Name: detecting molecules with light
Uploaded: 2023-04-30T06:32:51.000Z
Duration: 9 min 39 s
Channel: JoVE

<div class="chapter_text" id="script_0">Biosensores ópticos são sensores que detectam um alvo biológico ou alvos de interesse usando a luz. Esses dispositivos encontraram aplicações em saúde, produtos farmacêuticos, monitoramento ambiental, Segurança Interna e até mesmo no campo de batalha. Os biosensores ópticos são amplamente divididos em sensores baseados em rótulos e sem rótulos. Um exemplo de sensoriamento baseado em rótulos é a Polymerase Chain Reaction, ou PCR, que usa rótulos fluorescentes, ou fluoroforos, para quantificar o DNA alvo amplificado. Um exemplo de método livre de rótulos é Surface Plasmon Resonance, ou SPR. Aqui, a interação sem alterações biomoléculas com a superfície do sensor é quantificada medindo uma característica fundamental do sensor, como o ângulo de reflexão. Este vídeo revisa o básico desses tipos de técnicas de biosensagem óptica e seus componentes críticos, os princípios de trabalho e aplicações comuns de biosensores ópticos.</div><div class="chapter_text" id="script_1">Primeiro, vejamos os princípios gerais da biosensação óptica baseada em rótulos. Normalmente, uma sonda ou elemento de biorecognição, como um anticorpo complementar, é anexado na superfície do sensor usando a química tradicional de imobilização. A solução amostral é então fluída sobre a superfície dos sensores. A molécula alvo, que é complementar ao elemento biorecognição imobilizado, é capturada seletivamente a partir da complexa solução amostral. Em seguida, a solução de amostra em excesso é lavada com tampão ou água. Em seguida, para ajudar a visualizar e quantificar a quantidade de alvo vinculado, uma molécula secundária que é complementar ao alvo e anexada a um fluoróvo, é fluída através do sistema. Depois de algum tempo, quando a ligação da molécula secundária ao alvo ocorreu, o excesso de fluoróforo desvinculado é lavado. A intensidade do fluoróforo ligado pode então ser quantificada usando um microscópio fluorescente. Esta intensidade é primeiramente traçada para várias concentrações de alvo conhecidas para criar uma curva de calibração, que permite então a medida direta de uma quantidade desconhecida de alvo capturado. Assim, as técnicas baseadas em rótulos utilizam a intensidade de fluorescência de fluoroforos extremamente sensíveis para quantificar a concentração da biomolécula de interesse.</div><div class="chapter_text" id="script_2">Agora que revisamos os princípios dos biosensores ópticos baseados em rótulos, vamos dar uma olhada em um exemplo comumente usado, o padrão atual para amplificação de DNA, PCR Quantitativo ou qPCR. A mistura de reação qPCR inclui uma sonda rotulada para quantificação de reação em tempo real. A sequência da sonda é anexada a moléculas fluorescentes e quencher, e se liga a uma sequência de DNA específica. A molécula saciador sacia a emissão do fluoróforo enquanto ambas estão ligadas à sonda. Durante a reação do PCR, a enzima polimerase degrada o DNA da sonda e separa fisicamente o repórter fluoróforo, impedindo assim a sacieçação e resultando em um aumento da fluorescência. Para executar qPCR, primeiro adicione todos os componentes da reação, incluindo os sondas rotuladas, em um tubo PCR ou bem. Em seguida, coloque os poços pcr em um termociclador especializado e insira os parâmetros para cada ciclo e o número de ciclos. O termociclador usado para qPCR inclui uma fonte de luz com os componentes ópticos necessários para selecionar um comprimento de onda e um detector para medir a intensidade da fluorescência em tempo real durante a reação do PCR. No final de cada ciclo térmico, a intensidade fluorescente devido aos Fluoroforos liberados é registrada e plotada. A intensidade fluorescente é diretamente proporcional ao logaritmo da concentração alvo na reação bem, e assim, para uma fluorescência conhecida, a concentração de alvo desconhecida pode ser calculada.