Name: Immunoprecypitacja metylowanego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Poznaj metodę immunoprecypitacji metylowanego DNA (MeDIP) do izolacji fragmentów DNA z modyfikacjami epigenetycznymi. Technika ta umożliwia badanie roli metylacji w rozwoju i chorobach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować członkom laboratoriów Brown i Lam za pomoc w recenzji tego filmu oraz artykułu. Praca ta była finansowana ze środków Canadian Institutes for Health Research oraz Michael Smith Foundation for Health Research.

IZOLACJA DNA I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK
Do procedury MeDIP można wykorzystać DNA z różnych rodzajów próbek (komórek hodowlanych, tkanek świeżo zamrożonych, a także tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie). Ważne jest użycie wysoko oczyszczonego DNA, pozbawionego białek towarzyszących, takich jak histony. Należy również usunąć z próbki jak najwięcej RNA, ponieważ może ono zakłócać zarówno oznaczanie ilości DNA, jak i wiązanie przeciwciał. Ilość DNA wykorzystywanego do MeDIP może wynosić od 200 ng do 1 µg, w zależności od dostępnej ilości DNA. W celu zademonstrowania niniejszego protokołu zostanie użyte 1 µg DNA. Poniższy protokół pozwoli na uzyskanie wysokiej jakości dwuniciowego DNA z komórek hodowlanych. W przypadku ekstrakcji DNA z innych rodzajów próbek należy zastosować inne protokoły.
<ol>
<li>Do osadu komórkowego w probówce Eppendorfa o pojemności 1,7 ml dodać 400 μl buforu do trawienia.</li>
<li>Do probówki dodać 100 μg proteinazy K i inkubować przez noc w temperaturze 50°C.</li>
<li>Dodać 500 μl fenolu o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.</li>
<li>Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.</li>
<li>Powtórzyć kroki od 3 do 5 raz.</li>
<li>Dodać 500 µl mieszaniny fenol/chloroform 1:1 o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.</li>
<li>Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.</li>
<li>Dodać 40 μg RNazy A i inkubować przez 1 h w temperaturze 37°C.</li>
<li>Dodać 500 μl fenolu o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.</li>
<li>Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.</li>
<li>Powtórzyć kroki od 11 do 13 raz.</li>
<li>Dodać 500 µl mieszaniny fenol/chloroform 1:1 o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.</li>
<li>Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.</li>
<li>Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu (40 μl) i dobrze wymieszać.</li>
<li>Dodać 2 objętości (900 μl) 100% etanolu, dobrze wymieszać i pozostawić w temperaturze -20°C na 20 min.</li>
<li>Wirować przy 13 000 g przez 20 min w temperaturze 4°C.</li>
<li>Usunąć etanol, krótko odwirować (pulse spin) i usunąć pozostałości etanolu.</li>
<li>Do przemycia dodać 500 μl zimnego 70% etanolu. Wirować przy 13 000 g przez 20 min w temperaturze 4°C.</li>
<li>Usunąć 70% etanol, krótko odwirować (pulse spin) i usunąć pozostałości etanolu za pomocą pipety.</li>
<li>Suszyć osad na powietrzu z otwartą zakrętką przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady pozostałego etanolu.</li>
<li>Resuspendować DNA w 50 μl sterylnej dH2O przez noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Oznaczyć ilość DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Idealny stosunek A260:A280 wynosi 1,8.</li>
<li>Określić jakość i zakres wielkości DNA na żelu agarozowym z markerem 100 bp. Na żelu agarozowym 1,7% można rozdzielić nawet 10 ng DNA genomicznego, a następnie przeprowadzić barwienie przy użyciu barwnika o wysokiej czułości na małe ilości DNA, takiego jak SYBR Gold.</li>
<li>W jednej silikonizowanej probówce na próbkę przygotować 1 µg DNA w całkowitej objętości 50 μl, uzupełniając pozostałą objętość sterylną dH2O.</li>
