Name: Test behawioralny do pomiaru reakcji danio pręgowanego na zmiany natężenia światła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj test behawioralny VMR do oceny reakcji wzrokowo-ruchowej larw Danio rerio na zmiany natężenia światła. Metoda pozwala badać zdolności wzrokowe mutantów, w tym wcześniej uznawanych za niewidome.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty National Institute of Health EY0081 i 5T32UY07145 oraz przez Knights Templar Eye Foundation. Jason Rihel jest stypendystą Bristol-Squibb w Life Sciences Research Foundation.

Niniejszy protokół przedstawia kroki niezbędne do przeprowadzenia badania odpowiedzi wzrokowo-motorycznej larw danio pręgowanego na zwiększenia i zmniejszenia natężenia światła we własnym laboratorium. Danio pręgowany stanowi doskonały model do badań behawioralnych. Ryby te są łatwe w utrzymaniu, mają liczne mioty i szybko się rozwijają. Przykładowo, oczy larw danio pręgowanego reagują na światło już w 3. dniu rozwoju, kiedy to wykazują reakcję przestrachu. 

Część 1: Umieszczanie poszczególnych ryb w płytce 96-dołkowej
<ol>
<li>Hodować larwy WT w cyklu ciemno-jasnym w temperaturze 28°C do co najmniej 4 dni po zapłodnieniu (dpf). Typowy cykl światła:ciemności stosowany w naszym laboratorium to 14 godzin włączonego światła zaczynając od 9:00 oraz 10 godzin wyłączonego światła zaczynając od 23:00. Aby uzyskać najlepsze wyniki behawioralne, należy unikać przepełnienia naczyń; zazwyczaj utrzymujemy nie więcej niż 50 larw w jednej płytce Petriego. </li>
<li>Po 4 dpf zebrafishy są gotowe do przeniesienia do płytki 96-dołkowej. Aby zapewnić larwom większą przestrzeń do pływania, zazwyczaj używamy płytki 96-dołkowej z dużymi dołkami o pojemności 650 µl; jednak standardowe płytki 96-dołkowe również sprawdzają się dobrze. Używając plastikowej pipety transferowej, ostrożnie przenieś jedną larwę do każdego dołka. </li>
<li>Po przeniesieniu ryb do dołków, wypełnij każdy z nich odpowiednią ilością wody z rybami, tak aby powierzchnia wody była niemal zlicowana z górną krawędzią dołków. Zbyt wysoki lub zbyt niski poziom wody w dołku może powodować problemy optyczne podczas rejestracji obrazu przez kamerę. Należy również uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do dołków. </li>
</ol>
Część 2: Przegląd aparatury pomiarowej
W tej części protokołu prosimy o zapoznanie się z filmem w celu zidentyfikowania poszczególnych elementów oraz zapoznania się z konfiguracją aparatury pomiarowej.
<ol>
<li>Wewnątrz komory rejestracyjnej znajduje się wyraźnie określone miejsce na umieszczenie płytki 96-dołkowej.</li>
<li>Kamera jest umieszczona z tyłu i jest ogniskowana na płytce za pomocą luster znajdujących się na obudowie. Kąt ustawienia tych luster można regulować, obracając śruby mocujące lustra.</li>
<li>Komora rejestracyjna jest oświetlona od dołu diodami LED emitującymi światło podczerwone (IR). Pozwala to kamerze widzieć ryby nawet w ciemności. Larwy nie wykrywają światła IR, więc stałe oświetlenie podczerwienią nie wpływa na przebieg eksperymentu. Komora jest również oświetlona od dołu białymi diodami LED, które są sterowane niezależnie od świateł IR. Oświetlenie komory białym światłem z góry lub z boków jest oczywiście możliwe, jednak w takich przypadkach należy zachować ostrożność, aby uniknąć silnych odblasków od powierzchni wody, które mogą zakłócać obraz z kamery.</li>
<li>W przypadku eksperymentów trwających dłużej niż kilka godzin, należy napełnić komorę delikatnie przepływającą wodą, aby pomóc w utrzymaniu stałej temperatury przez cały czas trwania badania. Jednym ze sposobów na zapewnienie stałego przepływu wody jest pompowanie jej z zbiornika za pomocą małej pompy akwariowej, podgrzewanej do 28°C typową grzałką akwariową.</li>
<li>Aby zminimalizować niepożądane wibracje przenoszone z pomieszczenia, cała jednostka rejestracyjna powinna spoczywać na ciężkim stole antywibracyjnym.</li>
</ol>