</div><div class="chapter_text" id="script_3">Vejamos agora como a detecção pode ser alcançada sem repórteres, como fluoroforos, usando técnicas de sensoriamento óptico sem rótulos. Para técnicas sem rótulos, a imobilização do elemento biorecognição é a mesma da técnica baseada em rótulos. Qualquer acessório biomolécula à superfície desses sensores modifica o índice de refração nas proximidades do dispositivo óptico. As moléculas alvo se ligam à superfície do dispositivo óptico funcionalizado formando uma camada fina e modificando ainda mais o índice de refração. Essas alterações no índice de refração podem ser monitoradas rastreando a mudança na frequência natural de vibração, ou na frequência ressonante do sistema. A diferença nas frequências ressonantes antes e depois da ligação do alvo, chamada f shift, é diretamente proporcional à concentração do alvo capturado.</div><div class="chapter_text" id="script_4">Agora vamos dar uma olhada nos princípios básicos de uma técnica de sensoriamento óptico comumente usada sem rótulos, Surface Plasmon Resonance ou SPR. Um instrumento SPR típico combina uma fonte laser movevel, um detector óptico para medir a mudança de intensidade, e um chip de sensor com um prisma de vidro revestido de um lado com ouro. O prisma coberto de ouro é integrado a um sistema fluido que permite uma operação de fluxo. Em um experimento, a molécula da sonda, ou elemento de biorecognição, é anexada à superfície dourada. O elemento alvo então flui sobre a superfície e se liga à sonda imobilizada. O sensor de sensibilidade utiliza o fenômeno SPR. Isso ocorre quando a luz polarizada é mostrada na superfície do metal, como o ouro, em um ângulo específico, theta SPR. Isso resulta na geração de plasmons superficiais que são oscilações eletrônicas coerentes que existem na interface de dois materiais que têm permitidaidades de sinais opostos. Quando a massa ligada à superfície do sensor muda, a condição de ressonância dos plasmons de superfície é alterada. Consequentemente, quando apenas o elemento de biorecognição está ligado na superfície, o feixe é refletido em um ângulo, ota um. Em seguida, quando mais massa é anexada à superfície, como o alvo capturado, uma redução da intensidade da luz refletida no ângulo específico, theta SPR é observado, à medida que o ângulo de reflexão muda para dois. A mudança de intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância, theta SPR, é então uma função do ângulo da luz refletida, e pode ser medida como a diferença nos ângulos, um e dois.</div><div class="chapter_text" id="script_5">Agora que cobrimos os princípios e procedimentos por trás dos biosensores ópticos, vamos ver como os pesquisadores estão aplicando essas técnicas hoje. O citómetro de célula de fluxo é um sistema óptico de biossensagem que é comumente usado para contar células e medir uma variedade de outras propriedades e componentes celulares. Uma amostra composta por vários tipos de células, cada uma marcada com um fluoróforo único, é preparada em uma suspensão. Em seguida, a amostra é executada através do citómetro de fluxo de tal forma que as células passam por um raio laser um de cada vez. À medida que cada célula passa pelo raio laser, a luz fluorescente dispersa e emitida pelos diferentes fluoroforos são separadamente quantificadas, o que dá uma contagem direta dos vários tipos de células da amostra. Outra aplicação de biosensores ópticos é a detecção de bactérias em amostras. Uma maneira de fazer isso é usando sensores ópticos de ressonador de anel. Eles são compostos de um loop fechado acoplado a guias de entrada de luz e ondas de saída. Quando a luz do comprimento de onda ressonante é aplicada ao guia de onda de entrada, ela é passada através do loop e constrói uma intensidade sobre várias viagens de ida e volta devido a interferências construtivas e é saída para o guia de onda de saída. Anticorpos específicos para proteínas da superfície bacteriana são imobilizados na superfície do ressonador do anel e um espectro de absorção de linha de base é obtido. Em seguida, a amostra bacteriana é fluída para a superfície do ressonador para permitir a ligação bacteriana ao corpo imobilizado, após o qual um segundo espectro de absorção é obtido. Se a bactéria de interesse se ligar, observa-se uma mudança visível nos picos ressonantes, o que é diretamente proporcional à concentração das bactérias-alvo.</div><div class="chapter_text" id="script_6">Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre biosensagem óptica. Discutimos os princípios básicos tanto da sensoriamento óptico baseada em rótulos quanto sem rótulos, juntamente com dois exemplos proeminentes desses métodos e algumas aplicações das técnicas. Obrigado por assistir.</div>

