Name: 3d cell growth on engineered matrices
Uploaded: 2023-04-30T06:32:19.000Z
Duration: 9 min 35 s
Channel: JoVE

<div class="chapter_text" id="script_0">A cultura do tecido histotípico permite que as células sejam cultivadas em três dimensões, criando assim morfologias in vitro de tecido que imitam de perto a função realista do tecido, que pode ser usada como construções viáveis para reparação de tecidos. Essas culturas são tipicamente estruturas tridimensionais que consistem em um único tipo de célula cultivada em alta densidade. A estrutura tridimensional, também conhecida como andaime, imita a matriz extracelular natural. Dependendo do tipo de célula utilizada, os andaimes podem ser projetados para uma aplicação específica e normalmente atuam como um modelo para tecido biomicíetico. Este vídeo introduzirá os fundamentos das culturas de tecido histotípico, um procedimento para o isolamento das células, e a fabricação e celularização de um andaime de tecido de seda poroso para imitar tecido cardíaco.</div><div class="chapter_text" id="script_1">Todos os tecidos consistem em dois componentes fundamentais, a matriz extracelular e as células específicas do tecido que a habitam. A matriz extracelular é uma rede de proteínas estruturais que criam um ambiente tridimensional para as células ocuparem, e as células dentro dela são destinadas a recapitular os processos fisiológicos nativos do tecido. Atualmente, uma técnica comum utilizada para modelar tecido é a cultura tecidual bidimensional, onde as células são distribuídas em um substrato plano e permitidas a formar um filme fino. Em geral, este método não é confiável para manter um fenótipo in vivo, funções específicas de órgãos e célula a célula ou célula para substrato interações contextuais. A cultura do tecido histotípico alivia essas limitações fornecendo um andaime 3D para que as células cresçam, resultando em uma densa rede de células que imita mais de perto as morfologias celulares nativas e facilita o desenvolvimento de redes intercelulares realistas e vias de comunicação. Uma variedade de redes de polímeros 3D, incluindo hidrogéis e tapetes de seda eletrospun, oferecem maneiras convenientes de cultivar células específicas do tecido em três dimensões. Para povoar esses andaimes, as células devem ser isoladas. As células primárias utilizadas neste vídeo são colhidas a partir do tecido vivo, que é picado e depois digerido em uma solução enzimática para separar as células-alvo da matriz extracelular. Uma vez que as células são isoladas, existem duas técnicas usadas para semear os andaimes. A técnica de gotícula envolve a pipetação de uma solução de células no andaime a uma velocidade lenta e constante. A segunda, ou técnica de suspensão celular, submerge o andaime em uma suspensão celular. Muitas vezes, o andaime e a suspensão são abalados para incentivar a migração celular para a matriz. Ambas as técnicas resultam em construções bio-projetadas com altas densidades celulares. Os seguintes procedimentos envolverão o isolamento das células cardíacas e a técnica de suspensão celular para criar um andaime específico para células cardíacas, pois reterá a morfologia do tecido cardíaco nativo.</div><div class="chapter_text" id="script_2">Para iniciar o processo de isolação de células a partir do tecido doador, comece garantindo que a área de trabalho e os instrumentos de dissecção sejam esterilizados. Em seguida, coloque uma cortina estéril na superfície de trabalho no armário de biosegurança. Coloque os instrumentos cirúrgicos estéreis sobre a cortina sem tocá-los e, em seguida, abra uma lâmina de bisturi estéril de número 20. Após eutanásia da amostra, esterilize a área cirúrgica com uma gaze encharcada de betadina. Quando estiver pronto, proteja a amostra e inicie o procedimento cirúrgico para isolar o tecido de interesse. Neste caso, será o coração. Uma vez excisado, coloque o tecido no gelo na placa de Petri contendo glicose PBS. Remova qualquer sangue residual ou tecido conjuntivo, e depois transfira o tecido para uma placa de Petri com glicose PBS fresca. Em seguida, usando micro-tesouras estéreis e fórceps, pique cuidadosamente as amostras de tecido em cerca de 1 milímetro cúbico. Usando uma pipeta, transfira as peças e tampão para um tubo cônico. Em seguida, remova todos, menos 10 mililitros de tampão. Adicione 7 mililitros de solução de colagenase e, em seguida, agite a mistura a 37 graus Celsius por 7 minutos. Em seguida, gentilmente pipeta 10 vezes para quebrar os pedaços de tecido. Deixe as peças se instalarem e, em seguida, aspire o líquido e descarte-o. Em seguida, repita a digestão e pipeta suavemente a solução para quebrar os pedaços de tecido. Depois que as peças se instalarem, desenhe o supernante e colete-o em um tubo cônico separado de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de solução STOP a cada tubo cônico contendo supernanato para parar a digestão.