Name: Przygotowanie i utrzymanie neuronów zwojów korzenia grzbietowego w kulturach przedziałowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Naucz się przygotowywać neurony zwojów korzenia grzbietowego w kulturach przedziałowych. Ta metoda umożliwia badanie sygnałowania neurotrofin i wzrostu aksonów w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Katharinie Cosker i Stephanie Courchesne za pomocne dyskusje.

Przygotowanie odczynników
<ol>
<li>Powlekanie kolagenem: pokryć kolagenem płytki do hodowli tkanek p35 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C na 2 dni przed nasmarowaniem przegród. Końcowe stężenie kolagenu powinno wynosić .71 mg/ml w rozcieńczeniu w .001N HCl. Następnie dodać 1 ml mieszaniny na płytkę.</li>
<li>Smarowanie aplikatorów: w celu napełnienia aplikatora smaru należy najpierw napełnić strzykawkę 60mL smarem próżniowym Corning. Użyć strzykawki do napełnienia aplikatora smaru, zawinąć go w folię, a następnie autoklawować przez 45 minut.</li>
<li>Przegrody teflonowe: przegrody mogą być ponownie wykorzystane po każdym eksperymencie, ale muszą zostać najpierw odpowiednio oczyszczone. Zdjąć przegrodę z płytki, wytrzeć cały pozostały smar i umieścić w kwasie siarkowym na 2 dni. Po wyjęciu z kwasu płukać wodą 3X, gotować przez 20 minut, pozostawić do wyschnięcia, umieścić w szklanej płytce Petri p100 i autoklawować przez 20 minut.</li>
<li>N2-metyloceluloza: odważyć 1,5g metylocelulozy i umieścić w butelce 500mL. Dodać mieszadło magnetyczne i autoklawować przez 20 minut w cyklu suchym (od tego momentu wszystkie prace muszą być wykonywane w warunkach sterylnych). Następnie dodać 500 mL pożywki bezsurowiczej (N2) i mieszać w chłodni do czasu rozpuszczenia. Rozdzielić na alykwoaty w probówkach stożkowych 50 mL i zamrozić w temperaturze -20°C. W celu przygotowania roztworu roboczego, rozdzielić jeden z alykwoatów 50 mL do probówek 1mL i zamrozić w temperaturze -20°C.</li>
<li>Pożywka DRG: DMEM, 5% inaktywowanej termicznie surowicy koni oraz 1% penicyliny i streptomycyny.</li>
<li>Pożywka DRGN 100ng/mL: Stężenie zapasowe zarówno czynnika wzrostu nerwów (NGF), jak i czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) wynosi 1mg/mL. Rozcieńczyć każdą z neurotrofin w stosunku 1:10 000 w pożywce DRG. Hodowle można prowadzić w samym NGF; zmienia to zestaw neuronów, które przeżywają w hodowlach. Uwaga: W razie potrzeby stosuje się (cytydynę arabinozydową) AraC o stężeniu 1uM, w końcowym stężeniu 0,3uM. Zahamuje to wzrost komórek Schwanna i innych komórek glejowych. </li>
<li>Pożywka DRGN 10ng/mL: rozcieńczyć pożywkę DRGN 100ng/mL (1:10) pożywką DRG. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Narzędzie do opierzenia strzały i zestaw klejący do mocowania lotek do trzonów strzał, pokazujące sprzęt." width="392" height="294" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Narzędzia potrzebne do przygotowania układu </li>
</ol>
Przygotowanie komór z przegrodami (rozpocznij ten proces 1-2 dni przed sekcją)
<ol>
<li>Wykonaj nacięcie w środku pokrytej kolagenem szalki p35, wykonując ruch na zewnątrz.</li>
<li>Nanieś 30ul N2-metylocelulozy na środek nacięcia. Odstaw szalki do czasu nasmarowania dzielnika.</li>