Część 3: Dopasowanie płytki 96-dołkowej do siatki komputerowej systemu śledzenia wideo
<ol>
<li>Umieść płytkę 96-dołkową zawierającą ryby w komorze rejestracyjnej.</li>
<li>W przypadku użycia kąpieli wodnej, powoli zanurz płytkę w wodzie, pozwalając na dostosowanie poziomu wody, aby uniknąć jej rozlania się na płytkę. Alternatywnie można wyłączyć przepływ wody, włożyć płytkę, a następnie wznowić przepływ. Należy również upewnić się, że płytka 96-dołkowa jest stabilnie utrzymana na miejscu za pomocą sprężyny lub gumki recepturki.</li>
<li>W oprogramowaniu Viewpoint Videotrack sprawdź, czy wszystkie larwy biorące udział w eksperymencie są widoczne na ekranie komputera. Używając elementów sterujących oprogramowania, dopasuj siatkę programu do śledzenia wideo do dołków w płytce w taki sposób, aby każda ryba znajdowała się wewnątrz kwadratu siatki. Komputer śledzący będzie obliczał ruch oddzielnie dla każdego z tych pól, dlatego w przypadku błędnego dopasowania siatki niektóre ruchy ryb mogą zostać pominięte. Co gorsza, dwie sąsiednie ryby mogą zająć ten sam obszar i zostać policzone jako jedna ryba. Ten krok jest bardzo ważny dla wszystkich rejestracji.</li>
<li>Po dopasowaniu zaprogramuj czas włączania i wyłączania świateł. Zazwyczaj stosujemy 3 godziny adaptacji do światła lub ciemności w komorze, aby uzyskać podstawowy poziom aktywności, ale także dać larwom możliwość uspokojenia się po pipetowaniu i manipulacji. Po etapie bazowym wprowadzamy naprzemiennie 30 minut zapalonego światła (ON), a następnie 30 minut zgaszonego światła (OFF), powtarzając ten cykl kilka razy.</li>
<li>Następnie zamknij drzwi komory rejestracyjnej i rozpocznij nagrywanie.</li>
<li>W praktyce rejestrujemy aktywność każdej ryby na sekundę, jednak oprogramowanie Viewpoint rejestruje dane klatka po klatce (zapoznaj się z filmem w celu zaprezentowania procesu gromadzenia danych). Ustalenie wartości progowej minimalnej zmiany pikseli na klatkę zależy w pewnym stopniu od konkretnej kamery i ustawień oświetlenia. W naszej konfiguracji zazwyczaj stosujemy próg 4 pikseli; oznacza to, że jeśli zmienia się mniej niż 4 piksele, jest to uznawane za tło. Jeśli porusza się więcej niż 4 piksele, wskazuje to na ruch ryby. Doświadczalnie ustaliliśmy, że ta granica wykrywa niemal wszystkie ruchy pływające i obrotowe larw.</li>
<li>Mimo że pola rejestracyjne dość dobrze izolują larwy, wyłącz światło w pomieszczeniu i zadbaj o zminimalizowanie zakłóceń w postaci hałasów mechanicznych, takich jak otwieranie i zamykanie drzwi w pokoju, huczne imprezy czy ćwiczenia fizyczne.</li>
</ol>
Część 4: Analiza danych
<ol>
<li>Po zakończeniu eksperymentu przenieś zebrane dane do arkusza Excel lub do preferowanego pakietu analitycznego.</li>
<li>Załączony arkusz Excel jest przykładem tego, jak mogą wyglądać dane: zawiera czas w sekundach od początku eksperymentu oraz aktywność każdej larwy na sekundę dla wszystkich ryb przez cały czas trwania eksperymentu (patrz plik uzupełniający Example Data w sekcji Files na tej stronie).</li>
<li>Rysunek 1 przedstawia przykład aktywności pojedynczej larwy. Rysunek 2 to reprezentatywny ślad średniej z 40 larw zebrafish WT. Uśrednione odpowiedzi ON i OFF są wyraźne i spójne. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Wykres średniej aktywności w funkcji czasu; wzorzec sygnału włącz/wyłącz; analiza danych w badaniu systemów dynamicznych." width="569" height="398" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 1"> Rysunek 1: Aktywność pojedynczej ryby. Aktywność pojedynczej ryby WT w 5 dpf w odpowiedzi na naprzemienne 30-minutowe okresy włączania (ON) i wyłączania (OFF) światła. Odpowiedzi ON zaznaczono czarnymi strzałkami, a odpowiedzi OFF czerwonymi strzałkami. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Wykres szeregów czasowych średniej aktywności pokazujący okresowe cykle ON-OFF w sekundach." width="577" height="387" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 2"> Rysunek 2: Średnia aktywność 40 ryb. Średnia aktywność 40 ryb WT w 5 dpf w odpowiedzi na naprzemienne 30-minutowe okresy włączania (ON) i wyłączania (OFF) światła. Uśrednione odpowiedzi ON (czarne strzałki) i OFF (czerwone strzałki) są wyraźne i spójne.