</div><div class="chapter_text" id="script_3">Agora que as células primárias foram isoladas, vamos fabricar um andaime de tecido de seda poroso. Para começar, despeje 30 mililitros da solução de seda em um molde. Em seguida, espalhe 60 gramas de cloreto de sódio peneirado uniformemente sobre a solução. Em seguida, deixe a seda polimerizar imperturbável à temperatura ambiente por 48 horas. Em seguida, coloque o molde em um forno de 60 graus por 1 hora para finalizar a ligação cruzada e evaporar qualquer líquido restante. Uma vez polimerizado, mergulhe o molde em um béquer de água destilada por 48 horas para tirar o sal. Em seguida, remova o andaime do molde e corte pequenos discos com um soco de biópsia de 5 milímetros. Corte os discos a uma altura de 2 milímetros e, finalmente, remova os centros de cada peça com um soco de biópsia de 2 milímetros para criar um anel. Por fim, autoclave os andaimes em um ciclo úmido por 20 minutos.</div><div class="chapter_text" id="script_4">Com o andaime preparado, vamos começar o processo de semeadura celular. Primeiro, coloque um andaime estéril por poço em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione meio de cultura celular para imergir os andaimes e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura tecidual para equilibrá-los por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, aspire o meio de excesso e, em seguida, adicione a suspensão celular primária isolada aos andaimes. Em seguida, devolva a placa à incubadora e deixe durante a noite para as células se prenderem aos andaimes. Na manhã seguinte, aspire cuidadosamente as células não anexadas e substitua por 200 microliters de meio de cultura celular fresca por poço. O andaime resultante é uma construção porosa com uma alta densidade celular pronta para ser usada.</div><div class="chapter_text" id="script_5">Agora que você aprendeu a realizar a cultura do tecido histotípico, vamos olhar para algumas aplicações práticas desses materiais. A cultura do tecido histotípico pode criar microambientais celulares que imitam tecidos nativos e, como resultado, são capazes de fornecer um modelo adequado para o estudo do comportamento celular em relação a um único tipo de célula. Por exemplo, a fibra 3D em andaimes, que imitam com mais precisão o nicho de células-tronco encontrada in vivo, pode ser semeada com células-tronco pluripotentes para rastrear pistas biológicas e determinar seus efeitos sobre a diferenciação de células-tronco. Este trabalho pode, em última análise, fornecer uma maior compreensão de como as células-tronco se diferenciam e podem oferecer insights sobre o aprimoramento da diferenciação celular e da regeneração para aplicações de engenharia de tecidos. Como culturas dinâmicas, o condicionamento mecânico também pode melhorar o andaime de tecido 3D, submetendo-o a várias cargas mecânicas que o tecido natural pode experimentar in vivo. Aplicando a compressão e as cargas biaxiais durante o crescimento celular, a morfologia celular e a matriz extracelular são alteradas para refletir essas cargas mecânicas. Isso resulta em um andaime de tecido bio-projetado pré-condicionado com uma estrutura celular semelhante ao tecido nativo, tornando-o ideal para implantação em áreas que podem experimentar forças mecânicas semelhantes. Finalmente, construções de tecidos projetadas também podem ser usadas para substituir ou reparar defeitos teciduais. Para isso, o andaime tecidual deve ser primeiro vascularizado, permitindo assim que o sangue se mova livremente através da construção. Uma vez vascularizado, o andaime pode ser transferido e implantado no defeito tecidual para iniciar a reparação. Enxerto bem sucedido pode ser confirmado posteriormente através da histologia, que revela se a construção do tecido reparou completamente a área danificada.</div><div class="chapter_text" id="script_6">Você acabou de assistir a introdução de Jove à cultura de tecido histópico. Agora você deve entender como estruturas 3D simples são preparadas, como as células primárias são isoladas e semeadas em um andaime, e as várias aplicações dessas culturas no campo da bioengenharia. Obrigado por assistir.</div>