<li>Przymocuj adapter Luer-lock o rozmiarze 23G do aplikatora smaru. Chwyć teflonowy dzielnik kleszczykami hemostatycznymi pod kątem 90° i połóż go płasko, stroną dzielnika do góry, pod mikroskopem. Nanieś smar wzdłuż dzielnika, upewniając się, że przy każdym ustawieniu adaptera w nowym punkcie początkowym, jest on wprowadzany w smar z poprzedniego kroku, tak aby powstała ciągła linia smaru (patrz schemat). Po naniesieniu smaru na cały dzielnik, odwróć jedną z przygotowanych szalek p35 do góry dnem i ustaw ją tak, aby N2-metyloceluloza znajdowała się nad środkową komorą. Dociśnij dno szalki za pomocą pęsety. Pamiętaj, aby docisnąć wnętrze dzielnika w czterech narożnikach (lewy górny, prawy dolny, prawy górny, lewy dolny, zaznaczone na schemacie jako „X”). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Schemat testu chemotaksji, ilustrujący ruch organizmu w kierunku bodźca chemicznego, z barierą z smaru." width="171" height="183" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Kroki smarowania dzielnika Uwaga: Ważne jest, aby docisnąć dzielnik wystarczająco mocno, by smar stworzył całkową szczelność z szalką, jednak przy zbyt dużym nacisku aksony nie przedostaną się do komór bocznych. Zdejmij kleszczyki hemostatyczne, odwróć je i zwolnij zacisk dzielnika. Na koniec umieść szalkę z mocno przymocowanym dzielnikiem pod mikroskopem, ustawiając ostrość na dnie środkowej komory. Za pomocą aplikatora smaru wykonaj małą barierę (.25cm), aby komórki po umieszczeniu w środkowej komorze nie mogły z niej wypłynąć. </li>
<li>Po przygotowaniu kilku kultur, wlej medium DRG do każdej z komór bocznych i umieść je w inkubatorze, w którym będą utrzymywane komórki. Pozostaw kultury na kilka godzin, a następnie sprawdź, czy nie występują wycieki. Jeśli medium przedostało się do środkowej komory, kultura jest niezdatna do użytku. Uwaga: Podczas nauki tej techniki ważne jest przygotowanie większej liczby kultur niż wymagana do eksperymentu, ponieważ kilka z nich może okazać się nieszczelnych. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Równowaga statyczna, schemat porównawczy zaworów; ilustrujący prawidłowe uszczelnienie w porównaniu z problemami z wyciekami." width="254" height="191" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3: Kultura „dobra vs nieszczelna” </li>
</ol>
Utrzymywanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w kulturach przedziałowych
<ol>
<li>Dzień 1:  Wymień pożywkę DRG w bocznych komorach na pożywkę DRGN 100ng/mL + AraC.  Przeprowadź sekcję i dodaj komórki do komory środkowej (100 000 komórek).  </li>
<li>Dzień 2:  Dodaj pożywkę 10ng/mL + AraC na zewnątrz przegrody teflonowej, aż pożywka przeleje się przez barierę smarową i wymieni płyn z komorą środkową.</li>
<li>Dzień 3:  Wymień pożywkę w bocznych komorach na DRGN 100ng/mL bez AraC, a w otoczeniu na DRGN 10ng/mL bez AraC.</li>
<li>Dzień 6:  Wymień pożywkę w bocznych komorach na 1ng/mL + AraC, a w otoczeniu na pożywkę DRG + AraC.</li>
<li>Dzień 9:  Wykorzystaj do eksperymentów. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Obrazowanie neuronalne; mikroskopia fluorescencyjna, ciała komórkowe i aksony dystalne; schemat porównawczy." width="267" height="148" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4: Obrazy IHC ciał komórkowych i aksonów dystalnych Uwaga:  Podczas wymiany pożywki ważne jest odessanie cieczy z góry każdej bocznej komory. Ponadto nigdy nie wymieniaj pożywki bezpośrednio z komory środkowej, lecz jedynie z otoczenia, pozwalając jej przepłynąć przez barierę smarową do środka. </li>
</ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

W tym filmie zaprezentowano sposób przygotowania i utrzymania komór przedzielonych do hodowli neuronów DRG. Prawidłowo wykonany system ten umożliwia oddzielenie ciała komórki od aksonu, co pozwala na badanie mechanizmów, dzięki którym neurotrofiny przekazują sygnały wzdłuż długich aksonów. Dzięki izolacji płynowej między przedziałami możliwe jest selektywne stymulowanie lub traktowanie jednego przedziału bez wpływania na pozostałe. Hodowle w komorach przedzielonych mogą wspierać inne typy komórek, w tym neurony współczul...

