardach bezpieczeństwa. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.