Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

W laboratorium Dowlinga badamy fizjologię i rozwój siatkówki u danio przebrany, aby ustalić, czy mutanty danio przebrany, które nie są w stanie wykrywać ruchu, potrafią wykrywać światło i nie są ślepe. W tym celu badamy ich wizualną odpowiedź ruchową (VMR). Zebrytki zbieramy około czwartego dnia po zapłodnieniu.

Umieść je w płytkach 96-dołkowych, przygotuj odpowiedni zestaw do obrazowania, zsynchronizuj oprogramowanie do śledzenia wideo z płytką, a następnie monitoruj odpowiedź motoryczną ryb po przejściu z jasności do ciemności lub z ciemności do jasności, co nazywamy VMR. Cześć, jestem Farida Imran z laboratorium Johna Dowlinga i Katedry Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Harvarda.

A ja jestem Jason Rio. Pochodzę z laboratorium Alexandra Sheara, również z wydziału biologii molekularnej i komórkowej na Uniwersytecie Harvarda. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu wizualną odpowiedź motoryczną danio prążkowanego na zwiększenia i zmniejszenia natężenia światła.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć test odpowiedzi motorycznej na bodziec wzrokowy, najpierw wyhoduj larwy dzikiego typu danio prążkowanego w cyklu światło-ciemność w temperaturze 28 °C do co najmniej czwartego dnia po zapłodnieniu. W celu uzyskania najlepszych wyników behawioralnych stosujemy typowy cykl światło-ciemność: 14 godzin światła zaczynając od godziny 9:00 i 10 godzin ciemności zaczynając od godziny 23:00.

Należy unikać zbyt dużego zagęszczenia larw. Zazwyczaj w jednej szalce Petri trzymamy nie więcej niż 50 larw. Pięć dni po zapłodnieniu przenosimy danio przebrwne do płytki 96-dołkowej o objętości dołka 650 µL, aby zapewnić larwom dużą przestrzeń do pływania.

Za pomocą plastikowej pipety transferowej delikatnie przenieś jedną larwę do każdego dołka. Po przeniesieniu ryb do dołków, wypełnij każdy z nich odpowiednią ilością wody dla ryb, tak aby powierzchnia wody była niemal zlicowana z górną krawędzią dołków. Należy uważać, aby nie przepełnić ani nie niedopełnić dołków, aby uniknąć problemów optycznych podczas rejestracji obrazu przez kamerę.

Należy również uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do dołków. Ryby są teraz gotowe do monitorowania ich reakcji lokomocyjnych na światło i ciemność. Przenieśmy przygotowane danio pręgowane do aparatury rejestrującej.

Przejdźmy teraz do omówienia aparatury rejestrującej. Płytka 96-dołkowa z rybami zostanie umieszczona w komorze rejestracyjnej, tutaj w białej tacy, i zabezpieczona sprężyną lub gumką recepturką. Kamera znajduje się z tyłu obudowy i jest skierowana na płytkę za pomocą luster zamontowanych na górze obudowy w tym miejscu.

Kąt nachylenia tych luster można regulować, obracając śruby mocujące lustra. Komora rejestracyjna jest oświetlona od dołu za pomocą diod LED emitujących podczerwień. Pozwala to kamerze na rejestrowanie ryb nawet w ciemności.

Larwy nie wykrywają światła IR, zatem ta stała iluminacja IR nie wpływa na przebieg eksperymentu. Białe diody LED również oświetlają komorę rejestracyjną od dołu. Są one sterowane oddzielnie od świateł IR w przypadku eksperymentów trwających dłużej niż kilka godzin.

Komorę można wypełnić powoli płynącą wodą, aby pomóc w utrzymaniu stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu. Woda jest pompowana z rezerwuaru za pomocą małej pompy akwariowej i podgrzewana do 28 stopni za pomocą typowej grzałki akwariowej. Woda odpływa przez duży otwór odpływowy i jest recyrkulowana do rezerwuaru, aby zminimalizować przypadkowe wibracje w pomieszczeniu.

Cała jednostka rejestrująca spoczywa na ciężkim stole balansującym. Gdy aparat rejestrujący jest gotowy, pokrywa pudełka służy do przykrycia zwierząt i ich dodatkowej izolacji od światła. Przejdźmy teraz do ustawienia 96.

Płytka wielodołkowa wraz z siatką komputerową oprogramowania do śledzenia wideo w celu wykonania tego w pierwszej kolejności, płyta 96-dołkowa zawierająca ryby w komorze rejestracyjnej. Podczas stosowania kąpieli wodnej w eksperymentach długoterminowych należy powoli umieścić płytkę w wodzie, pozwalając poziomowi wody dostosować się bez rozlania na płytkę. W oprogramowaniu ViewPoint do śledzenia wideo należy upewnić się, że wszystkie larwy oraz przebieg eksperymentu są widoczne na ekranie komputera.