</ol>
SONIKACJA DNA
Sonikacja DNA oraz protokół MeDIP muszą być przeprowadzane w probówkach silikonizowanych, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek do ścianek probówek. Optymalny czas sonikacji próbek DNA zależy od stopnia fragmentacji DNA w próbce, określonego na podstawie elektroforezy żelowej (Krok 27). Na przykład DNA wyizolowane z hodowli komórkowych powinno mieć bardzo wysoką masę cząsteczkową i w konsekwencji będzie wymagało dłuższej sonikacji niż DNA wyizolowane z próbek archiwalnych, które są często częściowo zdegradowane. Jeśli próbki mają jednorodnie wysoką masę cząsteczkową, na tym etapie można przystąpić do sonikacji zgodnie z opisem w niniejszym protokole, bez konieczności sprawdzania każdej próbki z osobna. W przypadku próbek pofragmentowanych, tak jak w przypadku próbek archiwalnych, konieczne będzie dostosowanie procedury sonikacji, prawdopodobnie poprzez skrócenie czasu sonikacji w celu uzyskania fragmentów o długości 300-1000 bp. Jeśli planowane jest przetwarzanie próbek częściowo zdegradowanych, optymalizację parametrów sonikacji można przeprowadzić na reprezentatywnej próbce z grupy badanych materiałów. Na podstawie stopnia fragmentacji DNA zaobserwowanego w elektroforezie żelowej (Krok 27), badacz może wcześniej określić optymalny czas sonikacji dla danej próbki. W niniejszej sekcji opisujemy metodę uzyskiwania fragmentów DNA o długości 300-1000 bp poprzez sonikację za pomocą automatycznego urządzenia sonikującego (Bioruptor firmy Diagenode, UCD-200 TM) z wykorzystaniem DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.
<ol>
<li>Woda w urządzeniu Biorupter musi mieć temperaturę 4°C.</li>
<li>Sonicować przez 7 min w ustawieniach automatycznych (30 s włączone, 30 s wyłączone przy maksymalnej mocy).</li>
<li>Odebrać 800 ng (40 μl) produktu sonicowanego i przenieść do silikonizowanej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml w celu przeprowadzenia reakcji immunoprecypitacji (IP).</li>
<li>Odstawić pozostałe 200 ng (10 μl) jako referencyjne DNA wejściowe (IN) (przechowywać w temperaturze 4°C).</li>
</ol>
IMMUNOPRECYPITACJA ZMETYLOWANEGO DNA
<ol>
<li>Zdenaturuj DNA, które zostanie użyte do reakcji IP (800 ng), w kąpieli wodnej w temperaturze 95°C przez 10 min.</li>
<li>Natychmiast schłodź na lodzie. Pozostaw DNA do całkowitego ostygnięcia (około 5 min na lodzie) przed przejściem do następnego kroku.</li>
<li>Dodaj 5 μg przeciwciała monoklonalnego.</li>
<li>Dodaj bufor IP (używany w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania tego protokołu) do uzyskania objętości końcowej 500 μl.</li>
<li>Inkubuj przez 2 h w temperaturze 4°C w obrotowym uchwycie na probówki.</li>
<li>Tuż przed zakończeniem kroku 5, przygotuj Dynabeads poprzez płukanie (kroki 6-11). Najpierw dokładnie resuspenduj koraliki w fiolce za pomocą vortexa.</li>
<li>Przenieś 30 μl (~ 2 x 107) resuspendowanych Dynabeads na jedną reakcję plus jedną, do nowej probówki silikonizowanej (na przykład, przy wykonywaniu 8 reakcji, pobierz koraliki dla 9, tj. 270 μl).</li>
<li>Umieść probówkę na statywie magnetycznym na 2 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odsącz naddatek pipetą. Podczas usuwania naddatku unikaj dotykania końcówką pipety koralików przy wewnętrznej ściance (tam, gdzie koraliki przyciągają się do magnesu).</li>
<li>Zdejmij probówkę z magnesu i resuspenduj koraliki w nadmiarze buforu IP (750 μl-1000 μl). Ponownie umieść probówkę na statywie magnetycznym na 2 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Powtórz płukanie jeszcze raz, a następnie resuspenduj wypłukane koraliki w buforze IP w objętości pierwotnie pobranej w kroku 7.</li>