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 3 przedstawia schematyczny zarys procedury eksperymentalnej zastosowanej we wszystkich naszych badaniach. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Schemat ustawienia analizy zachowania rybek zebrafish; wykres harmonogramu adaptacji do światła." width="530" height="479" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Projekt eksperymentalny testu odpowiedzi wizualno-motorycznej (VMR). A) Pojedyncze ryby umieszczone są w komorze rejestracyjnej w płytce 96-dołkowej. Aktywność każdej ryby jest mierzona w każdej sekundzie. B) Ryby poddawane są okresowi adaptacji w ciemności lub w świetle, aby ustabilizować ich stan i uzyskać bazowy poziom aktywności. Okresy 30 minut z włączonym i wyłączonym światłem są wprowadzane kolejno przez łącznie 3 godziny. Ten schemat został opracowany na podstawie pracy Prober et al., 2006.
Jak wyglądają wykresy odpowiedzi wizualno-motorycznej? Zmierzyliśmy odpowiedzi typu ON i OFF ryb WT na przyrosty i spadki natężenia światła. Aby potwierdzić, że odpowiedzi te zależą od funkcji oczu, zmierzyliśmy aktywność mutantów chk, które nie rozwijają oczu. Rycina 4 przedstawia średnią aktywność uzyskaną od zwierząt WT oraz mutantów chk. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Wykres odpowiedzi na światło pokazujący średnią aktywność w próbkach wt i chk w warunkach włączenia/wyłączenia światła." width="489" height="212" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4: Ryby WT wykazują wyraźne odpowiedzi ON i OFF, które są pośredniczone przez oczy boczne. Zachowanie lokomocyjne larw zebrafish w 5 dpf w odpowiedzi na 30 minut włączonego światła (ON) i 30 minut wyłączonego światła (OFF) jest rejestrowane w odstępach sekundowych. Każda linia reprezentuje średnią z 480 odpowiedzi od 120 poszczególnych larw WT (linia niebieska) lub mutantów chk (linia pomarańczowa) zarejestrowanych w ciągu 3 eksperymentów. Mutanty chk nie zwiększają znacząco swojej aktywności ani w odpowiedzi na przyrosty, ani na spadki natężenia światła i wykazują niski bazowy poziom aktywności. Rycina ta została opracowana na podstawie pracy Emran et al., 2007.
Reakcje wzrokowo-ruchowe u ryb z mutacją nrc. Na podstawie testu OKR uważano, że mutant nrc jest całkowicie ślepy. U mutanta nrc zakończenia fotoreceptorów nie tworzą się prawidłowo, a szlak wzrokowy On jest poważnie zaburzony 1. Rejestracje z komórek zwojowych siatkówki u tych mutantów wykazały, że wykazują one głównie odpowiedzi komórek zwojowych typu OFF, niektóre nieprawidłowe odpowiedzi ON-OFF, ale żadnych czystych odpowiedzi typu On 2.
Za pomocą testu VMR wykazaliśmy, że mutant nrc wykazuje prawidłową odpowiedź na wyłączenie światła (OFF-response) oraz opóźnioną i powolną odpowiedź na włączenie światła (ON-response) (patrz Rysunek 5). Zatem mutant nrc nie jest całkowicie ślepy, jak wcześniej sądzono 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Wykres porównujący odpowiedź na włączenie/wyłączenie światła u ryb wt i nrc; przedstawia średnią aktywność w czasie, wynik eksperymentalny." width="591" height="244" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5: Mutanty Nrc zwiększają swoją aktywność w odpowiedzi na zmiany natężenia światła. Reakcje behawioralne na włączenie (ON) i wyłączenie (OFF) światła u larw WT oraz mutantów nrc w 5 dpf. Każda linia reprezentuje średnią z 480 reakcji od 120 poszczególnych ryb każdego genotypu. Średnia aktywność lokomotoryczna mutantów nrc (różowe linie) jest nieznacznie obniżona w porównaniu z rybami WT (niebieskie linie), lecz pozostaje intensywna po bodźcu wyłączenia światła. Zwróć uwagę na powolny czas narastania odpowiedzi mutantów nrc na włączenie światła w porównaniu z odpowiedzią ryb WT na włączenie światła.

