Immunoprecypitacja metylowanego DNA

Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji metylowanego DNA lub spotkania. Metoda stosowana do specyficznej izolacji metylowanego DNA w bezstronny sposób. Metylacja DNA u ssaków charakteryzuje się dodaniem grupy metylowej do pozycji C pięć cytozyny.

Gdy jest obecny w dinukleotydzie CPG, jest odwracalnym znakiem epigenetycznym, który odgrywa ważną rolę w prawidłowym rozwoju, a także w kilku procesach chorobowych. Normalne funkcje metylacji DNA obejmują inaktywację chromosomu X u kobiet, wyciszanie powtarzających się elementów, imprinting genomowy i utrzymanie stabilności genomu. Wykazano również, że metylacja DNA odgrywa rolę w wielu chorobach, takich jak rak, zespół der Williego, zespół Engelmana i niedobór odporności, niestabilność centryczna i zespół anomalii twarzy.

Na przykład w nowotworach nieprawidłowa hipermetylacja i promotory mogą powodować wyciszenie ważnych genów supresorowych guza. Podczas gdy niewłaściwa hipometylacja powoduje niestabilność chromosomów i aktywację onkogenu, meetup odbywa się poprzez pierwsze soniczne przecięcie DNA na fragmenty o wielkości od 300 do 1000 par zasad. Sonikowane DNA jest następnie denaturowane w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Przeciwciała pierwszorzędowe, które rozpoznają pięć głównych metazyn, są dodawane i pozwala im związać metylowane fragmenty DNA. Przeciwciała drugorzędowe, sprzężone z magnetycznymi kulkami dyny, służą do izolowania fragmentów DNA, które zostały związane przez przeciwciało pierwszorzędowe. Niemetylowane fragmenty są usuwane, a przeciwciała są trawione przez proteinazę.

Oczyszczanie chloroformu fenylowego KA usuwa strawione białko, a wytrącanie oczyszcza DNA, które jest teraz wzbogacone o fragmenty metylowane. Meetup, DNA może być używany do zastosowań takich jak mikromacierz PCR i sekwencjonowanie. Meetup jest zazwyczaj wykonywany jako procedura dwudniowa.

Dzień pierwszy obejmuje przygotowanie DNA, sonikację, immunoprecypitację i trawienie białek. Dzień drugi obejmuje ekstrakcję chloroformem pH i wytrącanie etanolu w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA wzbogaconego do metylacji. Istnieje kilka specjalnych materiałów, które są wymagane do spotkania, w tym silikonowane probówki wirówkowe, urządzenie do uspokajania DNA, przeciwciało pierwotne, mysz anty five prime metazyna, przeciwciało monoklonalne, przeciwciało wtórne, kulki dyna, sprzężone z owcami, anty-US IgG i stojak na probówki magnetyczne.

Pierwszym krokiem w protokole meetupu jest przygotowanie DNA. Konieczna jest wcześniejsza ocena charakteru DNA. Znajomość stanu DNA próbki, niezależnie od tego, czy jest ona przede wszystkim dwuniciowa, czy jednoniciowa, jest wymagana, ponieważ dokładna ocena ilościowa próbki ma ogromne znaczenie, a obecność niepożądanych gatunków DNA może mieć negatywny wpływ na różne metody określania ilości DNA.

Ilość dwuniciowego DNA można łatwo ocenić za pomocą fotometrii spektralnej za pomocą NanoDrop 3, 300 nd load 1,5 mikrolitra i ustawić typ pomiaru na kwas nukleinowy, wybrać DNA 50 jako obliczenie i zainicjować instrument 1,5 mikrolitra wody. Oczyść cokoły i zaślep instrument 1,5 mikrolitra płynu. Próbkę rozpuszcza się w czystych cokołach, obciąża 1,5 mikrolitra próbki i uderza w miarę.

Stężenie zostanie podane i można je wykorzystać. Aby obliczyć liczbę potrzebnych mi mikrolitrów, zanurz tutaj stosunek A dwa 60 do dwóch 80 wynoszący 1,8. Przygotowuje się próbkę o wielkości jednego mikrograma.

Jednak próbka o wielkości zaledwie 200 nanogramów wystarczy, aby uzyskać pomyślne wyniki. Na spotkanie załaduj próbkę DNA do czystej silikonowanej probówki. Dodaj tyle sterylnej wody, aby doprowadzić końcową objętość do 50 mikrolitrów.

Sonizacja DNA i immunoprecypitacja muszą być wykonywane w silikonowanych probówkach, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu DNA i białek ze ściankami probówki. Po przygotowaniu DNA próbka musi być wymagana do fragmentacji DNA wymagana jest sonikacja soniczna, ponieważ immunoprecypitacja jest bardziej wydajna w przypadku mniejszych fragmentów DNA, załaduj próbkę do soniku, upewnij się, że ustawienie mocy jest ustawione na wysokie i że maszyna jest ustawiona na 30 sekund. Po 30 sekundach przerwy napełnij bazę do linii napełniania wodą o czterech stopniach Celsjusza.

Sonikować próbkę przez siedem minut. Po zakończeniu sonikacji wyjmij rurkę i połóż ją na lodzie. Ważne jest, aby wcześniej zoptymalizować warunki sonikacji dla przewidywanej próbki, wielkości DNA.

Na przykład częściowo zdegradowana próbka DNA będzie wymagała krótszego czasu sonikacji. Produkty sonikacji mogą być wizualizowane za pomocą standardowych technik elektroforetycznych. Fragmenty DNA o długości od 300 do 1000 par zasad są w tym momencie pożądane do późniejszego wykorzystania.

W testach mikromacierzowych i PCR należy zarezerwować jedną piątą swojego DNA, aby służyła jako DNA wejściowe lub referencyjne, w tym przypadku 800 nanogramów sonikowanego DNA zostanie użyte do immunoprecypitacji, a pozostała część zostanie odłożona na bok jako DNA referencyjne. Kolejnym krokiem w protokole pożywki jest immunoprecypitacja lub reakcja IP przed dodaniem przeciwciała pierwszorzędowego, DNA musi zostać zdenaturowane. Denaturacja jest wymagana, ponieważ pierwszorzędowe przeciwciało jest wrażliwe na jednoniciowe DNA.

Umieścić próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni Celsjusza na 10 minut. Po zakończeniu etapu denaturacji natychmiast przenieś probówkę do lodu na co najmniej pięć minut. Zapobiegnie to klęczeniu zdenaturowanego DNA Reena i pozwoli na optymalne wiązanie przeciwciał po ostygnięciu próbki.

Krótko zakręć rurką, aby wyciągnąć zawartość na dno. Następnie należy dodać przeciwciało pierwszorzędowe. Ilość użytego przeciwciała powinna być miareczkowana dla każdej partii i dla każdego producenta.

W takim przypadku dodajemy pięć mikrogramów przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie dodajemy bufor immunoprecypitacyjny lub bufor IP do końcowej objętości 500 mikrolitrów. Następnie DNA IP umieszcza się w rotatorze i pozostawia do inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Rotacja jest wymagana, aby zapobiec konglomeracji przeciwciał w probówce podczas inkubacji.

Około 15 minut przed zakończeniem inkubacji przeciwciał pierwotnych oczyść i przygotuj magnetyczne kulki dyna. Najpierw dokładnie zawiesić kulki w fiolce przez wirowanie. Następnie przenieś 30 mikrolitrów kulek do czystej silikonowanej probówki i umieść tę rurkę na stojaku magnetycznym w celu przeprowadzenia wielu reakcji.

Przenieś 30 mikrolitrów kulek na reakcję, plus tyle na jedną dodatkową reakcję, aby umożliwić błąd pipetowania lub niezamierzoną utratę niektórych kulek. Na przykład dla ośmiu reakcji. Usuń wystarczającą ilość kulek na dziewięć reakcji lub 270 mikrolitrów.

Koraliki magnetyczne zostaną przyciągnięte w kierunku ściany stojaka magnetycznego. Odczekaj dwie minuty, aż koraliki przeniosą się i osiądą w wyraźną smugę na ściance rurki. Następnie wyjmij i ostrożnie wyrzuć pipetę supernatantu, uważając, aby nie naruszyć koralików na tylnej ściance końcówką pipety.

Zastąp supernatant nadmiarem objętości wiru buforowego IP i umieść go z powrotem na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Powtórz to pranie jeszcze raz i ponownie zawieś koraliki prania w ich pierwotnej objętości bufora IP. Pobrać probówkę z próbką z rotatora po zakończeniu inkubacji.

Aby zakończyć immunoprecypitację, dodaj 30 mikrolitrów czystych kulek do reakcji i umieść rurkę z powrotem w rotatorze na dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas tej inkubacji przeciwciało drugorzędowe, które jest przeciwciałem anty mysim IgG, zwiąże się z pierwszorzędowym przeciwciałem myszy. Przeciwciała antymysie są sprzężone z magnetycznymi kulkami dyny, co pozwala na łatwe odzyskanie związanych produktów i następujący po nich etap oczyszczania.

