Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Witajcie, jestem Mike Dustin z Instytutu Geral oraz Szkoły Medycznej Uniwersytetu Nowojorskiego. Dzisiaj przeprowadzę Państwa przez procedurę tworzenia wspierających płaskich warstw biologicznych do badania synapsy immunologicznej. Zatem zaczynajmy.

Aby stworzyć dwuwarstwę lipidową, przygotowujemy w probówce szklanej odpowiednie ilości roztworu składającego się z 20% lipidu chelatującego nikiel i 80% fosfatydylocholiny w jednym do dwóch mililitrów chloroformu z metanolem. Pierwszym krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika pod strumieniem gazu azotowego w ciepłej kąpieli wodnej o temperaturze od 30 do 37 °C. Zazwyczaj trwa to około 15 minut.

Następnie usuń pozostały rozpuszczalnik w wysokiej próżni za pomocą liofilizatora przez 90 minut. Potem rozpuść lipidy w buforze soli fizjologicznej z dodatkiem 2%N detergentu octyloglukozydowego do końcowego stężenia 0,4 millimolarna. W ten sposób powstanie roztwór mieszanych miceli detergentowo-fosfolipidowych służących do formowania liposomów.

Roztwór ten dializuje się przeciwko trzem zmianom soli Tris w celu usunięcia detergentu i utworzenia liposomów. Zazwyczaj pracujemy z objętościami rzędu jednego mililitra, używając rurek o średnicy sześciu milimetrów z progiem odcięcia około 10 kDa, dbając o to, aby podczas zaciskania rurek nie pozostały w nich pęcherzyki powietrza. Roztwór ten poddajemy sterylnej filtracji, dializę przeprowadzamy w warunkach czystych, a próbkami manipulujemy w rękawiczkach wysterylizowanych 70% etanolem.

Roztwór ten powinien być krystalicznie czysty i jest przechowywany w atmosferze argonu, aby zapobiec utlenianiu. Jeśli roztwór jest mętny, oznacza to, że powstały wielowarstwowe pęcherzyki i należy rozpocząć procedurę od nowa. Aby przygotować eksperyment, musimy najpierw określić, jaka ilość ICAM-1 oraz MHC jest osadzana na określonej powierzchni niklechelatującej dwuwarstwy przy danej koncentracji białka rozpuszczalnego.

W tym celu nanosimy dwuwarstwy na szklane kulek o średnicy pięciu mikrometrów. Inkubujemy szklane kuleczki z roztworami białek w warunkach zbliżonych do tych w komorach przepływowych wykorzystywanych do obrazowania, a następnie odczytujemy gęstość związanych białek za pomocą przepływowego immunofluorometrycznego testu analizy. Do wykrywania białek związanych z powierzchnią stosuje się przeciwciała znakowane FSI o znanej liczbie cząsteczek fluoresceiny na molekułę, natomiast do kalibracji mikrofluorometru przepływowego używa się standardowych kulek fluoresceinowych.

Ustanowimy warunki przybliżone do tych panujących na komórkach prezentujących antygen, z 200 cząsteczkami ICAM-1 na mikrometr kwadratowy oraz od 0,2 do 20 cząsteczek I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 na mikrometr kwadratowy. Złożone dwuwarstwy płaskie tworzą się spontanicznie podczas fuzji liposomów ze szkłem, jednak tylko wtedy, gdy jest ono odpowiednio oczyszczone. Stosujemy roztwór piranianowy, świeżo przygotowaną mieszaninę kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru, która niszczy wszelką materię organiczną i sprawia, że powierzchnia szkła staje się bardzo hydrofilowa.

Podczas pracy z roztworem piranha stosujemy pełną odzież ochronną, w tym fartuch kwasoodporny oraz ciężkie rękawice kwasoodporne. Odpady muszą być starannie oddzielone od odpadów organicznych i odpowiednio zutylizowane. Aby przygotować kwasowy roztwór piranha, należy dodać 75 milliliters skoncentrowanego kwasu siarkowego do suchego zlewka, a następnie ostrożnie dodać 25 milliliters 30% nadtlenku wodoru.

