Obsługiwane dwuwarstwy płaskie do tworzenia badania synaps immunologicznych i kinaps

Cześć, nazywam się Mike Dustin i pracuję w Instytucie Gerala i Szkole Medycznej Uniwersytetu Nowojorskiego. Dzisiaj przeprowadzę Cię przez procedurę tworzenia podtrzymującego płaskiego Biolaya do badania synapsy immunologicznej. Więc zacznijmy.

Aby wytworzyć dwuwarstwę lipidową, przygotowujemy roztwór 20% niklu, chelatującego lipidu i 80% fosfatydylocholiny w odpowiednich ilościach w szklanej probówce z jednym do dwóch mililitrów metanolu chloroformu. Pierwszym krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika pod strumieniem gazowego azotu w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze od 30 do 37 stopni Celsjusza. Zwykle zajmuje to około 15 minut.

Następnie usuń pozostały rozpuszczalnik w wysokiej próżni za pomocą liofilizatora przez 90 minut. Następnie rozpuść lipidy w 2% ósemkowym buforze soli fizjologicznej detergentu z glukozydem oktalnym do końcowego stężenia 0,4 milimola. W ten sposób powstaje roztwór mieszanych mykomórek fosfolipidowych detergentu, tworząc liposomy.

Dializujesz ten roztwór przed trzema zmianami tris soli fizjologicznej, aby usunąć detergent i utworzyć liposomy. Zwykle pracujemy z objętościami rzędu jednego mililitra z rurkami o średnicy sześciu milimetrów z odcięciem około 10 kilodaltonów i jesteśmy ostrożni, aby wykluczyć wszelkie pęcherzyki powietrza podczas zaciskania rurki. Sterylnie filtrujemy ten roztwór i przeprowadzamy dializę w czystych warunkach, a następnie obchodzimy się z nim w rękawicach wysterylizowanych 70% etanolem.

Roztwór ten powinien być krystalicznie czysty i przechowywany w atmosferze argonnu, aby zapobiec utlenianiu. Jeśli roztwór jest mętny, oznacza to, że wygenerowałeś wielościenne pęcherzyki i musisz zacząć od nowa. Aby rozpocząć eksperyment, musimy najpierw określić, ile ICAM one i MHC osadza się na danej powierzchni dwuwarstwy chelatującej nikiel przy danym stężeniu rozpuszczalnego białka.

W tym celu nakładamy dwuwarstwy na szkło o średnicy pięciu mikrometrów. Inkubować szklane kulki z roztworami białkowymi w warunkach zbliżonych do tych w komórkach przepływowych używanych do obrazowania, a następnie odczytać gęstość związanego białka za pomocą przepływowego testu immunofluorometrycznego. Przeciwciała znakowane FSI o znanej liczbie fluoresceiny na cząsteczkę są używane do wykrywania białek związanych powierzchniowo, a standardowe kulki fluoresceiny są używane do kalibracji przepływowego mikrofluorymetru.

Ustalimy warunki, które są zbliżone do tych na komórkach prezentujących antygen z 200 cząsteczkami na mikrometr kwadratowy ICAM jeden i 0,2 do 20 cząsteczek na kwadrat. Mikrometr I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, złożone płaskie dwuwarstwy tworzą się spontanicznie, gdy liposomy łączą się ze szkłem, ale tylko wtedy, gdy jest odpowiednio oczyszczone w celu oczyszczenia szkła. Używamy kwaśnego roztworu piany, świeżo przygotowanej mieszaniny kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru, która niszczy cały materiał organiczny, a także pozostawia powierzchnię szkła bardzo hydrofilową.

Podczas pracy z piranią nosimy pełną odzież ochronną, w tym fartuch kwasowy i ciężkie rękawice kwasoodporne. Odpady należy starannie oddzielić od odpadów organicznych i odpowiednio zutylizować. Aby przygotować kwaśny roztwór piranii, dodaj 75 mililitrów stężonego kwasu siarkowego do suchej zlewki, a następnie ostrożnie dodaj 25 mililitrów 30% nadtlenku wodoru.

