No início do século 20, um bacteriologista britânico chamado Frederick Griffith estava trabalhando com a bactéria causadora de pneumonia Streptococcus pneumoniae. Ele realizou um experimento simples usando duas cepas diferentes. Uma cepa é conhecida como cepa S por causa de uma cápsula protetora que faz com que as colônias ou aglomerados que ela forma pareçam lisas e também a torna virulenta ou prejudicial. A segunda foi a cepa R, uma versão da bactéria sem a cápsula protetora, dando às colônias uma aparência áspera e tornando-a não virulenta.
Primeiro, Griffith pegou algumas das bactérias da cepa S e as aqueceu, produzindo uma versão morta pelo calor da cepa S. Em seguida, ele reuniu alguns ratos e os dividiu em quatro grupos. Ele injetou no primeiro grupo a cepa S virulenta e o segundo com a cepa R não virulenta. Ele dosou o terceiro grupo com a cepa S morta pelo calor e, finalmente, combinou a cepa S morta pelo calor e a cepa R juntas, e injetou essa mistura no quarto grupo. Como esperado, os camundongos do primeiro grupo morreram e os do segundo e terceiro grupo sobreviveram. Mas, para surpresa de Griffith, os ratos do último grupo também morreram.
IMPORTANTE: Além de usar o equipamento de proteção individual adequado, certifique-se de manter o rosto longe de culturas de suspensão e evitar a inalação de reagentes. Não toque no rosto durante a realização do experimento. Sempre lave as mãos antes e depois de cada experimento.
Quando estiver pronto para começar com segurança, verifique se você tem um tubo ou tubos de células E. coli competentes em seu balde de gelo.
Em seguida, transfira 50 μL de um desses tubos para cada um dos dois novos tubos de microcentrífuga, um rotulado como '–' e outro rotulado como '+'.
Em seguida, pipete 2 μL de plasmídeo p-GREEN no tubo positivo e agite o tubo suavemente para incorporar o plasmídeo em toda a solução bacteriana. HIPÓTESES: A hipótese experimental é que em placas que não contêm antibiótico, bactérias com ou sem o plasmídeo podem sobreviver e, portanto, ambas crescerão gramados de bactérias. