Name: Izolacja jąder neuronalnych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę izolacji jąder neuronalnych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Protokół obejmuje homogenizację, gradient gęstościowy, sortowanie przepływowe i ultrawirowanie, umożliwiając badanie interakcji chromatyny DNA w neuronach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają wdzięczność za porady i wsparcie techniczne zapewnione przez dr. Richarda Konza oraz personel Flow Cytometry Core facility na University of Massachusetts Medical School. Wykorzystano również zasoby Core wspierane przez grant Diabetes Endocrinology Research Center DK032520. Praca ta jest finansowana z grantów National Institute of Mental Health (NIMH), National Institute of Drug Abuse (NIDA) oraz National Institute of Child Health and Human Development.

Ekstrakcja jąder komórkowych
<ol>
<li>Umieść&nbsp;250 mg zamrożonej tkanki mózgowej pobranej po śmierci w 5 mL buforu do lizy (Lysis Buffer1 ) w homogenizatorze typu douncer i umieść go na lodzie. Aby otrzymać około 5 milionów jąder po sortowaniu FACS, zazwyczaj używamy 1000 mg tkanki na próbkę.</li>
<li>Po rozmrożeniu tkanki homogenizuj ją w douncerze przez 1 minutę na lodzie.</li>
<li>Przenieś zhomogenizowaną tkankę do przezroczystej probówki do ultrawirówki o pojemności 15 mL. Umieść probówkę na lodzie.</li>
<li>Pobierz pipetą 9 mL roztworu sacharozy (Sucrose Solution2), wprowadź końcówkę pipety na dno przezroczystej probówki do ultrawirówki i powoli uwolnij roztwór sacharozy (Sucrose Solution2), aby stworzyć gradient stężeń z zhomogenizowaną tkanką w górnej warstwie nad roztworem sacharozy (Sucrose Solution2).</li>
<li>Zważ probówki do ultrawirówki, aby upewnić się, że będą one zrównoważone podczas wirowania w ultrawirówce. W razie potrzeby skoryguj wagę, dodając bufor do lizy (Lysis Buffer1) do górnej warstwy.</li>
<li>Po zważeniu probówek umieść je w koszyczkach rotora.</li>
<li>Włóż wszystkie koszyczki do rotora SW28, a następnie ostrożnie umieść rotor w ultrawirówce.</li>
<li>Wiruj próbki w ultrawirówce przy 107163.6 RCF przez 2,5 godziny w temperaturze 4°C.</li>
<li>Po zakończeniu wirowania usuń nadpływ wraz z warstwą zanieczyszczeń znajdującą się w gradiencie stężeń za pomocą odkurzacza próżniowego, uważając, aby nie naruszyć osadu zawierającego jądra na dnie probówki.</li>
<li>Dodaj 500 µL 1X PBS do każdego osadu i pozostaw na lodzie na 20 minut. Pozwala to osadowi częściowo rozpuścić się samoistnie, co ułatwia jego późniejsze mechaniczne rozbicie poprzez pipetowanie w górę i w dół, zmniejszając tym samym stres poddawane jądra.</li>
<li>Po inkubacji jąder na lodzie przez 20 minut, mechanicznie pipetuj w górę i w dół, aby całkowicie rozpuścić jądra w 1X PBS.</li>
<li>Przenieś roztwór zawierający jądra z probówek do ultrawirówki i połącz zawartość dwóch probówek w jednej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Ponownie umieść próbki na lodzie.</li>
</ol>
Immunobarwienie do analizy FACS
<ol>
<li>Na tym etapie przygotować mieszaninę do immunobarwienia składającą się z przeciwciał pierwszo- i drugorzędowych oraz mieszaniny blokującej (Blocking Mix). Dla każdej próbki połączyć 300 µL 1XPBS zawierającego 1,2 µL przeciwciała NeuN, 100 µL Blocking Mix (zawierającego 0,5% BSA i 10% normalnego surowicy koziej w 1XPBS) oraz 1 µL Alexa Fluor 488. W przypadku próbek kontrolnych pominąć przeciwciało pierwszorzędowe NeuN, dodając w jego miejsce odpowiednią ilość 1XPBS.</li>
<li>Mieszaninę do immunobarwienia wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
<li>Podczas inkubacji mieszaniny barwiącej przygotować kontrole dla próbek. Do sortowania FACS wymagana jest próbka zawierająca same jądra komórkowe, zwana „kontrolą niebarwioną”, oraz druga próbka – kontrola negatywna – zawierająca jądra z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488, ale bez przeciwciała pierwszorzędowego NeuN.</li>
<li>Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL zawierającej 1XPBS odpipetować 20 µL roztworu z jądrami komórkowymi dla kontroli niebarwionej, a kolejne 20 µL do drugiej probówki o pojemności 2 mL zawierającej 980 uL 1XPBS dla kontroli negatywnej. Objętość próbki z jądrami uzupełnić do 1 mL za pomocą 1XPBS. Wszystkie próbki umieścić ponownie w lodzie.</li>
<li>Po zakończeniu inkubacji mieszaniny do immunobarwienia dodać jej zawartość (401 µL) do odpowiednich próbek. Próbka z jądrami otrzyma mieszaninę zawierającą zarówno NeuN, jak i Alexa Fluor 488, natomiast próbka negatywna&nbsp;otrzyma mieszaninę zawierającą tylko przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488.</li>
<li>Przenieść próbki do pomieszczenia chłodniczego w celu rotacji w ciemności przez 45 minut.</li>
<li>Po 45-minutowej inkubacji próbek w ciemności umieścić je w lodzie i przetransportować do pracowni FACS. Podczas transportu do pracowni FACS próbki należy przechowywać w lodzie i w ciemności.</li>
</ol>
FACS
<ol>
<li>W laboratorium FACS przefiltrować próbki przez filtr 40 µm. Następnie, utrzymując je w niskiej temperaturze, przepuścić&nbsp;je&nbsp;przez urządzenie przez kilka minut, aby uzyskać wstępne dane przed sortowaniem.</li>
<li>Na tym etapie konieczne jest ustawienie odpowiednich bramek (gates) wymaganych do sortowania. Do sortowania próbek wykorzystuje się kilka różnych bramek. Pierwsza bramka pozwala określić rozmiar poszczególnych jąder znajdujących się w próbce i&nbsp;umożliwia oddzielenie&nbsp;debris od właściwych jąder. Druga bramka pozwala na sortowanie poszczególnych jąder. Na tym etapie odrzuca się wszelkie agregaty. Wreszcie trzecią bramkę ustawia się na konkretną długość fali fluorescencji, odpowiadającą fluorochromowi zawartemu w przeciwciałach wtórnych. Ustawienie tej bramki pozwala na sortowanie i oddzielenie jąder NeuN +, czyli jąder neuronalnych, od jąder NeuN -.</li>
<li>Po wybraniu wszystkich bramek można przystąpić do sortowania jąder do 1XPBS.</li>
<li>Po przepuszczeniu całej próbki należy sprawdzić czystość sortowania, przepuszczając przez urządzenie alikwot posortowanej próbki. Należy upewnić się, że fluorescencja próbki nie jest rozproszona, lecz skupiona w jednym kwadrancie. Zaleca się wybór próbek o czystości powyżej 90%.</li>
</ol>
Po FACS
<ol>
<li>Po posortowaniu próbki można rozpocząć przetwarzanie jąder. Do 10 mL posortowanej próbki należy dodać 2 mL roztworu sacharozy2, 50 uL 1M CaCl2 oraz 30 ul 1m Mg(Ace)2. Przypominamy, aby próbkę zawsze przechowywać w lodzie, ponieważ jądra nie są utrwalone.</li>
<li>Jeśli objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 10 mL, należy uzupełnić ją do 10 mL za pomocą 1XPBS lub odpowiednio dostosować ilość dodawanych odczynników.</li>
<li>Próbkę należy kilkakrotnie odwrócić i pozostawić w lodzie na 15 minut.</li>
<li>Po 15-minutowej inkubacji próbek w lodzie, należy je odwirować w rotorze z koszyczkami odchylanymi przy 1786 RCF przez 15 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Nadpływ należy usunąć za pomocą odsysacza, uważając, aby nie naruszyć białego osadu znajdującego się na dnie probówki.</li>
<li>Osad należy rozpuścić w 200 µl roztworu wymaganego do dalszych eksperymentów, pipetując go w górę i w dół.</li>
<li>Roztwór należy przenieść do mniejszej probówki i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

Przedstawiony tutaj protokół powinien być szczególnie użyteczny w badaniach skoncentrowanych na zmianach epigenetycznych chromatyny neuronalnej, a szerzej, na fenotypie molekularnym jądra neuronalnego podczas normalnego rozwoju i starzenia się lub w przebiegu chorób neurologicznych bądź psychiatrycznych. Metoda ta jest szczególnie korzystna w sytuacjach, gdy problemem jest heterogenność komórkowa tkanki mózgowej, w tym potencjalne zmiany w stosunku neuronów do gleju w procesie starzenia lub w wyniku choroby 1....