<ol><li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li>
<li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li>
<li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocretin%2Forexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish%22">The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
</ol>

Procedury eksperymentalne przedstawione w filmie są reprezentatywne dla ryb typu WT. Jednakże eksperymenty te można przeprowadzić analogicznie również na rybach mutantach (patrz sekcja wyników reprezentatywnych). W celu optymalizacji kontroli sugerujemy rozmieszczenie ryb typu WT i mutantów na tej samej płytce w układzie szachownicy.
Podczas używania ryb mutantów na tej samej płytce co ryby WT należy upewnić się, że zapisano, jaki typ ryby został umieszczony w każdej studzience. Oto sugestia,...

<table><tbody><tr><td>Urządzenia do mikropłytek</td><td>Narzędzie</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>7701-1651</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Narzędzie</td><td>VWR international</td><td>202205</td><td></td></tr><tr><td>Woda dla ryb</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>patrz odniesienie #4</td></tr><tr><td>Komory rejestracyjne (Zebrabox)</td><td>Narzędzie</td><td>Viewpoint Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Videotrack</td><td>Narzędzie</td><td>Viewpoint Lifesciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Odruch optokinetyczny (OKR) to podstawowy odruch wzrokowy występujący u większości kręgowców, który odgrywa istotną rolę w stabilizacji oka względem sceny wizualnej. OKR wymaga jednak, aby zwierzę wykryło ruchome pasy, w związku z czym jest możliwe, że ryby niewykazujące OKR nie są całkowicie ślepe. Jeden z mutantów danio-ostrosejanów, no optokinetic response c (nrc), nie wykazuje OKR w żadnych testowanych warunkach oświetleniowych i według doniesień jest całkowicie ślepy. Wcześniej wykazaliśmy, że u tych mutantów można zarejestrować aktywność komórek zwojowych typu OFF. Aby ustalić, czy ryby mutanty bez OKR, takie jak mutant nrc, potrafią wykrywać proste przyrosty i spadki natężenia światła, opracowaliśmy test behawioralny reakcji motorycznej na światło (VMR). W tym teście pojedyncze larwy danio-ostrosejanów umieszcza się w poszczególnych dołkach płytki 96-dołkowej, co pozwala na jednoczesny monitoring larw przy użyciu zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo. Zarejestrowano i ilościowo określono odpowiedzi lokomocyjne każdej larwy na 30 minut włączenia światła (light ON) oraz 30 minut wyłączenia światła (light OFF). Ryby typu dzikiego (WT) wykazują krótki skok aktywności motorycznej po włączeniu światła, znany jako reakcja przestrachu (startle response), po którym następuje powrót do aktywności niższej niż bazowa, nazywany zamrożeniem (freeze). Ryby WT gwałtownie zwiększają również aktywność lokomocyjną bezpośrednio po wyłączeniu światła i dopiero stopniowo (w ciągu kilku minut) wracają do bazowej aktywności lokomocyjnej. Mutanty nrc reagują na wyłączenie światła podobnie jak ryby WT, jednak wykazują niewielki spadek średniej aktywności w porównaniu z rybami WT. Aktywność motoryczna w odpowiedzi na włączenie światła u mutantów nrc jest opóźniona i powolna. Czas narastania odpowiedzi mutantów nrc na włączenie światła jest dłuższy w porównaniu z odpowiedzią ryb WT. Wyniki te wskazują, że ryby nrc nie są całkowicie ślepe. Ponieważ ryby kostrasteowe mogą wykrywać światło za pomocą tkanek pozasiatkówkowych, potwierdziliśmy, że natychmiastowe reakcje behawioralne na zmiany natężenia światła wymagają nienaruszonych oczu, wykorzystując mutanty chokh (chk), które całkowicie nie posiadają oczu od najwcześniejszych stadiów rozwoju. W naszym teście VMR mutanty chk nie wykazują reakcji przestrachu ani na włączenie, ani na wyłączenie światła, co dowodzi, że oczy boczne pośredniczą w tym zachowaniu. Opisany tutaj test VMR uzupełnia uznany test OKR, który nie sprawdza zdolności larw danio-ostrosejanów do reagowania na zmiany natężenia światła. Dodatkowo automatyzacja testu VMR sprzyja wysokoprzepustowemu przesiewowi w kierunku wad w odpowiedziach wzrokowych wywołanych natężeniem światła.

Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

Odruch optokinetyczny (OKR) to podstawowy odruch wzrokowy występujący u większości kręgowców, który odgrywa istotną rolę w stabilizacji oka względem...