<li>Dodaj 30 μl wypłukanych Dynabeads do każdej reakcji IP.</li>
<li>Inkubuj w obrotowym uchwycie na probówki przez 2 h w temperaturze 4°C.</li>
<li>Po zakończeniu inkubacji umieść probówkę na statywie magnetycznym na 2 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odsącz naddatek pipetą. Unikaj dotykania końcówką pipety wewnętrznej ścianki probówki (tam, gdzie koraliki przyciągają się do magnesu). Dodaj 500 μl buforu IP. Wymieszaj zawartość probówki i ponownie umieść ją na statywie magnetycznym na 2 min. Powtórz płukanie 500 μl buforu IP jeden raz.</li>
<li>Po usunięciu naddatku z ostatniego płukania, resuspenduj koraliki w 400 μl buforu do trawienia.</li>
<li>Potraktuj reakcję 100 μg Proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 50°C.</li>
</ol>
OCZYSZCZANIE DNA PO IMMUNOPRECYPITACJI
<ol>
<li>Dodać 500 &mu;l dodać fenol/chloroform 1:1 o pH 7 i dokładnie wymieszać na wiertarku (vortexu).</li>
<li>Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieś frakcję wodną (górną) do nowej probówki.</li>
<li>Powtórzyć kroki od 1 do 3, jeśli granica faz między warstwą wodną a organiczną jest mętna.</li>
<li>Dodać 1/10th objętość 3 M octanu sodu (40 &mu;l) i wymieszać w wirówce typu vortex.</li>
<li>Dodać 1 &mu;l glikogenu (20 &mu;g/&mu;l) i wymieszać w wstrząsarzu vortex.</li>
<li>Dodaj 2 objętości (1000 &mu;l) 100% etanolu, wymieszać na wodotryskach (vortex) i umieścić w temperaturze -20&deg;C przez 20 min.</li>
<li>Wirować przy 13 000 g przez 20 min w 4&deg;C.</li>
<li>Usunąć etanol, krótko odwirować i usunąć pozostałości etanolu.</li>
<li>Dodać 500 &mu;l zimny 70% etanol do przemycia. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i wirować z przyspieszeniem 13 000 g przez 20 min w 4&deg;C.</li>
<li>Usunąć 70% etanol, krótko odwirować (pulse spin), a następnie usunąć pozostały etanol za pomocą pipety.</li>
<li>Osuszyć osad na powietrzu przy otwartej zakrętce przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady pozostałego etanolu.</li>
<li>Resuspender osad DNA w 10 &mu;l sterylizowana dH2O20. </li>
</ol>
WALIDACJA METODĄ PCR
<ol>
<li>Można sprawdzić prawidłowe działanie procedury MeDIP, wykonując protokół MeDIP z użyciem normalnego ludzkiego DNA (męskiego lub żeńskiego), a następnie analizując region znany z wysokiego stopnia metylacji.</li>
<li>Przenieś 30% produktu MeDIP do probówki PCR oraz kolejne 30% produktu MeDIP do drugiej probówki PCR.</li>
<li>Umieść 10 ng DNA IN w probówce PCR oraz 10 ng DNA IN w drugiej probówce PCR. Powinieneś teraz przygotować cztery oddzielne reakcje PCR.</li>
<li>Przeprowadź PCR z użyciem starterów H19 i CTRL, zgodnie ze wskazówkami w Tabeli 1.</li>
<li>Przygotuj dwie mieszaniny mastermix (po jednej dla każdego zestawu starterów) do reakcji PCR o całkowitej objętości 12,5 µl, zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
<li>Przeprowadź termocyklowanie PCR zgodnie z warunkami opisanymi w Tabeli 3.</li>
<li>Naniesiesz 5 µl produktów PCR na 2% żel agarozowy w celu wizualizacji.</li>
<li>Oczekiwane wyniki dla prawidłowo przeprowadzonego MeDIP przedstawiono w Tabeli 4.</li>
</ol>
Tabele
Tabela 1: Primery H19 i CTRL do walidacji PCR. 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Zestaw primerów</td>
<td>Primer prawy (Forward)</td>
<td>Primer lewy (Reverse)</td>
<td>Przewidywana wielkość produktu</td>
</tr>
<tr>
<td>H19</td>
<td>H19_F 5’-cgagtgtgcgtgagtgtgag</td>
<td>H19_R 5’-ggcgtaatggaatgcttgaa</td>
<td>174 bp</td>
</tr>
<tr>
<td>CTRL (kontrola)</td>
<td>CTRL_F5’-gagagcattagggcagacaaa</td>
<td>CTRL_R 5’-gttcctcagacagccacattt</td>
<td>139 bp</td>
</tr>
</tbody>
</table>