Za pomocą elementów sterujących oprogramowania dopasuj siatkę programu do śledzenia wideo do dołków płytki 96-dołkowej w taki sposób, aby każda ryba znajdowała się wewnątrz jednego pola siatki. Krok ten jest bardzo istotny dla wszystkich rejestracji. Komputer do śledzenia będzie obliczał ruch oddzielnie dla każdego z tych pól.

W przypadku błędnego ustawienia siatki komputerowej niektóre ruchy ryb mogą zostać utracone lub, co gorsza, dwie sąsiednie ryby mogą zająć ten sam obszar i po wyrównaniu zostać policzone jako jedna ryba. Czas włączania i wyłączania świateł jest zaprogramowany w komputerze.

Zazwyczaj pozwalamy larwom na trzygodzinną adaptację do ciemności w pudełku. Pozwala to nie tylko na uzyskanie bazowego poziomu aktywności, ale także daje larwom możliwość uspokojenia się po pipetowaniu i manipulowaniu. Następnie zamykamy drzwi komory rejestracyjnej i rozpoczynamy nagrywanie.

W praktyce rejestrujemy aktywność każdej ryby na sekundę, jednak oprogramowanie ViewPoint w rzeczywistości zapisuje dane klatka po klatce. Poniżej ekranu widoczny jest ślad w czasie rzeczywistym dla pojedynczej ryby. W odniesieniu do ruchu pikseli, biała linia wskazuje, że liczba zmian pikseli znajduje się poniżej ustalonego progu, natomiast zielona linia oznacza, że zmiana pikseli przekracza ustawioną wartość progu.

Wartość progowa będzie w pewnym stopniu zależna od konkretnej kamery i konfiguracji oświetlenia. W naszej konfiguracji zazwyczaj stosujemy próg czterech pikseli. Oznacza to, że jeśli zmienia się mniej niż cztery piksele, jest to uznawane za tło.

Jeśli przemieszcza się więcej niż cztery piksele, wskazuje to na ruch ryby. Empirycznie ustalono, że taka wartość progowa pozwala wykryć niemal wszystkie ruchy pływające i obrotowe larw. Mimo że komory rejestracyjne dość dobrze izolują larwy, nadal wyłączamy światło w pomieszczeniu i dbamy o zminimalizowanie zakłóceń w postaci hałasu mechanicznego, takiego jak otwieranie i zamykanie drzwi w pokoju, organizowanie imprez tanecznych czy wykonywanie ćwiczeń fizycznych.

Po zakończeniu eksperymentu przenieś zebrane dane do arkusza Excel lub do preferowanego pakietu analitycznego. Tak wyglądają dane. Zawierają one czas w sekundach od rozpoczęcia eksperymentu oraz aktywność każdej larwy na sekundę.

Poniżej znajduje się wykres przedstawiający aktywność pojedynczej larwy przez cały czas trwania eksperymentu, z kilkoma odpowiedziami typu „włącz/wyłącz” (on/off) wskazanymi strzałkami na wykresie. Ten wykres pokazuje średnią aktywność 40 ryb przez cały czas trwania eksperymentu, z kilkoma odpowiedziami typu „włącz/wyłącz”, na co wskazują strzałki. Jak widać, odpowiedzi typu „włącz/wyłącz” są wyraźne i powtarzalne.

Ten eksperyment z odpowiedzią motoryczną na bodźce wzrokowe można przeprowadzić również na rybach mutantach. W celu uzyskania optymalnej kontroli, w takich badaniach zazwyczaj umieszczamy ryby typu dzikiego i ryby mutanty na jednej płytce w układzie szachownicy. Używając ryb mutantów i ryb typu dzikiego na tej samej płytce, należy dokładnie zapisać, jaki typ ryby został umieszczony w każdej studzience.

Oto sugestia, jak śledzić ryby umieszczone w każdej z nich. Przedstawiamy wyniki odpowiedzi motorycznej w formie wizualnej, które porównują larwy typu dzikiego i mutanty. Ponownie obserwujemy wyraźne i spójne odpowiedzi typu „włącz/wyłącz” u larw typu dzikiego.

Jednak larwy mutanta chalk, u których nie rozwija się oko, nie zwiększają znacząco swojej aktywności ani w odpowiedzi na wzrost, ani na spadek natężenia światła i wykazują niski podstawowy poziom aktywności. Wyniki te porównują odpowiedzi typu dzikiego z mutantami NO OKR, zwanymi również mutantami NRC. Na podstawie testu OKR uważano, że mutant NRC jest całkowicie ślepy.

Wykorzystując test VMR, wykazujemy, że mutant NRC wykazuje prawidłową reakcję „off” oraz opóźnioną i powolną reakcję „on”. Zatem mutant NRC nie jest całkowicie ślepy, jak wcześniej przypuszczano. Przedstawiliśmy właśnie wizualną odpowiedź motoryczną (visual motor response) danio przebrósionego na przyrosty i spadki natężenia światła.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przeprowadzaniu eksperymentu w ciągu dnia, ponieważ ryby są bardziej aktywne i bardziej reaktywne na zmiany natężenia światła w dzień niż w nocy. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.