biossensor óptico

Biosensores ópticos utilizam a luz para detectar a ligação de uma molécula alvo. Esses sensores podem utilizar uma molécula de rótulo, que produz um sinal mensurável como a fluorescência, ou esses sensores podem ser livres de rótulos e usar as alterações nas propriedades ópticas, como índice de refração, para sentir a ligação da molécula alvo. Este vídeo apresenta biosensores ópticos sem rótulos e sem rótulos, demonstra seu uso em laboratório e mostra algumas aplicações da tecnologia.

Biossensor óptico

Optical biosensors utilize light to detect the binding of a target molecule. These sensors can utilize a label molecule, which produces a measurable ...

Biossensores ópticos são sensores que detectam um alvo biológico ou alvos de interesse usando luz. Esses dispositivos encontraram aplicações na área da saúde, produtos farmacêuticos, monitoramento ambiental, Segurança Interna e até mesmo no campo de batalha. Os biossensores ópticos são amplamente divididos em sensores baseados em rótulos e sem rótulos. Um exemplo de detecção baseada em rótulos é a Reação em Cadeia da Polimerase, ou PCR, que usa marcadores fluorescentes, ou fluoróforos, para quantificar o DNA alvo amplificado. Um exemplo de método sem rótulo é a Ressonância Plasmônica de Superfície, ou SPR. Aqui, a interação inalterada das biomoléculas com a superfície do sensor é quantificada medindo uma característica fundamental do sensor, como o ângulo de reflexão. Este vídeo analisa os fundamentos de ambos os tipos de técnicas de biossensoriamento óptico e seus componentes críticos, os princípios de funcionamento e as aplicações comuns dos biossensores ópticos. Primeiro, vejamos os princípios gerais do biossensoriamento óptico baseado em rótulos. Normalmente, uma sonda ou elemento de biorreconhecimento, como um anticorpo complementar, é anexado à superfície do sensor usando a química de imobilização tradicional. A solução de amostra é então fluída sobre a superfície dos sensores. A molécula alvo, que é complementar ao elemento de bioreconhecimento imobilizado, é capturada seletivamente da solução de amostra complexa. Em seguida, o excesso de solução de amostra é lavado com tampão ou água. Em seguida, para ajudar a visualizar e quantificar a quantidade de alvo ligado, uma molécula secundária que é complementar ao alvo e ligada a um fluoróforo, flui através do sistema. Depois de algum tempo, quando ocorre a ligação da molécula secundária ao alvo, o excesso de fluoróforo não ligado é lavado. A intensidade do fluoróforo ligado pode então ser quantificada usando um microscópio fluorescente. Essa intensidade é primeiro plotada para várias concentrações de alvo conhecidas para criar uma curva de calibração, que permite a medição direta de uma quantidade desconhecida de alvo capturado. Assim, as técnicas baseadas em rótulos usam a intensidade de fluorescência de fluoróforos extremamente sensíveis para quantificar a concentração da biomolécula de interesse. Agora que revisamos os princípios dos biossensores ópticos baseados em rótulos, vamos dar uma olhada em um exemplo comumente usado, o padrão atual para amplificação de DNA, PCR quantitativo ou qPCR. A mistura de reação qPCR inclui uma sonda marcada para quantificação da reação em tempo real. A sequência da sonda é anexada às moléculas fluorescentes repórter e extintor e se liga a uma sequência específica de DNA. A molécula de supressor extingue a emissão do fluoróforo enquanto ambos estão conectados à sonda. Durante a reação de PCR, a enzima polimerase degrada o DNA da sonda e separa fisicamente o repórter do fluoróforo, evitando assim a extinção e resultando em um aumento na fluorescência. Para realizar qPCR, primeiro adicione todos os componentes da reação, incluindo as sondas marcadas, em um tubo ou poço de PCR. Em seguida, coloque os poços de PCR em um termociclador especializado e insira os parâmetros para cada ciclo e o número de ciclos. O termociclador usado para qPCR inclui uma fonte de luz com os componentes ópticos necessários para selecionar um comprimento de onda e um detector para medir a intensidade da fluorescência em tempo real durante a reação de PCR. No final de cada ciclo térmico, a intensidade fluorescente devido aos fluoróforos liberados é registrada e plotada. A intensidade fluorescente é diretamente proporcional ao logaritmo da concentração alvo no poço de reação e, portanto, para uma fluorescência conhecida, a concentração alvo desconhecida pode ser calculada. Vejamos agora como a detecção pode ser alcançada