Tabela 2. Mieszaniny Mastermix do reakcji PCR. 
<table border="1">
<tbody >
<tr >
<td >&nbsp;</td>
<td >Mieszanina H19 (na reakcję)</td>
<td >Mieszanina CTRL (na reakcję)</td>
</tr >
<tr >
<td >ddH2O</td>
<td >6,875</td>
<td >6,875</td>
</tr >
<tr >
<td >Bufor 10X</td>
<td >1,25</td>
<td >1,25</td>
</tr >
<tr >
<td >Mieszanina dNTP (po 10 mM każda)</td>
<td >0,25</td>
<td >0,25</td>
</tr >
<tr >
<td >MgCl2 (50 mM)</td>
<td >0,25</td>
<td >0,25</td>
</tr >
<tr >
<td >Startery (H19_F/R lub CTRL_F/R) (po 10 µM każdy F/R)</td>
<td >0,625</td>
<td >0,625</td>
</tr >
<tr >
<td >Platinum Taq</td>
<td >0,25</td>
<td >0,25</td>
</tr >
</tbody >
</table >

Tabela 3. Warunki termocyklerowe PCR. 
<table border="1">
<tbody
>
<tr
>
<td>&nbsp;</td>
<td>95°C</td>
<td>5:00</td>
</tr>
<tr
>
<td rowspan="3">40X </td>
<td>95°C</td>
<td>0:30</td>
</tr>
<tr
>
<td>56°C</td>
<td>0:30</td>
</tr>
<tr
>
<td>72°C</td>
<td>0:15</td>
</tr>
</tbody>
</table>

Tabela 4. Oczekiwane wyniki PCR dla prawidłowo przeprowadzonej procedury MeDIP. 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td colspan="2" align="center">Matryca DNA</td>
</tr>
<tr>
<td>Użyty starter</td>
<td>IN</td>
<td>IP</td>
</tr>
<tr>
<td>H19</td>
<td>Dodatni</td>
<td>Dodatni</td>
</tr>
<tr>
<td>CTRL</td>
<td>Dodatni</td>
<td>Ujemny</td>
</tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
<li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+cancer+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">The history of cancer epigenetics.</a> Nature reviews. 4, 143-153 (2004).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Coraz większa jest świadomość znaczącej roli, jaką metylacja DNA odgrywa w rozwoju chorób, dlatego opracowanie testów pozwalających na pomiar tej modyfikacji staje się coraz ważniejsze 3, 12, 13. Technika MeDIP stanowi przydatne narzędzie do przesiewowej analizy zarówno na poziomie całego genomu, jak i specyficznych loci 6, 7. Metoda ta umożliwia szybki wgląd w poziomy metylacji DNA przy użyciu niewielkich ilości wyjściowego DNA i pozwala na łatwe porównania pomiędzy różnymi źródłami. Dalsze zastoso...

<table><tbody><tr><td>Sonikator Biorupter</td><td>Narzędzie</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki 1,7 ml SafeSeal</td><td>Inne</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr ND 3300</td><td>Narzędzie</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: mysi mAb przeciwko 5&amp;rsquo;-metylocytozynie</td><td>Odczynnik</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe: Dynabeads M-280 owcze anty-mysie IgG</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny statyw na probówki</td><td>Narzędzie</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Narzędzie</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor IP</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Bufor do trawienia</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