Roztwór szybko nagrzewa się do temperatury ponad 100 stopni Celsjusza, a następnie zanurz suche szkiełka nakrywkowe w roztworze na 15 minut. Po tej inkubacji w piranii zanurz szkiełka nakrywkowe w oczyszczonej wodzie, a następnie płucz je przez minutę z każdej strony. Następnie wysusz szkiełka nakrywkowe za pomocą źródła podciśnienia, aby spuścić oczyszczoną wodę.

Pozostawić roztwór piranii do ostygnięcia i dodać do pojemnika na odpady piranii, który pozostawia się z luźną, dobrze zaznaczoną nakrętką w dygestorium, aby utworzyć dwie warstwy. W naszym laboratorium stosowane są dwie komory bi FCS, które mają zalety zintegrowanego ogrzewania. System FCS two opiera się na podstawie ze stali nierdzewnej, która zaciska razem kolektor mikroprzepływowy z uszczelką górną o grubości 0,5 milimetra, zjeżdżalnią mikroakweduktu pokrytą tlenkiem indu i cyny do ogrzewania z jednej strony i z rowkiem płynnym po drugiej stronie.

Bezpyłowa uszczelka o średnicy 0,25 milimetra, która określa wysokość komory przepływowej i oczyszczonej piranią 40-milimetrowej okrągłej szkiełka nakrywkowego, na której formowana jest dwuwarstwa w celu złożenia komory przepływowej i utworzenia płaskich dwuwarstw. Umieść kolektor rurkami skierowanymi do góry na płaskiej powierzchni. Następnie umieść uszczelkę 0.5 milimetra z otworami umieszczonymi nad rurkami fluidycznymi i upewnij się, że jest ona osadzona płasko.

Delikatnie umieść zjeżdżalnię mikroakweduktu kanałami przepływowymi skierowanymi do góry i upewnij się, że jest osadzona płasko bez wywierania nacisku w dół, aż do sprawdzenia, czy otwory w zjeżdżalni są wyrównane z rurkami mikroprzepływowymi. Następnie ułóż bezpyłową uszczelkę o grubości 0,25 milimetra z prostokątnym wycięciem na zjeżdżalni mikroakweduktu, tak aby kanał był wyrównany z kanałami płynowymi i nie było większych przestrzeni powietrznych, umieść aż pięć jednolitrowych kropli zawiesiny liposomowej na powierzchni zjeżdżalni mikroakweduktu we wzorze tak, aby odległość od środka do środka między każdą kroplą wynosiła 2,5 milimetra. Pięć kropli liposomów może mieć różny skład, ale w tym przypadku utworzymy tylko dwie dwuwarstwy, jedną bez lipidów chelatujących nikiel, a drugą z lipidami chelatującymi nikiel 10%.

Gdy te krople znajdą się na miejscu, ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni jednym ruchem, clamp na podstawie tak szybko, jak to możliwe. Krople liposomu powinny stykać się ze szkiełkiem nakrywkowym. Kontakt ten nie powinien być przerywany, ponieważ dwuwarstwy prawdopodobnie już się uformowały, a wszelkie zakłócenia mogą skutkować wadliwymi dwuwarstwami.

W tym momencie ważne jest, aby pamiętać o oznaczeniu pozycji dwuwarstw kilkoma małymi plamkami atramentu na szkiełku, aby ułatwić ustawienie szkiełka nakrywkowego na mikroskopie. Odczekaj 20 minut, aby upewnić się, że system jest zrównoważony, przenieś wszystkie roztwory za pomocą 20-mililitrowej strzykawki podłączonej do około 20-centymetrowej elastycznej rurki i trójdrożnego kurka odcinającego. Kolejny port kurka odcinającego jest następnie połączony z komorą przepływową za pomocą krótkiego odcinka rurki, aby zminimalizować martwą objętość między kranem a komorą przepływową.

Napełnić strzykawkę buforowanym roztworem soli fizjologicznej zawierającym chlorek magnezu, chlorek wapnia, glukozę i albuminę surowicy ludzkiej. Zalać rurkę i kurek odcinający, aby nie było pęcherzyków powietrza. Następnie podłącz go do komórek przepływowych i przepchnij przez pięć mililitrów jednym ruchem, obserwując, czy żadne pęcherzyki powietrza nie przechodzą przez dwuwarstwę.