sem nenhum repórter, como fluoróforos, usando técnicas de detecção óptica sem rótulos. Para técnicas sem marcadores, a imobilização do elemento de biorreconhecimento é a mesma que a técnica baseada em marcadores. Qualquer ligação de biomolécula à superfície desses sensores modifica o índice de refração nas imediações do dispositivo óptico. As moléculas-alvo se ligam à superfície do dispositivo óptico funcionalizado, formando uma camada fina e modificando ainda mais o índice de refração. Essas mudanças no índice de refração podem ser monitoradas rastreando a mudança na frequência natural da vibração ou na frequência ressonante do sistema. A diferença nas frequências ressonantes antes e depois da ligação do alvo, chamada de deslocamento f, é diretamente proporcional à concentração do alvo capturado. Agora vamos dar uma olhada nos princípios básicos de uma técnica de detecção óptica sem rótulo comumente usada, Ressonância de Plasmon de Superfície, ou SPR. Um instrumento SPR típico combina uma fonte de laser móvel, um detector óptico para medir a mudança de intensidade e um chip sensor com um prisma de vidro revestido de ouro em um lado. O prisma revestido de ouro é integrado a um sistema fluídico que permite uma operação de escoamento. Em um experimento, a molécula da sonda, ou elemento de biorreconhecimento, é anexada à superfície do ouro. O elemento alvo então flui sobre a superfície e se liga à sonda imobilizada. A detecção utiliza o fenômeno SPR. Isso ocorre quando a luz polarizada é mostrada na superfície do metal, como o ouro, em um ângulo específico, theta SPR. Isso resulta na geração de plasmons de superfície que são oscilações eletrônicas coerentes que existem na interface de dois materiais que possuem permissividades de sinais opostos. Quando a massa ligada à superfície do sensor muda, a condição de ressonância dos plasmons de superfície é alterada. Consequentemente, quando apenas o elemento de biorreconhecimento está ligado à superfície, o feixe é refletido em um ângulo, teta um. Então, quando mais massa é anexada à superfície, como o alvo capturado, uma redução da intensidade da luz refletida no ângulo específico, theta SPR é observada, pois o ângulo de reflexão muda para theta dois. A mudança na intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância, teta SPR, é então uma função do ângulo da luz refletida e pode ser medida como a diferença nos ângulos, teta um e teta dois. Agora que abordamos os princípios e procedimentos por trás dos biossensores ópticos, vamos ver como os pesquisadores estão aplicando essas técnicas hoje. O citômetro de célula de fluxo é um sistema óptico de biossensoriamento comumente usado para contar células e medir uma variedade de outras propriedades e componentes celulares. Uma amostra composta por vários tipos de células, cada uma marcada com um fluoróforo exclusivo, é preparada em suspensão. Em seguida, a amostra é passada pelo citômetro de fluxo de modo que as células passem por um feixe de laser, uma de cada vez. À medida que cada célula passa pelo feixe de laser, a luz fluorescente espalhada e emitida pelos diferentes fluoróforos é quantificada separadamente, o que fornece uma contagem direta dos vários tipos de células na amostra. Outra aplicação dos biossensores ópticos é a detecção de bactérias em amostras. Uma maneira de fazer isso é usando sensores ressonadores de anel óptico. Eles são compostos por um circuito fechado acoplado a guias de onda de entrada e saída de luz. Quando a luz do comprimento de onda ressonante é aplicada ao guia de onda de entrada, ela é passada pelo loop e aumenta uma intensidade em várias viagens de ida e volta devido à interferência construtiva e é enviada para o guia de onda de saída. Anticorpos específicos para proteínas de superfície bacteriana são imobilizados na superfície do ressonador do anel e um espectro de absorção de linha de base é obtido. Em seguida, a amostra bacteriana é fluída para a superfície do ressonador para permitir a ligação bacteriana ao corpo imobilizado, após o que um segundo espectro de absorção é obtido. Se a bactéria de interesse se liga, observa-se uma mudança visível nos picos ressonantes, que é diretamente proporcional à concentração da bactéria-alvo. Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre biossensoriamento óptico. Discutimos os princípios básicos do sensoriamento óptico baseado em rótulos e sem rótulos, juntamente com dois exemplos proeminentes desses métodos e algumas aplicações das técnicas. Obrigado por assistir.