immunoprecypitacja zmetylowanego dna

Methylated DNA Immunoprecipitation

Identyfikacja wzorów metylacji DNA jest powszechną procedurą w badaniach nad epigenetyką, ponieważ wiadomo, że metylacja wywiera istotny wpływ na ekspresję genów i bierze udział w prawidłowym rozwoju, jak również w procesach chorobowych1-4Zatem zdolność rozróżniania między DNA zmetylowanym a niezmetylowanym jest niezbędna do tworzenia profili metylacji na potrzeby takich badań. Immunoprecypitacja DNA zmetylowanego (MeDIP) jest wydajną techniką ekstrakcji zmetylowanego DNA z badanego preparatu5-7Próbka zawierająca zaledwie 200 ng DNA jest wystarczająca do reakcji z przeciwciałem, czyli immunoprecypitacji (IP). DNA poddaje się sonikacji w celu uzyskania fragmentów o rozmiarach od 300-1000 bp, a następnie dzieli na porcje immunoprecypitowane (IP) oraz wejściowe (IN). DNA IP jest następnie denaturowane termicznie, a potem inkubowane z przeciwciałem anty-5'mC, co umożliwia związanie zmetylowanego DNA przez przeciwciało monoklonalne. Następnie dodaje się kulki magnetyczne zawierające przeciwciało wtórne wykazujące powinowactwo do przeciwciała pierwotnego i poddaje się je inkubacji. Przeciwciała związane z kulkami wiążą przeciwciało monoklonalne użyte w pierwszym kroku. DNA związane z kompleksem przeciwciał (DNA zmetylowane) oddziela się od reszty DNA, używając magnesu do wyciągnięcia kompleksów z roztworu. Następnie wykonuje się kilka płukań buforem IP, aby usunąć niezwiązane, niezmetylowane DNA. Kompleksy zmetylowanego DNA/przeciwciał są następnie trawione Proteinazą K w celu rozkładu przeciwciał, pozostawiając nienaruszone jedynie zmetylowane DNA. Wzbogacone DNA oczyszcza się poprzez ekstrakcję fenol:chloroformową w celu usunięcia białek, a następnie wytrąca i resuspenduje w wodzie do późniejszego użycia. Techniki PCR mogą być wykorzystane do walidacji wydajności procedury MeDIP poprzez analizę produktów amplifikacji DNA IP i IN w regionach znanych z braku oraz obecności sekwencji zmetylowanych. Oczyszczone zmetylowane DNA może być następnie wykorzystane do badań metylacji specyficznych dla konkretnych loci (PCR) lub w skali całego genomu (mikromacierze i sekwencjonowanie); jest ono szczególnie użyteczne w połączeniu z innymi narzędziami badawczymi, takimi jak profilowanie ekspresji genów i komparatywna hybrydyzacja genomowa na mikromacierzach (CGH).8Dalsze badania nad metylacją DNA doprowadzą do odkrycia nowych celów epigenetycznych, co z kolei może być przydatne w opracowywaniu nowych terapeutycznych lub prognostycznych narzędzi badawczych w chorobach takich jak nowotwory, które charakteryzują się aberracyjną metylacją DNA2, 4, 9-11empty

Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA (MeDIP). MeDIP jest dwudniową procedurą, która pozwala na selektywne wyodrębnienie zmetylowanych fragmentów DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5-metylocytozyny (anti-5 mC).

Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

Identyfikacja wzorców metylacji DNA jest powszechną procedurą w badaniach nad epigenetyką, ponieważ wiadomo, że metylacja wywiera istotny wpływ na ...