Roztwór szybko nagrzewa się do temperatury powyżej 100 °C, następnie zanurz suche szkiełka zakrywkowe w roztworze na 15 minut. Po tej inkubacji w odczynniku piranha, zanurz szkiełka zakrywkowe w wodzie oczyszczonej, a następnie płucz je przez minutę z każdej strony. Następnie wysusz szkiełka zakrywkowe, używając pompy próżniowej, aby odprowadzić wodę oczyszczoną.

Pozostaw roztwór piranha do ostygnięcia, a następnie przelej go do pojemnika na odpady piranha, który znajduje się w dygestorium z niedociśniętą pokrywką i odpowiednim oznakowaniem, aby utworzyć warstwy. W naszym laboratorium stosujemy komory bi FCS two, które mają zaletę w postaci zintegrowanego systemu grzewczego. System FCS two znajduje się na stalowej podstawie, która zaciska razem rozdzielacz mikrofluidyczny z 0,5 mm uszczelką górną oraz szkiełkiem mikroakweduktu pokrytym tlenkiem indu i cyny w celu ogrzewania jednej z powierzchni, podczas gdy druga strona posiada kanał fluidyczny.

Bezpylna uszczelka o grubości 0,25 milimetra, która definiuje wysokość komory przepływowej, oraz oczyszczone w roztworze piraniny okrągłe szkiełko nakrywowe o średnicy 40 milimetrów, na którym tworzona jest dwuwarstwa, służą do montażu komory przepływowej i tworzenia dwuwarstw płaskich. Umieść rozdzielacz z rurkami skierowanymi do góry na płaskiej powierzchni. Następnie umieść uszczelkę o grubości 0,5 milimetra tak, aby otwory znajdowały się nad rurkami płynowymi, i upewnij się, że przylega ona płasko.

Ostrożnie umieść slajd z mikroakweduktem kanałami płynowymi skierowanymi do góry i upewnij się, że przylega on płasko, nie wywierając żadnego nacisku w dół, aż do momentu zweryfikowania, czy otwory w slajdzie są wyrównane z rurkami mikroprzepływowymi. Następnie połóż wolną od kurzu uszczelkę o grubości 0,25 millimeter z prostokątnym wycięciem na wierzchu slajdu z mikroakweduktem w taki sposób, aby wycięcie pokrywało się z kanałami płynowymi i nie było widocznych dużych przestrzeni powietrznych. Nanieś do pięciu kropel zawiesiny liposomów o objętości 1 µL na powierzchnię slajdu z mikroakweduktem w taki wzór, aby odległość od środka do środka każdej kropli wynosiła 2,5 millimeter. Pięć kropel liposomów może mieć różne składy, lecz w tym przypadku utworzymy tylko dwie dwuwarstwy: jedną bez lipidów chelatujących nikiel oraz jedną z 10% lipidów chelatujących nikiel.

Po naniesieniu kropel ostrożnie i jednym płynnym ruchem połóż szkiełko nakrywkę na powierzchni, a następnie jak najszybciej przymocuj ją do podstawki. Krople liposomów powinny stykać się ze szkiełkiem nakrywką. Kontakt ten nie powinien zostać przerwany, ponieważ dwuwarstwy prawdopodobnie już się utworzyły, a wszelkie zakłócenia mogą doprowadzić do powstania wadliwych dwuwarstw.

W tym momencie należy pamiętać o zaznaczeniu pozycji dwuwarstw na szkiełku za pomocą kilku małych kropek tuszem, aby ułatwić ustawienie szkiełka podstawowego na mikroskopie. Należy odczekać 20 minut, aby upewnić się, że układ osiągnął stan równowagi; wszystkie roztwory należy przenieść za pomocą strzykawki o pojemności 20 milliliter połączonej z około 20 centymetrów elastycznego przewodu i trójdrożnego kurka. Inny port kurka jest następnie połączony z komorą przepływową krótkim odcinkiem przewodu, aby zminimalizować objętość martwą między kurkiem a komorą przepływową.

Napełnić strzykawkę solą fizjologiczną buforowaną HEPS zawierającą chlorek magnezu, chlorek wapnia, glukozę i albuminę surowiczą człowieka. Przepłukać przewody i kurek, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie podłączyć strzykawkę do komór przepływowych i przepchnąć pięć mililitrów płynu jednym ruchem, upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie przechodzą nad dwuwarstwą.