Po zakończeniu inkubacji z obydwoma przeciwciałami umieść probówkę IP na stojaku magnetycznym na dwie minuty. W tym momencie zmetylowane DNA zostanie związane przez przeciwciało pierwszorzędowe, które z kolei zostanie związane przez sprzężone przeciwciało drugorzędowe z kulką dyna. Usunąć i wyrzucić supernatant i zastąpić go 500 mikrolitrami buforu IP.

Wymieszaj zawartość probówki i umieść ją z powrotem na ruszcie na dwie minuty. Powtórz to pranie z buforem IP jeszcze raz. Po usunięciu supernatantu z ostatniego płukania Resus, zawiesić kulki po raz ostatni.

W 400 mikrolitrach buforu do wytrawiania potraktuj reakcję 100 mikrogramami proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Leczenie proteinazą K jest niezbędne do trawienia białek przeciwciał i wszelkich pozostałych białek związanych z DNA, co pozwala na uwolnienie metylowanego DNA do roztworu. Oczyszczanie DNA przeprowadza się w drugim dniu procedury meetup, pobiera się probówkę trawiącą z inkubatora.

W dygestorium dodaj 500 mikrolitrów fenochloroformu jeden do jednego o pH siedem do probówki i dokładnie wiruj Wiruj rurkę przez 10 minut w temperaturze 13 000. G. Ostrożnie usuń górną fazę wodną z probówki, nie naruszając interfejsu ani nie usuwając żadnej warstwy organicznej. Przenieś fazę wodną do nowej probówki.

Drugą ekstrakcję można wykonać, jeśli interfejs wydaje się mętny. Następnie dodaj jedną dziesiątą objętość trzech molowych octanu sodu, w tym przypadku 40 mikrolitrów. Jeden mikrolitr glikogenu może być użyty jako nośnik ułatwiający oczyszczanie peletów.

Odwiruj probówkę, aby wymieszać zawartość. Następnie dodaj dwie objętości 100% etanolu, zwiruj i zamroź w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 20 minut po zamrożeniu. Wytrącone DNA jest wirowane w wirówce w temperaturze 13 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.

Na dnie probówki utworzy się osadek DNA. Wyjmij probówkę z wirówki i usuń etanol. Uważaj, aby nie naruszyć granulki na dnie tuby.

Konieczne może być pulsacyjne wirowanie w celu usunięcia resztek etanolu. Aby umyć granulkę, dodaj 500 mikrolitrów zimnego, 70% wiru etanolu i ponownie wiruj przez 20 minut w temperaturze 13 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Po zakończeniu drugiego wirowania usuń wirowanie impulsowe 70% etanolu i usuń pozostały etanol za pomocą pipety.

Pozostaw probówkę na stojaku z otwartą nakrętką, aby wysuszyć granulki i umożliwić odparowanie pozostałego etanolu. Na koniec Reus zawiesza osad zawierający tylko DNA wzbogacone do metylacji i 10 mikrolitrów sterylnej wody, dając wystarczająco dużo czasu na rozpuszczenie się granulki DNA przed użyciem. Dobrą praktyką jest walidacja biegłości w meetupie za pomocą PCR.

Można to zrobić, przeprowadzając reakcje PCR przeznaczone do amplifikacji produktów, które ilustrują zmetylowane i niemetylowane fragmenty DNA w różny sposób dla normalnych ludzkich starterów DNA. Region kontrolny imprintingu H 19 może być stosowany w połączeniu ze starterami przeznaczonymi do amplifikacji regionu genomu, który nie jest metylowany. Przykładowe sekwencje starterów i warunki cykliczne PCR można znaleźć w dołączonym protokole.

W tym momencie konieczne jest pobranie wejściowego lub referencyjnego DNA, które zostało odłożone na bok na początku protokołu spotkania. Jeden zestaw reakcji PCR zostanie skonfigurowany przy użyciu wejściowego DNA, a drugi zestaw będzie używał IP DNA wzbogaconego do metylacji. Jeśli spotkanie zakończyło się sukcesem, IP PCR wytworzy produkt przy użyciu starterów metylacji, a nie produkt przy użyciu starterów kontrolnych.

I odwrotnie, wejściowy PCR powinien wytwarzać produkty przy użyciu obu starterów, ponieważ zawiera zarówno metylowane, jak i niemetylowane. Fragmenty DNA. DNA wzbogacone o fragmenty metylowe może być wykorzystywane do wielu dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie PCR i analiza mikromacierzy.

Po zintegrowaniu z innymi technikami biologii molekularnej może być używany do badania statusu metylacji DNA w sposób specyficzny dla locus lub całego genomu do profilowania metylacji lub badania epigenomiki.