Education

JoVE Science Education

Engineering

Engenharia

Bioengineering

Bioengenharia

Optical Biosensing

detecting molecules with light

Optical biosensors detect target molecules with light. They monitor binding by reading an optical signal from the sample. This makes them useful for seeing when a target molecule is present.

Some optical biosensors use a label molecule. The label creates a measurable signal, such as fluorescence. Other optical biosensors are label-free and track changes in optical properties, such as refractive index, as binding occurs.

This page introduces both label and label-free optical biosensors. It also shows how they are used in the laboratory and highlights some applications of the technology.

Detecting Molecules with Light

overview of biomaterials

Biomaterials in Medicine and Engineering

Biomaterials are materials designed to interact well with biological organisms or molecules. They may come from an organism, be produced by an organism, or be made as a synthetic polymer. Because of these properties, engineers use biomaterials in medicine and other biological applications. These materials are used in tissue engineering, biosensing, and drug delivery. Tissue engineering uses materials to support the growth or repair of tissues. Biosensing uses materials to detect biological...

collagen hydrogels

Porcine Collagen for Tissue Engineering

Collagen is a useful biomaterial with uses that go beyond the lab. It has also found commercial use in photography. In tissue engineering, collagen can be turned into hydrogels that give engineered tissue support and structure. This page follows the path from porcine skin to a collagen hydrogel. Porcine skin is used as the source of collagen. The material is then prepared for use in tissue engineering applications. The video also shows several applications of collagen and the methods used to...

electrospinning of silk biomaterials

Silk Cocoon Processing for Fiber Mats

Silk cocoons can be processed into a soluble material that is useful for making biomaterials. Silk fibers have been used for fabrics and threads for centuries, but turning them into a versatile pre-polymer solution is a newer technique. That solution can then be shaped into materials with controllable mechanical properties. The process begins with silk worm cocoons. The silk is solubilized, or dissolved, so it can be handled as a liquid-like solution. The video then shows how that silk...

overview of biomem devices

BioMEMs in Diagnostics and Miniaturization

Bio-microelectromechanical systems, or BioMEMs, are microscale devices used in diagnostic settings. They work with very small sample and reagent volumes in vivo and in vitro, which means inside a living body or outside it in a lab. These compact systems support bioengineering research and help make diagnostic tools more efficient. BioMEMs can carry out functions such as filtration, sensing, and synthesis on a tiny scale. Using less material can lower costs and improve sensitivity. The...

microfabrication via photolithography

Photolithography for Silicon Wafer Patterning

Photolithography is a common microfabrication method used to pattern a silicon wafer. It uses light to transfer a design onto the wafer surface. This process helps form the basis for many BioMEM devices. The page also shows how photolithography is carried out in a cleanroom. Cleanroom steps are important because they support careful fabrication of small, detailed features. The video ends by introducing applications of this process in BioMEM device production.

soft lithography

Photolithography for Microfluidic Device Making

Photolithography and soft lithography are used to make BioMEM devices such as microfluidic channels. A microscale pattern is copied by curing an elastomeric polymer over a 3D structure. The result is a polymer piece that can serve as part of a biological device. These polymer structures are then used to build a range of tools. Some are microfluidic channels for biosensing applications. Others are microscale bioreactors that let scientists visualize micro-colonies. The process also shows how...

