Name: Obsługiwane dwuwarstwy płaskie do tworzenia badania synaps immunologicznych i kinaps (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę tworzenia dwuwarstw płaskich do badania synaps immunologicznych z wykorzystaniem mikroskopii TIRF. Technika umożliwia wizualizację dynamiki formowania się synaps i roli białek adhezyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Przygotowanie lipidów
<ol>
<li>W celu przywiązania białek do górnej warstwy dwuwarstwy lipidowej stosujemy lipidy chelatujące Ni2+ , które kotwiczą białka rekombinowane z poli-histydynowymi znacznikami. Niektóre typy komórek mogą przylegać niespecyficznie do dwuwarstw powlekanych Ni2+, lecz limfocyty T zazwyczaj tego nie robią, co sprawia, że ta&nbsp;metoda jest optymalna do badania aktywacji limfocytów T.</li>
<li>Roztwór dwuwarstwy lipidowej przygotowuje się poprzez odważenie odpowiednich ilości 20% lipidów chelatujących Ni2+ oraz 80% fosfatydylocholiny do probówki szklanej z 1-2 ml chloroformu i metanolu. <ol>
<li>Odparuj rozpuszczalnik w strumieniu azotu w ciepłej (30-37°C) kąpieli wodnej. Zazwyczaj zajmuje to około 15 minut.</li>
<li>Usuń pozostały rozpuszczalnik w wysokiej próżni, korzystając z liofilizatora przez 90 minut.</li>
</ol></li>
<li>Rozpuść lipidy w 2% detergencie N-oktyloglukozydzie w buforze Tris-solnym, co&nbsp;tworzy roztwór mieszanych miceli detergentowo-fosfolipidowych. Końcowe stężenie fosfolipidów powinno wynosić 0.4 mM. Aby utworzyć liposomy, poddaj ten roztwór dializie przeciwko trzem zmianom buforu Tris-solnego w celu usunięcia detergentu i sformowania liposomów. Zazwyczaj pracujemy z objętościami rzędu 1 ml, używając membran Spectra/por #2 o średnicy 6 mm i progu odcięcia około 10 kDa. Należy uważać, aby podczas zaciskania rurek nie wprowadzić pęcherzyków powietrzas. Zazwyczaj filtrujemy ten roztwór sterylnie i przeprowadzamy dializę w warunkach czystych, operując w rękawicach sterylizowanych 70% etanolem.</li>
<li>Roztwór ten powinien być krystalicznie przejrzysty. Przechowuje się go pod gazem argonowym, aby zapobiec utlenianiu. Jeśli roztwór jest mętny, oznacza to, że powstały&nbsp;pęcherzyki wielowarstwowe i należy powtórzyć procedurę.</li>
</ol>
2. Określanie ilości ICAM-1 i MHC osadzonych na płaskiej dwuwarstwie
<ol>
<li>W celu przygotowania eksperymentu konieczne jest najpierw określenie, jaka ilość ICAM-1 i MHC jest osadzona na danej powierzchni dwuwarstwy chelatującej Ni2+ przy określonym stężeniu białka rozpuszczalnego. Aby to osiągnąć, należy osadzić dwuwarstwy na szklanych kuleczkach o średnicy 5 mikrometrów, inkubować kuleczki z roztworami białek w warunkach zbliżonych do tych w komorach przepływowych używanych do obrazowania, a następnie odczytać gęstość związanego białka za pomocą przepływowego testu immunofluorymetrycznego.</li>
<li>Do wykrywania białek związanych z powierzchnią wykorzystuje się przeciwciała znakowane FITC o znanej liczbie cząsteczek fluoresceiny na jedną cząsteczkę. Do kalibracji mikrofluorymetru przepływowego używa się standardowych kuleczek fluoresceiny.</li>
<li>Ustanowimy warunki zbliżone do tych występujących na komórkach prezentujących antygen, z 200 cząsteczkami/μm2 ICAM-1 oraz 0,2-20 cząsteczkami/μm2 kompleksu I-Ek-MCC91-103. </li>
</ol>
3. Czyszczenie szkiełek podstawowych do tworzenia planarnych dwuwarstw
<ol>
<li>Planarne dwuwarstwy tworzą się spontanicznie, gdy liposomy łączą się ze szkłem, ale tylko wtedy, gdy szkło jest odpowiednio oczyszczone.</li>
<li>Podczas pracy z odczynnikiem Piranha nosimy pełną odzież ochronną, w tym fartuch kwasoodporny oraz ciężkie, kwasoodporne rękawice. Należy starannie oddzielić &nbsp;odpady od odpadów organicznych i zutylizować je w odpowiedni sposób.</li>
<li>Aby przygotować roztwór Piranha, do suchego zlewka należy wlać 75 ml stężonego kwasu siarkowego, a następnie ostrożnie dodać 25 ml 30% nadtlenku wodoru. Roztwór gwałtownie nagrzewa się do temperatury powyżej 100°C.</li>
<li>Suche szkiełka zakrywowe należy zanurzyć w roztworze na 15 minut. Następnie wyjąć je z roztworu i płukać w wodzie oczyszczonej przez minutę z każdej strony. Wysuszyć szkiełka zakrywowe, używając odsysania próżniowego do odprowadzenia wody oczyszczonej. Pozostawić roztwór Piranha do ochłonięcia, a następnie przelać go do pojemnika na odpady z odczynnikiem Piranha, który pozostaje z luźno zakręconą zakrętką i jest wyraźnie oznakowany w dygestorium. Po przygotowaniu wszystkich liposomów, szkiełek zakrywowych i białek synapsa immunologiczna jest gotowa do utworzenia. </li>