Niniejszy film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA, znany jako MeDIP. Jest to metoda służąca do specyficznego izolowania zmetylowanego DNA w sposób nieobciążony. Metylacja DNA u ssaków charakteryzuje się przyłączeniem grupy metylowej do pozycji C5 cytozyny.W przypadku obecności w dinukleotydzie CpG, jest to odwracalna modyfikacja epigenetyczna, która odgrywa istotną rolę w prawidłowym rozwoju, jak również w przebiegu wielu procesów chorobowych. Do prawidłowych funkcji metylacji DNA należą inaktywacja chromosomu X u samic, wyciszanie elementów powtarzalnych, imprinting genomowy oraz utrzymanie stabilności genomu. Wykazano również, że metylacja DNA odgrywa rolę w licznych chorobach, takich jak nowotwory, zespół de Willebranda, zespół Angelmana, niedobór odporności, niestabilność centromeryczna oraz zespół anomalii twarzy.W nowotworach, na przykład, nieprawidłowa hipermetylacja promotorów może prowadzić do wyciszenia kluczowych genów supresorowych. Podczas gdy niewłaściwa hipometylacja skutkuje niestabilnością chromosomową i aktywacją onkogenów, proces ten rozpoczyna się od sonikacji DNA w celu uzyskania fragmentów o wielkości od 300 do 1000 par zasad. Następnie sonikowane DNA poddaje się denaturacji w temperaturze 95 °C.Dodaje się przeciwciała pierwszorzędowe, które rozpoznają 5-metylocytozynę, i pozostawia się je do związania z metylowanymi fragmentami DNA. Przeciwciała drugorzędowe, sprzężone z magnetycznymi kuleczkami DynaBeads, służą do izolacji fragmentów DNA związanych przez przeciwciała pierwszorzędowe. Fragmenty niemetylowane są usuwane, a przeciwciała trawione proteinazą.Oczyszczanie za pomocą fenolu i chloroformu usuwa strawione białka, a wytrącanie oczyszcza DNA, które jest teraz wzbogacone o fragmenty zmetylowane. Otrzymane DNA może być wykorzystane w takich zastosowaniach jak mikroarray PCR oraz sekwencjonowanie. Procedurę tę zazwyczaj przeprowadza się w ciągu dwóch dni.Pierwszy dzień obejmuje przygotowanie DNA, immunoprecypitację po sonikacji oraz trawienie białek. Drugi dzień obejmuje ekstrakcję chloroformem w określonym pH oraz precypitację etanolem w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA wzbogaconego pod kątem metylacji. Do przeprowadzenia procedury wymagane są niektóre specjalistyczne materiały, w tym silikonizowane probówki do wirowania, urządzenie do sonikacji DNA, przeciwciało pierwotne (monoklonalne przeciwciało mysie anty-5' metylacyjne), przeciwciało wtórne (Dynabeads sprzężone z owczym anty-ludzkim IgG) oraz magnetyczna statywa na probówki.Pierwszym krokiem w protokole „The meetup” jest przygotowanie DNA. Niezbędne jest wcześniejsze określenie charakteru DNA. Znajomość stanu DNA w próbce, w szczególności czy jest ono głównie dwu- czy jednoniciowe, jest wymagana, ponieważ dokładne ilościowe oznaczenie próbki ma kluczowe znaczenie, a na różne metody określania ilości DNA może niekorzystnie wpływać obecność niepożądanych form DNA.Ilość dwuniciowego DNA można łatwo ocenić za pomocą fotometrii spektralnej przy użyciu NanoDrop 3000; należy nanieść 1,5 µL i ustawić typ pomiaru na kwas nukleinowy, wybrać DNA 50 jako metodę obliczeń oraz zainicjować urządzenie za pomocą 1,5 µL wody. Oczyścić podstawki i przeprowadzić pomiar tła (blank) przy użyciu 1,5 µL cieczy. Próbka jest rozpuszczona w; oczyścić podstawki, nanieść 1,5 µL próbki i nacisnąć przycisk pomiaru.Podane zostanie stężenie, które można wykorzystać. Aby obliczyć liczbę potrzebnych mikrolitrów, należy przyjąć stosunek A₂₆₀ do A₂₈₀ wynoszący 1,8, który jest tutaj wartością idealną. Przygotowano próbkę o masie 1 µg.Jednakże próbka o masie zaledwie 200 nanogramów jest wystarczająca do uzyskania pomyślnych wyników. Następnie wprowadź próbkę DNA do czystej probówki silikonizowanej. Dodaj odpowiednią ilość sterylnej wody, aby uzyskać objętość końcową 50 microliters.Sonikację DNA oraz immunoprecypitację należy przeprowadzać w probówkach silikonizowanych, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu DNA i białek do ścianek probówek. Po przygotowaniu DNA próbka musi zostać poddana sonikacji w celu fragmentacji DNA, ponieważ immunoprecypitacja jest bardziej efektywna przy mniejszych fragmentach DNA. Należy umieścić próbkę w sonikatorze, upewniając się, że ustawienie mocy jest wysokie, a czas działania urządzenia wynosi 30 sekund. Po zakończeniu 30-sekundowego