cultura histotípica de tecidos

Embora a cultura tecidual bidimensional tenha sido comum há algum tempo, as células se comportam de forma mais realista em uma cultura tridimensional, e mais intimamente imitam o tecido nativo. Este vídeo introduz a cultura do tecido histotípico, onde o crescimento e a propagação de uma linha celular é feito em uma matriz tridimensional projetada para atingir alta densidade celular. Aqui, mostramos a colheita de células do tecido doador, seguida pela cultura celular em uma construção projetada.

Cultura Histotípica de Tecidos

Although two-dimensional tissue culture has been common for some time, cells behave more realistically in a three-dimensional culture, and more closely ...

A cultura de tecidos histotípica permite que as células sejam cultivadas em três dimensões, criando assim morfologias de tecidos in vitro que imitam de perto a função realista do tecido, que podem ser usadas como construções viáveis para o reparo de tecidos. Essas culturas são tipicamente estruturas tridimensionais que consistem em um único tipo de célula cultivada em alta densidade. A estrutura tridimensional, também conhecida como andaime, imita a matriz extracelular natural. Dependendo do tipo de célula usada, os andaimes podem ser projetados para uma aplicação específica e normalmente atuam como um modelo para tecido biomimético. Este vídeo apresentará os fundamentos das culturas de tecidos histotípicos, um procedimento para o isolamento de células e a fabricação e celularização de um andaime de tecido de seda poroso para imitar o tecido cardíaco. Todos os tecidos consistem em dois componentes fundamentais, a matriz extracelular e as células específicas do tecido que a habitam. A matriz extracelular é uma rede de proteínas estruturais que criam um ambiente tridimensional para as células ocuparem, e as células dentro dela destinam-se a recapitular os processos fisiológicos nativos do tecido. Atualmente, uma técnica comum utilizada para modelar tecidos é a cultura de tecidos bidimensional, onde as células são dispensadas em um substrato plano e podem formar um filme fino. Em geral, este método não é confiável para manter um fenótipo in vivo, funções específicas de órgãos e interações contextuais célula a célula ou célula a substrato. A cultura de tecidos histotípica alivia essas limitações, fornecendo um andaime 3D para as células crescerem, resultando em uma densa rede de células que imita mais de perto as morfologias das células nativas e facilita o desenvolvimento de redes intercelulares realistas e vias de comunicação. Uma variedade de redes de polímeros 3D, incluindo hidrogéis e tapetes de seda eletrofiados, oferecem maneiras convenientes de cultivar células específicas de tecidos em três dimensões. Para preencher esses andaimes, as células devem ser isoladas. As células primárias usadas neste vídeo são colhidas de tecido vivo, que é picado e depois digerido em uma solução enzimática para separar as células-alvo da matriz extracelular. Uma vez que as células são isoladas, existem duas técnicas usadas para semear os andaimes. A técnica de gotículas envolve a pipetagem de uma solução de células no andaime a uma taxa lenta e constante. A segunda, ou técnica de suspensão celular, submerge o andaime em uma suspensão celular. Freqüentemente, o andaime e a suspensão são sacudidos para estimular a migração celular para a matriz. Ambas as técnicas resultam em construções de bioengenharia com altas densidades celulares. Os procedimentos a seguir envolverão o isolamento de células cardíacas e a técnica de suspensão celular para criar um andaime específico da célula cardíaca, pois manterá a morfologia do tecido cardíaco nativo. Para iniciar o processo de isolamento de células do tecido doador, comece garantindo que a área de trabalho e os instrumentos de dissecção sejam esterilizados. Em seguida, coloque uma cortina estéril na superfície de trabalho do gabinete de biossegurança. Coloque os instrumentos cirúrgicos estéreis na cortina sem tocá-los e, em seguida, abra uma lâmina de bisturi estéril número 20. Após a eutanásia da amostra, esterilize a área cirúrgica com uma gaze embebida em betadine. Quando estiver pronto, prenda a amostra e inicie o procedimento cirúrgico para isolar o tecido de interesse. Nesse caso, será o coração. Uma vez excisado, coloque o tecido em gelo na placa de Petri contendo glicose PBS. Remova qualquer sangue residual ou tecido conjuntivo e, em seguida, transfira o tecido para uma placa de Petri com glicose PBS fresca. Em seguida, usando microtesouras e pinças estéreis, pique cuidadosamente as amostras de tecido em pedaços de aproximadamente 1 milímetro