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;b&gt;Odczynniki:&lt;/b&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela&gt;&lt;ciało tablicy&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;&lt;th colspan=&quot;3&quot; wyrównaj=&quot;lewy&quot;&gt;1. Bufor lizujący&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;0,32 M&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Sacharoza&lt;/td&gt;&lt;td&gt;5,47 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;5 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;250 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;3 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;octan Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;150 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;0,1 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;EDTA&lt;/td&gt;&lt;td&gt;10 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tris-HCl, pH 8&lt;/td&gt;&lt;td&gt; 500 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;1 mM &lt;/td&gt;&lt;td&gt;DTT&lt;/td&gt;&lt;td&gt;17 &amp;#x03BC;L&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;0.1%&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Triton X-100&lt;/td&gt;&lt;td&gt;50 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td colspan=&quot;3&quot; styl=&quot;padding:8px 0 16px 0&quot; wyrównaj=&quot;centrum&quot;&gt;Dopełnić objętość do 50 ml wodą autoklawowaną&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;tabela&gt;&lt;ciało tabeli&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;th colspan=&quot;3&quot; wyrównaj=&quot;lewy&quot;&gt;2. Roztwór sacharozy&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;1,8 M&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Sacharoza&lt;/td&gt;&lt;td&gt;30,78 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;3 mM &lt;/td&gt;&lt;td&gt;octan Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;150 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który należy przetłumaczyć na język polski.&gt;&lt;td&gt;1 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;DTT&lt;/td&gt;&lt;td&gt;17 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tris-HCl, pH 8&lt;/td&gt;&lt;td&gt;500 &amp;#x03BC;l&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td colspan=&quot;3&quot; styl=&quot;padding:8px 0 16px 0&quot; wyrównanie=&quot;centrum&quot;&gt;Dopełnić objętość do 50 ml wodą autoklawowaną&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;tabela&gt;&lt;ciało tabeli&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;th colspan=&quot;3&quot; wyrównaj=&quot;lewy&quot;&gt;3. Bufor Dounce'a&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tris&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0,242 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;4 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0,163 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&gt;&lt;td&gt;1 mM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0,03 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&gt;&lt;td colspan=&quot;3&quot; styl=&quot;padding:8px 0 16px 0&quot; wyrównanie=&quot;centrum&quot;&gt;Dostosować pH do wartości 7,5 i uzupełnić objętość do 200 ml wodą autoklawowaną&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurony w ludzkim mózgu stają się postmitotyczne głównie w trakcie rozwoju prenatalnego, w związku z czym zachowują swoje jądra przez cały okres życia. Niemniej jednak niewiele wiadomo na temat zmian w chromatynie neuronalnej i organizacji jądrowej w przebiegu rozwoju i starzenia się, a także w przewlekłych chorobach neuropsychiatrycznych. Do tej pory większość analiz opartych na chromatynie i DNA (z wyjątkiem metody FISH) nie posiadała rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek. W tym kontekście znaczna heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie, ponieważ zazwyczaj różne subpopulacje neuronów są wymieszane z różnymi typami gleju i innymi komórkami nieneuronalnymi. Jednym z możliwych rozwiązań byłoby hodowanie kultur specyficznych dla danego typu komórek, jednak większość komórek OUN, w tym neurony, jest w warunkach ex vivo utrzymywalna w najlepszym przypadku przez zaledwie kilka tygodni, co stanowiłoby niepełny model mechanizmów epigenetycznych potencjalnie działających przez cały okres życia. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół ekstrakcji i oczyszczania jąder z zamrożonego (nigdy nieutrwalonego) ludzkiego mózgu pobranego po śmierci. Metoda ta obejmuje ekstrakcję jąder w hipotonicznym buforze lizującym, a następnie ultrawirowanie i immunoznakowanie przeciwciałem anty-NeuN. Znakowane jądra neuronalne są następnie oddzielnie zbierane przy użyciu sortowania aktywowanego fluorescencją. Metoda ta powinna być możliwa do zastosowania w każdym regionie mózgu u szerokiego spektrum gatunków i odpowiednia do badań immunoprecypitacji chromatyny z użyciem przeciwciał antyhistonowych specyficznych dla miejsca i modyfikacji, a także do analiz metylacji DNA i innych testów.