Teraz będziesz miał swoje dwuwarstwy, aby wprowadzić białka oznaczone sykiem do dwuwarstwy. Najpierw należy go zablokować kasetą i naładować niklem. Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra roztworem jonów niklu kazenowego i podłącz ją do bocznego portu, nie zatrzymując żadnych pęcherzyków powietrza.

Po wstrzyknięciu roztworu należy odczekać 20 minut, aby umożliwić całkowite zablokowanie. Następnie wypłukać roztwór blokujący za pomocą H-B-S-H-S-A z 20-mililitrowej strzykawki. Teraz wstrzyknij 0,5 mililitra roztworu H-B-S-H-S-A zawierającego polyhis oznaczony ICAM one i IEK.

W tym eksperymencie ICAM jest oznaczony jako SCI pięć. Tak więc LFA, jedna ICAM, jedna interakcja może być śledzona, obrazując ICAM, jedno przegrupowanie w dwuwarstwie, pozwól 30 minutom na związanie się dwuwarstwy naładowanej niklem, podczas gdy białko przylega do dwuwarstwy. Przymocuj komórkę przepływową do odwróconego mikroskopu za pomocą niestandardowej wkładki stolika.

Następnie podłącz elektronikę grzewczą, aby system osiągnął równowagę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj wykonanych wcześniej oznaczeń, aby ustawić komórkę przepływową tak, aby obiektyw był wyrównany z jedną z dwuwarstw i użyj mikroskopii odbicia interferencyjnego, aby zlokalizować płaszczyznę ogniskowej, skupiając się na odbitym obrazie światła membrany pola. Na koniec wypłucz niezwiązany ICAM z komórek przepływowych.

Zdobądź obrazy fluorescencyjne dwuwarstwy w jednym kanale ICAM w trybach murawy M i szerokokątnym. Ma to na celu potwierdzenie jednego wiązania ICAM na dwuwarstwie pokrytej niklem w stosunku do dwuwarstwy bezniklowej. Komórka przepływowa jest teraz gotowa do odbioru komórek.

Do tej demonstracji użyjemy transgenicznych limfocytów T receptora komórek T ND, które zostały transdukowane za pomocą retrowirusowej powłoki ENC GFPs P zap 70, przemyjemy komórki raz za pomocą H-B-S-H-S-A, a następnie inkubujemy komórki za pomocą Alexa 5 68 oznaczonego FAB do receptora komórek T, abyśmy mogli śledzić mikroklastry TCR. Po 15 minutach rozcieńczyć komórki od 1 do 10. To rozcieńcza przeciwciało H 57 na tyle, że nie zakłóca obrazowania M na murawie, ale utrzymuje nasycenie receptora limfocytów T, gdy początkowo związany fab zaczyna dysocjować, a następnie wstrzykuje je do komórki przepływowej.

Obrazujemy synapsę immunologiczną w trójkolorowym trybie Murawa M. Obejmuje to tworzenie oddziaływań LFA one, ICAM one, tworzenie klastrów TCR i C smac oraz trwałe tworzenie mikroklastrów TCR, które rekrutują GFP ZAP 70. Niektóre z tych wyników są oczywiste podczas akwizycji, podczas gdy inne będą wymagały analizy po przetworzeniu, aby w pełni je docenić.

Okej, właśnie pokazaliśmy, jak używać podpartych dwuwarstw płaskich do badania synapsy immunologicznej. Bardzo ważne jest, aby te eksperymenty zadziałały, że limfocyty T są w bardzo dobrym stanie, a buforowany roztwór soli fizjologicznej PPS nie nadaje się do długotrwałej hodowli komórek T. Więc chcesz wyjąć komórki z hodowli, umieścić je w tym pożywce, a następnie bardzo szybko je użyć.

Jeśli okaże się, że chcesz przeprowadzić długoterminowe eksperymenty, istnieje kilka bardzo dobrych preparatów pożywek bez surowicy, które możesz zastąpić buforowaną solą fizjologiczną. To utrzyma komórki przy życiu znacznie dłużej, jeśli chcesz uzyskać dłuższy końcowy punkt końcowy, taki jak produkcja cytokin lub proliferacja limfocytów T. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.