cúbico. Usando uma pipeta, transfira os pedaços e tampone para um tubo cônico. Em seguida, remova todos, exceto 10 mililitros de tampão. Adicione 7 mililitros de solução de colagenase e agite a mistura a 37 graus Celsius por 7 minutos. Em seguida, pipete suavemente 10 vezes para quebrar os pedaços de tecido. Deixe os pedaços assentarem e, em seguida, aspire o líquido e descarte-o. Em seguida, repita a digestão e pipete suavemente a solução para quebrar os pedaços de tecido. Depois de assentarem os pedaços, retirar o sobrenadante e recolhê-lo num tubo cónico separado de 50 ml. Em seguida, adicione 10 mililitros de solução STOP a cada tubo cônico contendo sobrenadante para interromper a digestão. Agora que as células primárias foram isoladas, vamos fabricar um andaime de tecido de seda poroso. Para começar, despeje 30 mililitros da solução de seda em um molde. Em seguida, espalhe 60 gramas de cloreto de sódio peneirado uniformemente sobre a solução. Em seguida, deixe a seda polimerizar sem ser perturbada em temperatura ambiente por 48 horas. Em seguida, coloque o molde em um forno a 60 graus por 1 hora para finalizar a reticulação e evaporar o líquido restante. Depois de polimerizado, mergulhe o molde em um copo de água destilada por 48 horas para sugar o sal. Em seguida, remova o andaime do molde e corte pequenos discos com um punção de biópsia de 5 milímetros. Apare os discos a uma altura de 2 milímetros e, finalmente, remova os centros de cada peça com um punção de biópsia de 2 milímetros para criar um anel. Por fim, autoclave os andaimes em ciclo úmido por 20 minutos. Com o andaime preparado, vamos começar o processo de semeadura celular. Primeiro, coloque um andaime estéril por poço em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione meio de cultura de células para imergir os andaimes e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos para equilibrá-los por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, aspirar o meio em excesso e, em seguida, adicionar a suspensão de células primárias isolada aos andaimes. Em seguida, retorne a placa para a incubadora e deixe durante a noite para que as células se fixem nos andaimes. Na manhã seguinte, aspire cuidadosamente as células não aderidas e substitua por 200 microlitros de meio de cultura de células frescas por poço. O andaime resultante é uma construção porosa com alta densidade celular pronta para ser usada. Agora que você aprendeu como realizar a cultura de tecidos histotípicos, vejamos algumas aplicações práticas desses materiais. A cultura de tecidos histotípica pode criar microambientes celulares que imitam tecidos nativos e, como resultado, são capazes de fornecer um modelo adequado para o estudo do comportamento celular em relação a um único tipo de célula. Por exemplo, a fibra 3D em andaimes, que imita com mais precisão o nicho de células-tronco encontrado in vivo, pode ser semeada com células-tronco pluripotentes para rastrear pistas biológicas e determinar seus efeitos na diferenciação de células-tronco. Este trabalho pode, em última análise, fornecer uma maior compreensão de como as células-tronco se diferenciam e pode oferecer insights sobre como melhorar a diferenciação e regeneração celular para aplicações de engenharia de tecidos. Como as culturas dinâmicas, o condicionamento mecânico também pode aprimorar o andaime de tecido 3D, submetendo-o a várias cargas mecânicas que o tecido natural pode experimentar in vivo. Ao aplicar compressão e cargas biaxiais durante o crescimento celular, a morfologia celular e a matriz extracelular são alteradas para refletir essas cargas mecânicas. Isso resulta em um andaime de tecido de bioengenharia pré-condicionado com uma estrutura celular semelhante ao tecido nativo, tornando-o ideal para implantação em áreas que podem sofrer forças mecânicas semelhantes. Finalmente, as construções de tecido projetadas também podem ser usadas para substituir ou reparar defeitos de tecido. Para conseguir isso, o andaime de tecido deve primeiro ser vascularizado, permitindo assim que o sangue se mova livremente pela construção. Uma vez vascularizado, o andaime pode ser transferido e implantado no defeito tecidual para iniciar o reparo. O enxerto bem-sucedido pode ser confirmado posteriormente por meio da histologia, que revela se a construção do tecido reparou ou não completamente a área danificada. Você acabou de assistir à introdução de Jove à cultura de tecidos histotípicos. Agora você deve entender como estruturas 3D simples são preparadas, como as células primárias são isoladas e semeadas em um andaime e as várias aplicações dessas culturas no campo da bioengenharia. Obrigado por assistir.