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Neurony w ludzkim mózgu stają się postmitotyczne głównie w trakcie rozwoju prenatalnego, a w konsekwencji zachowują swoje jądra przez cały okres życia. Jednakże, ...

Aby zbadać oddziaływania chromatyny z DNA, które regulują specyficzną dla neuronów ekspresję genów w ludzkim mózgu, w pierwszej kolejności należy uzyskać czystą populację jąder neuronalnych. Tkankę ludzkiego mózgu pobraną po śmierci poddaje się homogenizacji, a wszystkie jądra izoluje się za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Następnie jądra są znakowane swoistymi dla neuronów przeciwciałami i izolowane poprzez sortowanie przepływowe, a na koniec zagęszczane metodą ultrawirowania.Witajcie, nazywam się Anish Matan i pracuję w laboratorium dr Sharon McBarian w departamencie psychiatrii University of Massachusetts Medical School. Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolacji jąder neuronalnych z pośmiertnej tkanki mózgu człowieka. Zatem zacznijmy.Dla każdej próbki jąder przeznaczonej do sortowania należy rozpocząć od tysiąca miligramów zamrożonej tkanki mózgowej pobranej po śmierci. Z tej ilości można uzyskać około 5 milionów jąder neuronalnych po sortowaniu aktywowanym fluorescencją. Aby rozpocząć ekstrakcję jąder, należy umieścić 250 miligramów tkanki mózgowej w probówce typu dounce zawierającej pięć ml buforu lizującego i umieścić ją w lodzie.Po rozmrożeniu tkanki poddać ją homogenizacji przez jedną minutę w warunkach chłodzenia na lodzie. Po homogenizacji przenieść homogenizat tkankowy do przezroczystej probówki do ultrawirówki o pojemności 15 ml, a następnie umieścić probówkę na lodzie. Powtórzyć proces homogenizacji dla pozostałej części tkanki.Następnie ostrożnie pipetuj 9 ml roztworu sacharozy na dno probówek do ultrawirowania, aby stworzyć gradient stężeń w taki sposób, by roztwór homogenizowanego tkanki znajdował się nad roztworem sacharozy. Teraz zważ probówki do ultrawirowania, aby zapewnić ich wyważenie podczas ultrawirowania. Wprowadź ewentualne korekty wagi, dodając bufor lizujący do górnej warstwy. Po zważeniu probówek umieść je w ultrawirowarce, używając rotora SW 28, i wirować próbki przy 107163,6 RCF przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C.Po zakończeniu wirowania odessaj supernatant oraz warstwę resztek znajdującą się na gradiencie stężeń. Należy uważać, aby nie zaburzyć osadu na dnie probówki, który zawiera jądra komórkowe. Następnie dodaj 500 µL 1x PBS do każdego osadu i pozostaw go na lodzie na 20 minut.Po 20 minutach resuspenduj osady, pipetując zawiesinę w górę i w dół. Inkubacja w lodzie pozwala na częściowe samoistne rozpuszczenie osadów, co ułatwia resuspensję jąder, zmniejszając tym samym stres, jakiego one ulegają. Następnie przenieś resuspensję i jądra do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml.Połącz roztwór kwasów nukleinowych z dwóch probówek do ultrawirówki w każdej z probówek do mikrocentryfugi i ponownie umieść próbki w lodzie. Po zakończeniu ekstrakcji kwasów nukleinowych przejdę do etapu immunobarwienia w celu wyizolowania jąder neuronalnych za pomocą sortowania. Próbkę zawierającą jądra inkubuje się z mieszaniną do immunobarwienia, składającą się z przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego oraz roztworów blokujących. Aby przygotować mieszaninę do immunobarwienia, dodaj 1,2 µL przeciwciała specyficznego dla neuronów NeuN do 300 µL 1x PBS. Następnie dodaj 100 µL mieszaniny blokującej, która zawiera 0,5% BSA i 10% normalnego surowicy koziej w 1x PBS.Na koniec dodaj jeden µL przeciwciała wtórnego o nazwie LOR 4 88. Przygotuj również barwienie immunologiczne dla próbki kontrolnej ujemnej dla tej mieszaniny do barwienia. Pomiń przeciwciało pierwotne i zastąp je 1,2 µL 1x PBS.Następnie wymieszaj mieszaniny do immunobarwienia w wstrząsarzu wirowym i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, podczas gdy trwają inkubacje mieszanin barwiących. Przygotuj próbki jąder do kontroli negatywnej: pipetuj 20 µL zawiesiny jąder do probówki o pojemności 2 ml zawierającej 980 µL 1x PBS. Przygotuj również kontrolę niebarwioną, zawierającą wyłącznie roztwór jąder i PBS.Przenieś 20 µL jąder do drugiej probówki i uzupełnij objętość do 1 mL za pomocą 1x PBS. Następnie umieść wszystkie próbki z powrotem na lodzie. Do tego czasu mieszaniny do barwienia immunocytochemicznego powinny być już gotowe.W fazie inkubacji dodaj 401 µL mieszaniny do odpowiedniej próbki. Do próbki z jądrami komórkowymi dodano mieszaninę zawierającą zarówno przeciwciało pierwotne, jak i LOR 4 88. Do próbki kontrolnej negatywnej dodano mieszaninę zawierającą wyłącznie przeciwciało wtórne LOR 4 88, natomiast do próbki kontrolnej niebarwionej nie dodano żadnego barwnika immunocytochemicznego.Następnie przenieś próbki do rotatora i inkubuj je w ciemności przez 45 minut. Po zakończeniu 45-minutowej inkubacji przeniosę próbki do centrum cytometrii przepływowej na University of Massachusetts Medical School w celu przeprowadzenia