<table><tbody><tr><td>kolagen</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>metyloceluloza N2 400CPS</td><td>Odczynnik</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przegroda teflonowa</td><td>Inne</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>dostępne są wiele innych rodzajów przegród</td></tr><tr><td>grabiak igłowy</td><td>Narzędzie</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>aplikator do smaru</td><td>Narzędzie</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Odczynnik</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Odczynnik</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>adapter Luer stub 23G</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>kleszczyki hemostatyczne pod kątem 90&amp;#x00B0;</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurony wysyłają wypustki aksonalne, które znajdują się daleko od ciała komórki, aby unerwić tkanki docelowe, w których czynniki wzrostu pochodzące z tkanki docelowej są niezbędne dla przeżycia i funkcjonowania neuronów. Neurotrofiny są szczególnie wymagane do podtrzymania przeżycia i różnicowania unerwiających neuronów sensorycznych, jednak kwestia tego, w jaki sposób neurotrofiny pochodzące z tkanki docelowej przekazują sygnały do ciała komórki unerwiających neuronów, jest przedmiotem intensywnych badań od ponad 30 lat. Najbardziej powszechnie akceptowany model transportu sygnałów neurotrofin do ciała komórki zakłada, że endosomy sygnałowe przenoszą ten sygnał drogą retrogradną wzdłuż aksonu. W celu zbadania transportu retrogradnego Robert Campenot opracował pierwotnie system hodowli, w którym ciała komórek są odizolowane od ich aksonów. Technika przygotowywania tych komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych odtwarza selektywną stymulację zakończeń neuronów, która zachodzi in vivo po uwolnieniu neurotrofin pochodzących z tkanki docelowej. Zdarzenia sygnalizacji retrogradnej, które wymagają zależnego od mikrotubul transportu retrogradnego na duże odległości, mają istotne znaczenie dla leczenia schorzeń neurodegeneracyjnych.

W niniejszym opracowaniu opisujemy technikę przygotowywania i utrzymywania komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych z zwojów korzeni grzbietowych.

Przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych

Neurony wysyłają wypustki aksonalne, które oddalają się od ciała komórki, aby unerwić tkanki docelowe, w których czynniki wzrostu pochodzenia tkankowego są niezbędne do...

Procedura rozpoczyna się od wykonania rysy za pomocą grzebienia z pinami w centrum płytki pokrytej kolagenem, a następnie naniesienia 30 µL metylocelulozy na środek rysy. Każdy przegródkę należy nasmarować za pomocą aplikatora do smaru i przymocować do płytki pokrytej kolagenem. Do środkowej komory należy wprowadzić 100 000 komórek z embrionów szczura w 15. dniu rozwoju (E 15).Po dziewięciu dniach komórki wykształcą aksony w bocznej komorze i będą gotowe do eksperymentów. Witam, nazywam się Maria Murphy i reprezentuję laboratorium dr Rosalyn Siegel z Zakładu Onkologii Dziecięcej w Dana-Farber Cancer Institute. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania i utrzymania neuronów z zwojów korzeniowych grzbietowych w hodowlach komorowych.Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania sygnalizacji neurotrofin. Przejdźmy zatem do pracy. Przed przygotowaniem komór z przegrodami, płytki do hodowli tkankowej P 35 muszą zostać pokryte kolagenem.Aby to osiągnąć, należy dodać do płytek jeden mililitr roztworu kolagenu o stężeniu 0,71 mg/mL w 0,001 N HCl i inkubować je w temperaturze 37 °C przez dwa dni. Po dwóch dniach, za pomocą grzebienia z pinami, należy wykonać zarysowanie na środk

preparation-maintenance-dorsal-root-ganglia-neurons-compartmented

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie i utrzymanie neuronów zwojów korzenia grzbietowego w kulturach przedziałowych