overview of bioprocess engineering

Bioreactors and Protein Production in Bioprocessing

Bioprocessing uses living organisms to make a desired target product. In many cases, that product is a protein made in a bioreactor, which is a controlled vessel for growing cells. This process often relies on genetically engineered organisms. Engineers design the system so the cells can produce proteins at large scale. That approach is central to making biotherapeutics, which are drugs made from biological materials. Biotherapeutics are important medicines for complex diseases such as...

synthetic biology

Engineering Cells to Produce Proteins

Synthetic biology is a bioengineering method for programming cells to make useful products. In many cases, the goal is to genetically modify an organism so it can produce large amounts of a protein. That protein may already be made by the cell, or it may come from a newly inserted DNA sequence. The process depends on changing an organism’s genetic material. This is done with transformation or transfection, two common ways to introduce DNA into cells. The video also shows how this work is...

batch and continuous bioreactors

Growing Cells in Bioreactors

Bioreactors are used to grow organisms in large volumes. This makes it possible to produce large amounts of a target product. In laboratory and bioengineering settings, they provide a controlled place for cell growth and product formation. The two main reactor types are batch reactors and continuous reactors. A batch reactor contains all of the materials needed for cell growth at the start. A continuous reactor has inlet and outlet ports, so fresh growth media can be added while cell waste is...

overview of biosensing

How Biosensors Detect Molecules

Biosensors detect biological molecules and chemical contaminants by combining biology with physical measurement. They can identify targets such as proteins or cells, as well as non-biological molecules like chemicals or contaminants. This makes biosensing a useful field for studying and monitoring many kinds of samples. These devices rely on different signal types to find the target molecule. Some biosensors use electrical signals, while others depend on optical, electrochemical, or mechanical...

electrochemical biosensing

Glucose Sensors and Cancer Detection

Electrochemical biosensors detect target molecules by measuring an oxidation-reduction event. That signal changes when a molecule binds to the sensor surface. These sensors helped shape modern biosensing after the first glucose biosensor was invented. The glucose biosensor is a key example of this technology. It shows how electrochemical sensing can track a biological target through a measurable electrical change. The same basic idea also helps explain how electrochemical biosensors can be...

optical biosensing

Optical biosensors detect target molecules with light. They monitor binding by reading an optical signal from the sample. This makes them useful for seeing when a target molecule is present. Some optical biosensors use a label molecule. The label creates a measurable signal, such as fluorescence. Other optical biosensors are label-free and track changes in optical properties, such as refractive index, as binding occurs. This page introduces both label and label-free optical biosensors. It...

overview of tissue engineering

Building Artificial Tissue with Biomaterials

Tissue engineering uses biomaterials, specific cells, and growth factors to build artificial tissue. These engineered tissue constructs are designed for tissue repair and, in some cases, organ replacement. The field focuses on how to make tissue work like natural tissue. It begins with a scaffold, which is a structure that supports cell growth. Cells are then added to the scaffold, and growth factors help encourage proliferation, or cell multiplication. The video also outlines common methods...

histotypic tissue culture

3D Cell Growth on Engineered Matrices

Histotypic tissue culture uses an engineered three-dimensional matrix to grow and propagate cells. Compared with common two-dimensional tissue culture, cells in a 3D setting behave more realistically and better mimic native tissue. The method is useful when high cell density is needed. The process begins by harvesting cells from donor tissue. Those cells are then placed onto an engineered construct for culture. This setup supports growth in a three-dimensional space instead of a flat surface.

whole organ tissue culture

Lung Decellularization and Recellularization

Whole organs can be cultured ex vivo using specialized bioreactors to support repair or replacement of entire organs. In this approach, a donor organ is first stripped of all cells. What remains is the three-dimensional structure of the organ, which can then be repopulated with new cells. The lung is the example shown here. The method uses a dynamic culture system that provides mechanical stimulation, similar to what the organ experiences in the body. This type of culture helps induce native...

bioengineering

Esta coleção abrange os principais conceitos da bioengenharia, que incluem a produção de biomateriais, culturas histotípicas e de órgãos inteiros, técnicas de bioprocessamento e os complexos campos de nível de sistema de bioMEMs e biosensoriamento.

Learn how optical biosensors use light to detect target molecules. Compare label and label-free methods, lab use, and key applications.

Detecting Molecules with Light

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