</ol>
4. Formowanie dwuwarstw
<ol>
<li>W celu utworzenia dwuwarstw, w naszym laboratorium stosujemy komory Bioptechs FCSII, które oferują zaletę w postaci zintegrowanego systemu grzewczego. System FCSII opiera się na podstawie ze stali nierdzewnej, która zaciska razem rozdzielacz mikroprzepływowy z górną uszczelką o grubości 0,5 mm, szkiełko mikroakweduktowe powlekone tlenkiem indu i cyny w celu ogrzewania jednej z powierzchni (z rowkiem płynowym po drugiej stronie), beztlenową uszczelką o grubości 0,25 mm definiującą wysokość komory przepływowej oraz oczyszczone w roztworze Piranha okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 40 mm, na którym tworzona jest dwuwarstwa.</li>
<li>Podczas gdy szkiełko nakrywkowe, na którym tworzona jest dwuwarstwa, musi być silnie hydrofilowe i czyste, szkiełko mikroakweduktowe w rzeczywistości działa lepiej, gdy jest bardziej hydrofobowe. Zwiększenie hydrofobowości mikroakweduktu osiąga się poprzez traktowanie go 1% HSA przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie płukanie czystą wodą i całkowite wysuszenie po tym procesie kondycjonowania, a także pomiędzy kolejnymi użyciami. Powłoka z denaturowanych białek pozostawiona po tej procedurze pozwala 1 μl zawiesiny liposomów utworzyć okrągłą, półsferyczną kroplę o wysokości &gt;0,25 mm.</li>
<li>Aby złożyć ogniwo przepływowe i utworzyć płaskie dwuwarstwy, należy umieścić rozdzielacz z rurkami skierowanymi do góry na płaskiej powierzchni. Następnie należy położyć uszczelkę 0,5 mm tak, aby otwory znajdowały się nad rurkami płynowymi, upewniając się, że przylega ona płasko. Delikatnie należy położyć szkiełko mikroakweduktowe na uszczelce kanałami płynowymi do góry, dbając o to, by osiadło płasko bez wywierania nacisku w dół, aż do momentu potwierdzenia, że otwory w szkiełku pokrywają się z rurkami mikroprzływowymi. Na wierzchu szkiełka mikroakweduktowego należy położyć beztlenową uszczelkę 0,25 mm z prostokątnym wycięciem w taki sposób, aby kanał był wyrównany z kanałami płynowymi i nie występowały duże przestrzenie powietrzne.</li>
<li>Na powierzchni szkiełka mikroakweduktowego należy nanieść do 5 kropli zawiesiny liposomów o objętości 1 μl każda, w taki sposób, aby odległość od środka do środka między każdą kroplą wynosiła 2,5 mm. Pięć kropli liposomów może mieć różny skład, ale w tym przypadku utworzymy tylko dwie dwuwarstwy: jedną bez lipidów chelatujących Ni2++ i jedną z 10% lipidów chelatujących Ni2++.</li>
<li>Po umieszczeniu kropli należy ostrożnie i jednym ruchem położyć szkiełko nakrywkowe na powierzchni. Należy jak najszybciej zacisnąć całość na podstawie. Krople liposomów powinny zetknąć się ze szkiełkiem nakrywkowym. Kontakt ten nie może zostać przerwany, ponieważ dwuwarstwy prawdopodobnie już się utworzyły; jakiekolwiek zaburzenia mogą doprowadzić do powstania wadliwych dwuwarstw.</li>
<li>Ważne jest, aby zaznaczyć pozycje dwuwarstw za pomocą kilku małych plamek tuszu na szkiełku mikroakweduktowym, co ułatwi pozycjonowanie szkiełka nakrywkowego pod mikroskopem. Należy odczekać 20 minut, aby system osiągnął stan równowagi. Wszystkie roztwory należy przesyłać za pomocą strzykawki 20 ml podłączonej do około 20 cm elastycznej rurki i trójdrożnego kranu. Inny port kranu należy połączyć z ogniwem przepływowym krótkim odcinkiem rurki, aby zminimalizować objętość martwą między kranem a ogniwem. Strzykawkę należy napełnić roztworem soli w buforze HEPES zawierającym 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 1% albuminy surowicy ludzkiej.</li>
<li>Należy przepłukać rurkę i kran, aby nie było w nich pęcherzyków powietrza. Po podłączeniu do ogniw przepływowych należy jednym ruchem przepchnąć 5 ml cieczy, upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie przechodzą nad dwuwarstwą. W ten sposób dwuwarstwy są gotowe.</li>
</ol>
Niniejszy artykuł wideo uzupełnia publikację „Hunter to Gatherer and Back: Immunological Synapses and Kinapses as Variations on the Theme of Amoeboid Locomotion” autorstwa <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a>, opublikowaną w <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">Annual Review of Cell and Developmental Biology</a>, tom 24, 2008.

wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Wspierane płaskie dwuwarstwy lipidowe są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. Aby naśladować oddziaływania między limfocytami a komórkami prezentującymi antygen, wykorzystujemy lipidy chelatujące jony Ni2+ do zakotwiczenia rekombinowanych białek adhezji komórkowej oraz białek MHC z poli-histydynowymi znacznikami w górnej warstwie dwuwarstwy. Płaskie dwuwarstwy generuje się poprzez przygotowanie lipidów, przygotowanie powierzchni szklanych, na których powstanie dwuwarstwa, a następnie formowanie dwuwarstwy w specjalnej komorze zawierającej przepływową komórkę pomiarową, do której dodawane są limfocyty. Następnie dwuwarstwy nasyca się niklem i dodaje rekombinowane białka z histydynowym znacznikiem. Na koniec do komórki przepływowej wstrzykuje się limfocyty, a następnie za pomocą mikroskopii TIRF można obrazować tworzenie się synapsy oraz mechanizmy kontrolujące lokomocję limfocytów T, miejsca segregacji receptorów oraz miejsca ich degradacji.

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Wspierane płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. Aby naśladować oddziaływania...

Witajcie, jestem Mike Dustin z Instytutu Geral oraz Szkoły Medycznej Uniwersytetu Nowojorskiego. Dzisiaj przeprowadzę Państwa przez procedurę tworzenia wspierających płaskich warstw biologicznych do badania synapsy immunologicznej. Zatem zaczynajmy.Aby stworzyć dwuwarstwę lipidową, przygotowujemy w probówce szklanej odpowiednie ilości roztworu składającego się z 20% lipidu chelatującego nikiel i 80% fosfatydylocholiny w jednym do dwóch mililitrów chloroformu z metanolem. Pierwszym krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika pod strumieniem gazu azotowego w ciepłej kąpieli wodnej o temperaturze od 30 do 37 °C. Zazwyczaj trwa to około 15 minut.Następnie usuń pozostały rozpuszczalnik w wysokiej próżni za pomocą liofilizatora przez 90 minut. Potem rozpuść lipidy w buforze soli fizjologicznej z dodatkiem 2%N detergentu octyloglukozydowego do końcowego stężenia 0,4 millimolarna. W ten sposób powstanie roztwór mieszanych miceli detergentowo-fosfolipidowych służących do formowania liposomów.Roztwór ten dializuje się przeciwko trzem zmianom soli Tris w celu usunięcia detergentu i utworzenia liposomów. Zazwyczaj pracujemy z objętościami rzędu jednego mililitra, używając rurek o średnicy sześciu

supported-planar-bilayers-for-formation-study-immunological-synapses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obsługiwane dwuwarstwy płaskie do tworzenia badania synaps immunologicznych i kinaps

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Ten film demonstruje technikę wizualizacji powstawania synapsy immunologicznej w komórkach NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej (SLB). SLB jest najpierw znakowany ligandem receptora aktywującego komórki NK znakowanym fluoroforem, a następnie inkubacją z komórkami NK. Następnie komórki są barwione pod kątem spolimeryzowanych granulek litycznych aktyny i perforyno-dodatniej. Takie podejście umożliwia wizualizację powstawania synaps za pomocą mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED).

Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Poniżej opisano dwa podejścia do charakteryzacji zdarzeń polaryzacji komórkowej w limfocytach B podczas formowania IS. Pierwsze obejmuje ilościową analizę rekrutacji organelli i reorganizacji cytoszkieletu w błonie synaptycznej. Drugie to podejście biochemiczne, którego celem jest charakterystyka zmian w składzie centrosomy, która ulega polaryzacji w synapsie immunologicznej.

Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas formowania się synapsy immunologicznej

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę tworzenia dwuwarstw płaskich do badania synaps immunologicznych z wykorzystaniem mikroskopii TIRF. Technika umożliwia wizualizację dynamiki formowania się synaps i roli białek adhezyjnych.

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Przeglądaj więcej filmów