cyklu należy wypełnić podstawę wodą o temperaturze 4 °C do linii wypełnienia.Sonicuj próbkę przez siedem minut. Po zakończeniu sonikacji wyjmij probówkę i umieść ją w lodzie. Ważne jest, aby wcześniej zoptymalizować warunki sonikacji dla przewidywanego rodzaju próbki oraz wielkości DNA.Na przykład częściowo zdegradowana próbka DNA będzie wymagała krótszego czasu sonikacji. Produkty sonikacji można zwizualizować za pomocą standardowych technik elektroforetycznych. Na tym etapie pożądane są fragmenty DNA o długości od 300 do 1000 par zasad do późniejszego zastosowania.W testach macierzyjowych i PCR należy zachować jedną piątą DNA jako DNA wejściowe lub referencyjne; w tym przypadku 800 nanogramów sonikowanego DNA zostanie użytych do immunoprecypitacji, a reszta zostanie odłożona jako DNA referencyjne. Kolejnym krokiem w protokole ośrodka jest immunoprecypitacja lub reakcja IP; przed dodaniem przeciwciała pierwszorzędowego DNA musi zostać zdenaturowane. Denaturacja jest konieczna, ponieważ przeciwciało pierwszorzędowe jest wrażliwe na jednoniciowe DNA.Umieść próbkę w kąpieli wodnej w temperaturze 95°C przez 10 minut. Po zakończeniu etapu denaturacji natychmiast przenieś probówkę na lód na co najmniej pięć minut. Zapobiegnie to ponownemu hybrydyzowaniu zdenaturowanego DNA i zapewni optymalne wiązanie przeciwciał po ochłodzeniu próbki.Krótko wiruj probówkę, aby zgromadzić zawartość na dnie. Następnie należy dodać przeciwciało pierwszorzędowe. Ilość użytego przeciwciała powinna zostać mianowana dla każdej partii oraz dla każdego producenta.W tym przypadku dodajemy 5 µg przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie dopełniamy objętość buforem do immunoprecypitacji (buforem IP) do końcowej objętości 500 µL. Następnie próbkę DNA do IP umieszcza się w rotatorze i inkubuje w temperaturze 4 °C przez dwie godziny. Rotacja jest niezbędna, aby zapobiec aglomeracji przeciwciał w probówce podczas inkubacji.Około 15 minut przed zakończeniem inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, należy oczyścić i przygotować magnetyczne kulki dyna beads. Najpierw dokładnie resuspenduj kulki w fiolce za pomocą wirówki wortexowej. Następnie przenieś 30 µL kulek do czystej probówki z السيليكونizacją i umieść tę probówkę na statywie magnetycznym przeznaczonym do wielu reakcji.Przenieś 30 µL kulek na każdą reakcję, dodając ilość wystarczającą na jedną dodatkową reakcję, aby zrekompensować błędy pipetowania lub przypadkową utratę części kulek. Na przykład dla ośmiu reakcji należy pobrać ilość kulek odpowiednią dla dziewięciu reakcji, czyli 270 µL.Kuleczki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ścianki statywu magnetycznego. Odczekaj dwie minuty, aż kuleczki przemieścą się i osadzą w postaci wyraźnej smugii na ściance probówki. Następnie ostrożnie usuń i odrzuć supernatant za pomocą pipety, dbając o to, aby końcówka pipety nie poruszyła kuleczkami znajdującymi się na tylnej ściance.Zastąp supernatant nadmiarem buforu IP, wymieszaj na wortexie i ponownie umieść próbkę na statywie magnetycznym na dwie minuty. Powtórz to płukanie jeszcze raz, a następnie zawieś ponownie kuleczki do płukania w ich pierwotnej objętości buforu IP. Po zakończeniu inkubacji wyjmij probówkę z próbką z rotatora.Aby zakończyć immunoprecypitację, należy dodać 30 µL czystych kulek do reakcji i umieścić probówkę z powrotem w rotatorze na dwie godziny w temperaturze 4 °C. Podczas tej inkubacji przeciwciało wtórne, będące przeciwciałem anty-mysie IgG, zwiąże się z pierwotnym przeciwciałem mysim. Przeciwciała anty-mysie są sprzężone z magnetycznymi kulkami DynaBeads, co umożliwia łatwe odzyskanie związanych produktów oraz przeprowadzenie kolejnego etapu oczyszczania.Po zakończeniu inkubacji z oboma przeciwciałami, umieść probówkę do IP na statywie magnetycznym na dwie minuty. Na tym etapie zmetylowane DNA zostanie związane przez przeciwciało pierwotne, które z kolei zostanie związane przez przeciwciało wtórne skoniugowane z kulkami dyna bead. Usuń i odrzuć supernatant, a następnie zastąp go 500 µL buforu IP.Wymieszać zawartość probówki i odstawić ją z powrotem na statyw na dwie minuty. Powtórzyć to płukanie buforem IP jeszcze raz. Po usunięciu supernatantu z ostatniego płukania Resus należy zawiesić kuleczki po raz ostatni.W 400 µL buforu do trawienia, potraktuj próbkę reakcyjną 100 µg proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 50 °C. Traktowanie proteinazą K jest niezbędne do strawienia białek przeciwciał oraz wszelkich pozostałych białek związanych z DNA, co pozwala na uwolnienie zmetylowanego DNA do roztworu. Oczyszczanie DNA odbywa się drugiego dnia procedury; wyjmij probówkę z trawieniem z inkubatora.W dygestorium dodać do probówki 500 µL fenolo-chloroformu w stosunku jeden do jednego o pH siedem i dokładnie wymieszać na wirówce wortex. Wirować próbkę przez 10 minut przy 13 000 g. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną z probówki, nie naruszając interfazy ani nie usuwając warstwy organicznej. Przenieść fazę wodną do nowej probówki.Drugą ekstrakcję można przeprowadzić, jeśli faza międzyfazowa wydaje się mętna. Następnie należy dodać jedną dziesiątą objętości trzy molowego octanu sodu, w tym przypadku 40 µL. Jako nośnik ułatwiający oczyszczanie osadu można zastosować 1 µL glikogenu.Wymieszać zawartość probówki za pomocą wibratora vortex. Następnie dodać dwie objętości 100% etanolu, wymieszać w wibratorze vortex i zamrozić w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 20 minut. Po zamrożeniu wytrącony DNA wirować w wirówce przy 13 000 G i temperaturze 4 °C przez 20 minut.Na dnie probówki utworzy się osad DNA. Wyjmij probówkę z wirówki i usuń etanol. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu znajdującego się na dnie probówki.Może być konieczne krótkie wirowanie (tzw. pulse spin), aby usunąć resztki etanolu. W celu przemycia osadu należy dodać 500 µL zimnego 70% etanolu, wymieszać na wortexie, a następnie wirować ponownie przez 20 minut przy 13 000 G i 4 °C. Po zakończeniu drugiego wirowania należy usunąć 70% etanol, wykonać krótkie wirowanie i usunąć resztki etanolu za pomocą pipety.Pozostaw probówkę w statywie z otwartą zakrętką, aby osuszyć pellet i pozwolić na odparowanie pozostałego etanolu. Na koniec ponownie zawiesić pellet zawierający wyłącznie DNA wzbogacone o metylację w 10 µL sterylnej wody, odczekując odpowiedni czas do całkowitego rozpuszczenia pelletu DNA przed użyciem. Dobrą praktyką jest walidacja wydajności procesu za pomocą PCR.Można to przeprowadzić, wykonując reakcje PCR zaprojektowane do amplifikacji produktów, które różnicują zmetylowane i niezmetylowane fragmenty DNA dla starterów amplifikujących normalne ludzkie DNA. Region kontrolny imprintingowy H 19 może być stosowany w połączeniu ze starterami zaprojektowanymi do amplifikacji regionu genomu, który nie jest zmetylowany. Przykładowe sekwencje starterów oraz warunki cykli PCR znajdują się w dołączonym protokole.Na tym etapie należy odzyskać wejściowy lub referencyjny DNA, który został odstawiony na początku protokołu meetup. Jeden zestaw reakcji PCR zostanie przygotowany z użyciem wejściowego DNA, a drugi zestaw z użyciem DNA z IP wzbogaconego pod kątem metylacji. Jeśli proces meetup przebiegł pomyślnie, PCR z IP wyprodukuje produkt z użyciem starterów do metylacji i nie wyprodukuje produktu z użyciem starterów kontrolnych.W przeciwieństwie do tego, PCR wejściowy powinien generować produkty przy użyciu obu primerów, ponieważ zawiera fragmenty DNA zarówno zmetylowane, jak i niezmetylowane. DNA wzbogacone o fragmenty zmetylowane może być wykorzystane w wielu kolejnych zastosowaniach, takich jak sekwencjonowanie PCR i analiza mikromacierzy.W połączeniu z innymi technikami biologii molekularnej metoda ta może być wykorzystywana do badania stanu metylacji DNA w sposób specyficzny dla konkretnego locus lub w całej obrębie genomu w celu profilowania metylacji lub badania epigenomiki.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Immunoprotycenie DNA metylowanego

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Ten film opisuje technikę dot-blot do określania poziomu metylacji DNA w ludzkich chondrocytach in vitro poprzez plamienie próbek DNA na nylonowej membranie i późniejszą wizualizację za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Pomaga to określić fenotyp chondrocytów na różnych etapach hodowli.

5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Poznaj metodę immunoprecypitacji metylowanego DNA (MeDIP) do izolacji fragmentów DNA z modyfikacjami epigenetycznymi. Technika ta umożliwia badanie roli metylacji w rozwoju i chorobach.

Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

Przeglądaj więcej filmów