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Ten film demonstruje procedurę izolowania neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od zarodków szczurów i współhodowli ich z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Wyizolowane DRG są przetwarzane w celu wyizolowania neuronów i komórek glejowych. Wyizolowane komórki są hodowane w celu oczyszczenia neuronów, które są następnie hodowane wspólnie z komórkami podobnymi do komórek Schwanna (SCLC) w pożywce do wspólnej hodowli. Interakcja z neuronami DRG...

Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Ten film pokazuje konstruowanie trzykomorowego systemu hodowli komórkowej przy użyciu kolagenu i niereaktywnego smaru. System ten służy do obserwacji interakcji między komórkami glejaka a aksonami w czasie rzeczywistym.

Przygotowanie pokrytych kolagenem naczyń hodowlanych z przedziałami do hodowli komórek neuronalnych

Wideo pokazuje współtworzenie neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z komórkami Schwanna. Neurony DRG są najpierw hodowane na wstępnie rozciągniętej błonie w celu wyrównania wzrostu aksonów. Następnie wprowadzane są komórki Schwanna, które przyczepiają się do aksonów, izolując je i promując przeżycie i funkcję komórek nerwowych.

Wspólna hodowla komórek Schwanna z neuronami DRG na wstępnie rozciągniętej błonie

Ten film demonstruje metodę pobierania neuronów z grzbietowych zwojów korzeniowych (DRG). DRG z kręgosłupa szczura jest izolowany, traktowany enzymami, a następnie mechanicznie dysocjowany w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Neurony są oddzielane od komórek glejowych za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i hodowane w pożywce wzrostowej.

Technika zbierania i dysocjacji zwojów korzenia grzbietowego dla kultur neuronalnych

Ten film demonstruje model kokulturacyjny eksplantacji zwoju korzenia grzbietowego i komórek Schwanna. W warunkach kokultury kwas askorbinowy sprzyja różnicowaniu komórek Schwanna w formy mielinizujące. Mielinizujące się komórki Schwanna wielokrotnie owijają aksony, aby utworzyć osłonkę mielinową, która jest niezbędna do funkcjonowania nerwów.

Wspólna hodowla eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego z komórkami Schwanna do mielinizacji neuronów

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego (DRG) z kręgosłupa szczura. DRG wycięte z kręgosłupa są traktowane enzymami i mechanicznie dysocjowane w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki są hodowane w pożywce zawierającej inhibitory i czynniki wzrostu, które odpowiednio ograniczają proliferację komórek glejowych i promują wzrost neuronów.

Ustanowienie pierwotnej hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego z kręgosłupa szczura

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Hodowle pierwotne zwojów korzenia grzbietowego (DRG) są często używane do badania funkcji fizjologicznych lub zdarzeń związanych z patologią w neuronach czuciowych. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie lędźwiowych hodowli DRG do wykrywania uwalniania neuroprzekaźników po stymulacji neuropeptydowego receptora FF typu 2 selektywnym agonistą.

Izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

Ten protokół dostarcza techniki do zbierania i hodowli eksplantowanego zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od dorosłych szczurów Sprague Dawley w urządzeniu wielokomorowym (MC).

Zbieranie, osadzanie i hodowla zwojów korzeni grzbietowych w urządzeniach wielokompartmentowych w celu zbadania cech neuronów obwodowych

Naucz się przygotowywać neurony zwojów korzenia grzbietowego w kulturach przedziałowych. Ta metoda umożliwia badanie sygnałowania neurotrofin i wzrostu aksonów w kontrolowanych warunkach.

Przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych

Przeglądaj więcej filmów