Education

JoVE Science Education

Engineering

Engenharia

Bioengineering

Bioengenharia

Histotypic Tissue Culture

3d cell growth on engineered matrices

Histotypic tissue culture uses an engineered three-dimensional matrix to grow and propagate cells. Compared with common two-dimensional tissue culture, cells in a 3D setting behave more realistically and better mimic native tissue. The method is useful when high cell density is needed.

The process begins by harvesting cells from donor tissue. Those cells are then placed onto an engineered construct for culture. This setup supports growth in a three-dimensional space instead of a flat surface.

3D Cell Growth on Engineered Matrices

overview of biomaterials

Biomaterials in Medicine and Engineering

Biomaterials are materials designed to interact well with biological organisms or molecules. They may come from an organism, be produced by an organism, or be made as a synthetic polymer. Because of these properties, engineers use biomaterials in medicine and other biological applications. These materials are used in tissue engineering, biosensing, and drug delivery. Tissue engineering uses materials to support the growth or repair of tissues. Biosensing uses materials to detect biological...

collagen hydrogels

Porcine Collagen for Tissue Engineering

Collagen is a useful biomaterial with uses that go beyond the lab. It has also found commercial use in photography. In tissue engineering, collagen can be turned into hydrogels that give engineered tissue support and structure. This page follows the path from porcine skin to a collagen hydrogel. Porcine skin is used as the source of collagen. The material is then prepared for use in tissue engineering applications. The video also shows several applications of collagen and the methods used to...

electrospinning of silk biomaterials

Silk Cocoon Processing for Fiber Mats

Silk cocoons can be processed into a soluble material that is useful for making biomaterials. Silk fibers have been used for fabrics and threads for centuries, but turning them into a versatile pre-polymer solution is a newer technique. That solution can then be shaped into materials with controllable mechanical properties. The process begins with silk worm cocoons. The silk is solubilized, or dissolved, so it can be handled as a liquid-like solution. The video then shows how that silk...

overview of biomem devices

BioMEMs in Diagnostics and Miniaturization

Bio-microelectromechanical systems, or BioMEMs, are microscale devices used in diagnostic settings. They work with very small sample and reagent volumes in vivo and in vitro, which means inside a living body or outside it in a lab. These compact systems support bioengineering research and help make diagnostic tools more efficient. BioMEMs can carry out functions such as filtration, sensing, and synthesis on a tiny scale. Using less material can lower costs and improve sensitivity. The...

microfabrication via photolithography

Photolithography for Silicon Wafer Patterning

Photolithography is a common microfabrication method used to pattern a silicon wafer. It uses light to transfer a design onto the wafer surface. This process helps form the basis for many BioMEM devices. The page also shows how photolithography is carried out in a cleanroom. Cleanroom steps are important because they support careful fabrication of small, detailed features. The video ends by introducing applications of this process in BioMEM device production.

soft lithography

Photolithography for Microfluidic Device Making

Photolithography and soft lithography are used to make BioMEM devices such as microfluidic channels. A microscale pattern is copied by curing an elastomeric polymer over a 3D structure. The result is a polymer piece that can serve as part of a biological device. These polymer structures are then used to build a range of tools. Some are microfluidic channels for biosensing applications. Others are microscale bioreactors that let scientists visualize micro-colonies. The process also shows how...