W laboratorium Dowlinga badamy fizjologię i rozwój siatkówki u danio przebrany, aby ustalić, czy mutanty danio przebrany, które nie są w stanie wykrywać ruchu, potrafią wykrywać światło i nie są ślepe. W tym celu badamy ich wizualną odpowiedź ruchową (VMR). Zebrytki zbieramy około czwartego dnia po zapłodnieniu.Umieść je w płytkach 96-dołkowych, przygotuj odpowiedni zestaw do obrazowania, zsynchronizuj oprogramowanie do śledzenia wideo z płytką, a następnie monitoruj odpowiedź motoryczną ryb po przejściu z jasności do ciemności lub z ciemności do jasności, co nazywamy VMR. Cześć, jestem Farida Imran z laboratorium Johna Dowlinga i Katedry Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Harvarda.A ja jestem Jason Rio. Pochodzę z laboratorium Alexandra Sheara, również z wydziału biologii molekularnej i komórkowej na Uniwersytecie Harvarda. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu wizualną odpowiedź motoryczną danio prążkowanego na zwiększenia i zmniejszenia natężenia światła.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć test odpowiedzi motorycznej na bodziec wzrokowy, najpierw wyhoduj larwy dzikiego typu danio prążkowanego w cyklu światło-ciemność w temperaturze 28 °C do co najmniej czwartego dnia po zapłodnieniu. W celu uzyskania najlepszych wyników behawioralnych stosujemy typowy cykl światło-ciemność: 14 godzin światła zaczynając od godziny 9:00 i 10 godzin ciemności zaczynając od godziny 23:00.Należy unikać zbyt dużego zagęszczenia larw. Zazwyczaj w jednej szalce Petri trzymamy nie więcej niż 50 larw. Pięć dni po zapłodnieniu przenosimy danio przebrwne do płytki 96-dołkowej o objętości dołka 650 µL, aby zapewnić larwom dużą przestrzeń do pływania.Za pomocą plastikowej pipety transferowej delikatnie przenieś jedną larwę do każdego dołka. Po przeniesieniu ryb do dołków, wypełnij każdy z nich odpowiednią ilością wody dla ryb, tak aby powierzchnia wody była niemal zlicowana z górną krawędzią dołków. Należy uważać, aby nie przepełnić ani nie niedopełnić dołków, aby uniknąć problemów optycznych podczas rejestracji obrazu przez kamerę.Należy również uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do dołków. Ryby są teraz gotowe do monitorowania ich reakcji lokomocyjnych na światło i ciemność. Przenieśmy przygotowane danio pręgowane do aparatury rejestrującej.Przejdźmy teraz do omówienia aparatury rejestrującej. Płytka 96-dołkowa z rybami zostanie umieszczona w komorze rejestracyjnej, tutaj w białej tacy, i zabezpieczona sprężyną lub gumką recepturką. Kamera znajduje się z tyłu obudowy i jest skierowana na płytkę za pomocą luster zamontowanych na górze obudowy w tym miejscu.Kąt nachylenia tych luster można regulować, obracając śruby mocujące lustra. Komora rejestracyjna jest oświetlona od dołu za pomocą diod LED emitujących podczerwień. Pozwala to kamerze na rejestrowanie ryb nawet w ciemności.Larwy nie wykrywają światła IR, zatem ta stała