sortowania aktywowanego fluorescencją. Podczas transportu do centrum próbki należy przechowywać w lodzie i w ciemności. W centrum cytometrii przepływowej próbki są najpierw filtrowane przez filtr 40 µm, a następnie analizowane w urządzeniu przez kilka minut, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej temperatury.Jest to wykonywane w celu uzyskania wstępnych danych przed sortowaniem. Kontrola niebarwiona określa stopień fluorescencji negatywnej. Na podstawie tych informacji należy dostosować czułość urządzenia na fluorescencję.Barwiona kontrola służy do kontroli autofluorescencji. Wszelki szum tła wynikający z autofluorescencji w tym punkcie pozwala na ustawienie odpowiednich bram niezbędnych do sortowania. Do sortowania próbek wykorzystuje się kilka różnych bram.Oto typowe dane dla pierwszej bramki. Ten wykres analizy FACS przedstawia reprezentatywną próbkę po dostrojeniu bramki. Pierwsza bramka rozpoznaje wzorce debris i żywotnych jąder na podstawie kombinacji ustawień, takich jak fluorescencja i ogólne doświadczenie wizualne.Oś X reprezentuje rozproszenie przednie, które odpowiada względnej wielkości, natomiast oś Y odpowiada za rozproszenie boczne, które odzwierciedla złożoność wewnętrzną, taką jak ziarnistość. Pierwsze bramkowanie pozwala również określić wielkość poszczególnych jąder obecnych w próbce. Umożliwia to oddzielenie zanieczyszczeń od właściwych jąder; poniżej przedstawiono typowe dane z drugiego bramkowania.Ten wykres FACS przedstawia przykład drugiej bramki, która umożliwia sortowanie poszczególnych jąder przy jednoczesnym odrzuceniu agregatów. Bramka ta analizuje różnice w czasie przejścia jąder przez wiązkę lasera. Obiekty będące agregatami zazwyczaj potrzebują więcej czasu na przejście.Ten konkretny parametr jest bardzo istotny, ponieważ obecność agregatów może zakłócać ocenę czystości, gdyż niektóre fluorescencyjne jądra mogą być związane z jądrami niewykazującymi fluorescencji. Na koniec przedstawiamy typowe dane z trzeciego bramowania. Brama ta jest ustawiona na konkretną długość fali fluorescencji odpowiadającą fluorochromowi obecnemu w naszym przeciwciele wtórnym.Na tym wykresie FACS na osi x widoczny jest poziom fluorescencji, a na osi y detektor kanału głębokiej czerwieni PECy7. Takie wykresy kropkowe zapewniają lepszą wizualizację w porównaniu do pojedynczego histogramu kolorystycznego. Zastosowanie bramkowania (gatingu) pozwala na posortowanie i oddzielenie pozytywnych jąder neuronalnych od negatywnych jąder nieneuronalnych.Po wybraniu wszystkich bram jądra są sortowane do jednego XPBS. Gdy cała próbka przejdzie przez sortowanie, sprawdź czystość procesu, przepuszczając przez instrument Eloqua posortowanej próbki. Oto przykład optymalnego wyniku.W tym miejscu porównano próbkę przed sortowaniem, zawierającą zmieszaną populację jąder, z posortowaną populacją Eloqua, w której wyeliminowano większość jąder negatywnych. Należy zauważyć, że wartości procentowe czystości opierają się na liczbie zdarzeń zanieczyszczających próbkę, wyznaczonych na podstawie ustawionych bramek. Należy pamiętać, że podczas pierwszego przejścia próbki przez urządzenie może dojść do częściowego wybielenia, co spowoduje osłabienie sygnału; aby to uwzględnić, konieczne może być wprowadzenie pewnych korekt.Po posortowaniu próbki należy rozpocząć procesowanie jąder. W tym celu należy pobrać 10 µL posortowanej próbki i dodać 2 µL roztworu sacharozy, 50 µL 1 M chlorku wapnia oraz 30 µL 1 M octanu magnezu. Jeśli objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 10 µL, należy uzupełnić ją do 10 µL za pomocą 1X PBS lub odpowiednio dostosować ilość dodawanych odczynników.Następnie kilka razy odwróć probówkę z próbką i pozostaw ją w lodzie na 15 minut. Po 15 minutach odwiruj próbkę w rotorze z koszykami przy 1 786 RCF przez 15 minut w temperaturze czterech stopni. Po wirowaniu ostrożnie odessij nadsącz, nie naruszając białego osadu znajdującego się na dnie probówki.Następnie rozpuścić osad w 200 µL odpowiedniego roztworu wymaganego do poprzednich eksperymentów. W tym przypadku rozpuszczamy osad w buforze do rozcieńczania w celu przeprowadzenia kolejnego eksperymentu na chipie. Następnie resuspenderć osad, pipetując go w górę i w dół.Na tym etapie można przenieść jądra do mniejszej probówki i umieścić ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania. W ten sposób zaprezentowałem proces izolacji jąder neuronalnych z ludzkiej tkanki mózgowej pobranej po śmierci. Z tak przygotowanych jąder można przeprowadzić szereg różnych analiz, takich jak immunoprecypitacja chromatyny.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby próbki zawsze przechowywać w lodzie, ponieważ jądra komórkowe nie są utrwalone i mogą ulec degradacji w wysokiej temperaturze. Ważne jest również, aby tkanki ludzkie przetwarzać zgodnie ze standardami bezpieczeństwa poziomu biosafety level two lub wyższego. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolowanie jąder neuronalnych z ludzkiej tkanki mózgowej po śmierci

Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Ten film opisuje protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonej tkanki glejaka. Wyizolowane pojedyncze jądra mogą być wykorzystane jako próbki do technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA) i test pojedynczych jąder do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATAC) w celu uzyskania głębszego wglądu w niejednorodność między- i wewnątrznowotworową obserwowaną w glejaku ośrodkowych tkanek nerwowych.

Izolacja jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka: metoda uzyskiwania nienaruszonych jąder z próbek guza glejaka

Film demonstruje metodę izolowania nienaruszonych jąder z komórek glejowych i macierzystych w zakręcie zębatym hipokampa myszy (DG). Tkanka DG jest mechanicznie dysocjowana w zimnym buforze homogenizacyjnym w celu uwolnienia jąder. Szczątki tkanek i inne uwolnione organelle są odrzucane, a jądra są barwione barwnikiem DNA i przeciwciałem sprzężonym z fluoroforem specyficznym dla neuronalnego antygenu jądrowego (NeuN). Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją jest następnie stosowane do...

Technika izolowania jąder od komórek nieneuronalnych w zakręcie zębatym hipokampa

Ten film demonstruje procedurę izolowania i sortowania jąder ze świeżo zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS), które umożliwia badanie różnych populacji komórek dla różnych zastosowań neurologicznych.

Izolowanie populacji komórek z tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Poznaj metodę izolacji jąder neuronalnych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Protokół obejmuje homogenizację, gradient gęstościowy, sortowanie przepływowe i ultrawirowanie, umożliwiając badanie interakcji chromatyny DNA w neuronach.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Przeglądaj więcej filmów