overview of bioprocess engineering

Bioreactors and Protein Production in Bioprocessing

Bioprocessing uses living organisms to make a desired target product. In many cases, that product is a protein made in a bioreactor, which is a controlled vessel for growing cells. This process often relies on genetically engineered organisms. Engineers design the system so the cells can produce proteins at large scale. That approach is central to making biotherapeutics, which are drugs made from biological materials. Biotherapeutics are important medicines for complex diseases such as...

synthetic biology

Engineering Cells to Produce Proteins

Synthetic biology is a bioengineering method for programming cells to make useful products. In many cases, the goal is to genetically modify an organism so it can produce large amounts of a protein. That protein may already be made by the cell, or it may come from a newly inserted DNA sequence. The process depends on changing an organism’s genetic material. This is done with transformation or transfection, two common ways to introduce DNA into cells. The video also shows how this work is...

batch and continuous bioreactors

Growing Cells in Bioreactors

Bioreactors are used to grow organisms in large volumes. This makes it possible to produce large amounts of a target product. In laboratory and bioengineering settings, they provide a controlled place for cell growth and product formation. The two main reactor types are batch reactors and continuous reactors. A batch reactor contains all of the materials needed for cell growth at the start. A continuous reactor has inlet and outlet ports, so fresh growth media can be added while cell waste is...

overview of biosensing

How Biosensors Detect Molecules

Biosensors detect biological molecules and chemical contaminants by combining biology with physical measurement. They can identify targets such as proteins or cells, as well as non-biological molecules like chemicals or contaminants. This makes biosensing a useful field for studying and monitoring many kinds of samples. These devices rely on different signal types to find the target molecule. Some biosensors use electrical signals, while others depend on optical, electrochemical, or mechanical...

electrochemical biosensing

Glucose Sensors and Cancer Detection

Electrochemical biosensors detect target molecules by measuring an oxidation-reduction event. That signal changes when a molecule binds to the sensor surface. These sensors helped shape modern biosensing after the first glucose biosensor was invented. The glucose biosensor is a key example of this technology. It shows how electrochemical sensing can track a biological target through a measurable electrical change. The same basic idea also helps explain how electrochemical biosensors can be...

optical biosensing

Detecting Molecules with Light

Optical biosensors detect target molecules with light. They monitor binding by reading an optical signal from the sample. This makes them useful for seeing when a target molecule is present. Some optical biosensors use a label molecule. The label creates a measurable signal, such as fluorescence. Other optical biosensors are label-free and track changes in optical properties, such as refractive index, as binding occurs. This page introduces both label and label-free optical biosensors. It...

overview of tissue engineering

Building Artificial Tissue with Biomaterials

Tissue engineering uses biomaterials, specific cells, and growth factors to build artificial tissue. These engineered tissue constructs are designed for tissue repair and, in some cases, organ replacement. The field focuses on how to make tissue work like natural tissue. It begins with a scaffold, which is a structure that supports cell growth. Cells are then added to the scaffold, and growth factors help encourage proliferation, or cell multiplication. The video also outlines common methods...

histotypic tissue culture

Histotypic tissue culture uses an engineered three-dimensional matrix to grow and propagate cells. Compared with common two-dimensional tissue culture, cells in a 3D setting behave more realistically and better mimic native tissue. The method is useful when high cell density is needed. The process begins by harvesting cells from donor tissue. Those cells are then placed onto an engineered construct for culture. This setup supports growth in a three-dimensional space instead of a flat surface.

whole organ tissue culture

Lung Decellularization and Recellularization

Whole organs can be cultured ex vivo using specialized bioreactors to support repair or replacement of entire organs. In this approach, a donor organ is first stripped of all cells. What remains is the three-dimensional structure of the organ, which can then be repopulated with new cells. The lung is the example shown here. The method uses a dynamic culture system that provides mechanical stimulation, similar to what the organ experiences in the body. This type of culture helps induce native...

bioengineering

Esta coleção abrange os principais conceitos da bioengenharia, que incluem a produção de biomateriais, culturas histotípicas e de órgãos inteiros, técnicas de bioprocessamento e os complexos campos de nível de sistema de bioMEMs e biosensoriamento.

Explore histotypic tissue culture, where cells are harvested from donor tissue and grown on an engineered 3D matrix to better mimic native tissue.

3D Cell Growth on Engineered Matrices

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