iluminacja IR nie wpływa na przebieg eksperymentu. Białe diody LED również oświetlają komorę rejestracyjną od dołu. Są one sterowane oddzielnie od świateł IR w przypadku eksperymentów trwających dłużej niż kilka godzin.Komorę można wypełnić powoli płynącą wodą, aby pomóc w utrzymaniu stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu. Woda jest pompowana z rezerwuaru za pomocą małej pompy akwariowej i podgrzewana do 28 stopni za pomocą typowej grzałki akwariowej. Woda odpływa przez duży otwór odpływowy i jest recyrkulowana do rezerwuaru, aby zminimalizować przypadkowe wibracje w pomieszczeniu.Cała jednostka rejestrująca spoczywa na ciężkim stole balansującym. Gdy aparat rejestrujący jest gotowy, pokrywa pudełka służy do przykrycia zwierząt i ich dodatkowej izolacji od światła. Przejdźmy teraz do ustawienia 96.Płytka wielodołkowa wraz z siatką komputerową oprogramowania do śledzenia wideo w celu wykonania tego w pierwszej kolejności, płyta 96-dołkowa zawierająca ryby w komorze rejestracyjnej. Podczas stosowania kąpieli wodnej w eksperymentach długoterminowych należy powoli umieścić płytkę w wodzie, pozwalając poziomowi wody dostosować się bez rozlania na płytkę. W oprogramowaniu ViewPoint do śledzenia wideo należy upewnić się, że wszystkie larwy oraz przebieg eksperymentu są widoczne na ekranie komputera.Za pomocą elementów sterujących oprogramowania dopasuj siatkę programu do śledzenia wideo do dołków płytki 96-dołkowej w taki sposób, aby każda ryba znajdowała się wewnątrz jednego pola siatki. Krok ten jest bardzo istotny dla wszystkich rejestracji. Komputer do śledzenia będzie obliczał ruch oddzielnie dla każdego z tych pól.W przypadku błędnego ustawienia siatki komputerowej niektóre ruchy ryb mogą zostać utracone lub, co gorsza, dwie sąsiednie ryby mogą zająć ten sam obszar i po wyrównaniu zostać policzone jako jedna ryba. Czas włączania i wyłączania świateł jest zaprogramowany w komputerze.Zazwyczaj pozwalamy larwom na trzygodzinną adaptację do ciemności w pudełku. Pozwala to nie tylko na uzyskanie bazowego poziomu aktywności, ale także daje larwom możliwość uspokojenia się po pipetowaniu i manipulowaniu. Następnie zamykamy drzwi komory rejestracyjnej i rozpoczynamy nagrywanie.W praktyce rejestrujemy aktywność każdej ryby na sekundę, jednak oprogramowanie ViewPoint w rzeczywistości zapisuje dane klatka po klatce. Poniżej ekranu widoczny jest ślad w czasie rzeczywistym dla pojedynczej ryby. W odniesieniu do ruchu pikseli, biała linia wskazuje, że liczba zmian pikseli znajduje się poniżej ustalonego progu, natomiast zielona linia oznacza, że zmiana pikseli przekracza ustawioną wartość progu.Wartość progowa będzie w pewnym stopniu zależna od konkretnej kamery i konfiguracji oświetlenia. W naszej konfiguracji zazwyczaj stosujemy próg czterech pikseli. Oznacza to, że jeśli zmienia się mniej niż cztery piksele, jest to uznawane za tło.Jeśli przemieszcza się