W tym momencie dysponują Państwo dwuwarstwami, do których można wprowadzić białka z etykietą His. Należy je najpierw zablokować kazeiną i naładować niklem. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem kazeiny i jonów niklu, a następnie podłącz ją do bocznego portu, dbając o to, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza.

Po wstrzyknięciu roztworu odczekać 20 minut, aby umożliwić całkowite blokowanie. Następnie wypłukać roztwór blokujący za pomocą H-B-S-H-S-A przy użyciu strzykawki o pojemności 20 mililitrów. Teraz wstrzyknąć 0,5 mililitra roztworu H-B-S-H-S-A zawierającego ICAM one z tagiem poli-histydynowym oraz IEK.

W tym eksperymencie ICAM-1 jest znakowany SCI-5. Dzięki temu oddziaływania LFA-1 z ICAM-1 można śledzić poprzez obrazowanie reorganizacji ICAM-1 w dwuwarstwie. Pozostaw białko na 30 minut, aby związało się z dwuwarstwą naładowaną niklem; w tym czasie białko przylega do dwuwarstwy. Przymocuj celę przepływową do mikroskopu odwróconego za pomocą specjalnego wkładu do stolika.

Następnie podłącz elektronikę grzewczą, aby umożliwić systemowi wyrównanie temperatury do 37 °C. Wykorzystując wcześniej naniesione oznaczenia, ustaw komórkę przepływową tak, aby obiektyw był wyrównany z jedną z dwuwarstw, a następnie użyj mikroskopii refleksyjnej interferencyjnej w celu zlokalizowania płaszczyzny ogniskowej, ostrząc na obrazie światła odbitego przysłony polowej. Na koniec wypłucz niezwiązane ICAM-1 z komórek przepływowych.

Należy zarejestrować obrazy fluorescencyjne dwuwarstwy w kanale ICAM 1 w trybach turf M oraz widefield. Służy to potwierdzeniu wiązania ICAM 1 na dwuwarstwie powlekanej niklem w odniesieniu do dwuwarstwy wolnej od niklu. Komora przepływowa jest teraz gotowa do wprowadzenia komórek.

W tej demonstracji wykorzystamy transgeniczne limfocyty T z receptorem TCR ND, które zostały transdukowane retrowirusem kodującym GFP-Zap70. Komórki należy raz przemyć roztworem HBSS z dodatkiem HSA, a następnie inkubować z przeciwciałem FAB znakowanym Alexa 568 skierowanym przeciwko receptorowi limfocytów T, co pozwoli nam śledzić mikroskupiska TCR. Po 15 minutach rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10. Pozwala to na dostateczne rozcieńczenie przeciwciała H 57, aby nie zakłócało ono obrazowania TIRF, przy jednoczesnym zachowaniu nasycenia receptora limfocytów T w momencie, gdy początkowo związane fragmenty FAB zaczynają dyssocjować. Następnie wstrzyknąć komórki do komory przepływowej.

Obrazujemy synapsę immunologiczną w trybie trzech kolorów w trybie M. Obejmuje to tworzenie oddziaływań LFA-1 i ICAM-1, formowanie klastrów TCR oraz cSMAC, a także trwałe tworzenie się mikroklastrów TCR, które rekrutują GFP-ZAP-70. Niektóre z tych wyników są oczywiste podczas akwizycji, podczas gdy inne będą wymagały analizy po przetwarzaniu, aby można je było w pełni ocenić.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wykorzystać wspierane płaskie dwuwarstwy do badania synapsy immunologicznej. Aby te eksperymenty przebiegły pomyślnie, bardzo ważne jest, aby limfocyty T były w bardzo dobrej kondycji; należy pamiętać, że roztwór soli fizjologicznej z buforem PPS nie nadaje się do długotrwałej hodowli limfocytów T. Dlatego należy wyjąć komórki z hodowli, umieścić je w tym medium, a następnie bardzo szybko wykorzystać.

Jeśli chcą Państwo przeprowadzić eksperymenty długoterminowe, istnieją bardzo dobre formulacje pożywek bezsurowiczych, które można zastosować zamiast roztworu soli fizjologicznej PBS. Pozwoli to na znacznie dłuższe utrzymanie żywotności komórek w przypadku badania późniejszych punktów końcowych, takich jak produkcja cytokin czy proliferacja limfocytów T. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.