więcej niż cztery piksele, wskazuje to na ruch ryby. Empirycznie ustalono, że taka wartość progowa pozwala wykryć niemal wszystkie ruchy pływające i obrotowe larw. Mimo że komory rejestracyjne dość dobrze izolują larwy, nadal wyłączamy światło w pomieszczeniu i dbamy o zminimalizowanie zakłóceń w postaci hałasu mechanicznego, takiego jak otwieranie i zamykanie drzwi w pokoju, organizowanie imprez tanecznych czy wykonywanie ćwiczeń fizycznych.Po zakończeniu eksperymentu przenieś zebrane dane do arkusza Excel lub do preferowanego pakietu analitycznego. Tak wyglądają dane. Zawierają one czas w sekundach od rozpoczęcia eksperymentu oraz aktywność każdej larwy na sekundę.Poniżej znajduje się wykres przedstawiający aktywność pojedynczej larwy przez cały czas trwania eksperymentu, z kilkoma odpowiedziami typu „włącz/wyłącz” (on/off) wskazanymi strzałkami na wykresie. Ten wykres pokazuje średnią aktywność 40 ryb przez cały czas trwania eksperymentu, z kilkoma odpowiedziami typu „włącz/wyłącz”, na co wskazują strzałki. Jak widać, odpowiedzi typu „włącz/wyłącz” są wyraźne i powtarzalne.Ten eksperyment z odpowiedzią motoryczną na bodźce wzrokowe można przeprowadzić również na rybach mutantach. W celu uzyskania optymalnej kontroli, w takich badaniach zazwyczaj umieszczamy ryby typu dzikiego i ryby mutanty na jednej płytce w układzie szachownicy. Używając ryb mutantów i ryb typu dzikiego na tej samej płytce, należy dokładnie zapisać, jaki typ ryby został umieszczony w każdej studzience.Oto sugestia, jak śledzić ryby umieszczone w każdej z nich. Przedstawiamy wyniki odpowiedzi motorycznej w formie wizualnej, które porównują larwy typu dzikiego i mutanty. Ponownie obserwujemy wyraźne i spójne odpowiedzi typu „włącz/wyłącz” u larw typu dzikiego.Jednak larwy mutanta chalk, u których nie rozwija się oko, nie zwiększają znacząco swojej aktywności ani w odpowiedzi na wzrost, ani na spadek natężenia światła i wykazują niski podstawowy poziom aktywności. Wyniki te porównują odpowiedzi typu dzikiego z mutantami NO OKR, zwanymi również mutantami NRC. Na podstawie testu OKR uważano, że mutant NRC jest całkowicie ślepy.Wykorzystując test VMR, wykazujemy, że mutant NRC wykazuje prawidłową reakcję „off” oraz opóźnioną i powolną reakcję „on”. Zatem mutant NRC nie jest całkowicie ślepy, jak wcześniej przypuszczano. Przedstawiliśmy właśnie wizualną odpowiedź motoryczną (visual motor response) danio przebrósionego na przyrosty i spadki natężenia światła.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przeprowadzaniu eksperymentu w ciągu dnia, ponieważ ryby są bardziej aktywne i bardziej reaktywne na zmiany natężenia światła w dzień niż w nocy. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-behavioral-assay-to-measure-responsiveness-zebrafish-to-changes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test behawioralny do pomiaru reakcji danio pręgowanego na zmiany natężenia światła 

Ten film opisuje test reakcji fotomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Protokół mierzy reakcję behawioralną larw ryb po nagłej zmianie warunków oświetleniowych.

Test odpowiedzi fotomotorycznej: metoda pomiaru reakcji behawioralnej larw danio pręgowanego na nagłą zmianę warunków oświetleniowych

Film opisuje test preferencji jasnego i ciemnego w celu zbadania zachowania związanego z lękiem u danio pręgowanego po ekspozycji na etanol.

Test preferencji jasno-ciemnej: metoda badania zachowań związanych z lękiem u danio pręgowanego

Ten film opisuje test odpowiedzi optokinetycznej u danio pręgowanego. Film mierzy odruchowe ruchy gałek ocznych w oparciu o bodźce wzrokowe poruszające się i określa ostrość wzroku u danio pręgowanego.

Test odpowiedzi optokinetycznej: metoda pomiaru ostrości wzroku u danio pręgowanego

Film opisuje unikanie i testowanie metodą thigmotaxis larw danio pręgowanego. Film bada zachowanie larw danio pręgowanego w odpowiedzi na wizualny bodziec awersyjny.

Test unikania danio pręgowanego i thigmotaxsji: wysokoprzepustowa metoda badania zachowania larw w odpowiedzi na awersyjny bodziec wzrokowy

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Wyjaśniono nowatorską metodę zmniejszania zmienności podczas wystawiania ryb na działanie narkotyków.  Stwierdzono, że ryby wystawione na różne wzorce ekspozycji na etanol miały zmieniony poziom lęku podczas odstawienia w teście skotoksji jasnej/ciemnej.

Nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (Danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę behawioralnego pomiaru stresu u dorosłego gryba. Podejście to wykorzystuje wrodzoną tendencję do tego, że danio pręgowany preferuje dolną połowę zbiornika, gdy jest w stanie stresu. Opisano również metody sprzężenia testu z farmakologią.

Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Protokół ten ustanawia paradygmat fenotypowania behawioralnego u larw danio objętych zabiegiem MPTP, aby ocenić deficyty ruchowe i niemotoryczne podobne do choroby Parkinsona.

Profilowanie fenotypowe fenotypów behawioralnych podobnych do parkinsońskiego wywołanych MPTP u larw danio pręgowanego na podstawie eksperymentu behawioralnego

Poznaj test behawioralny VMR do oceny reakcji wzrokowo-ruchowej larw Danio rerio na zmiany natężenia światła. Metoda pozwala badać zdolności wzrokowe mutantów, w tym wcześniej uznawanych za niewidome.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

Przeglądaj więcej filmów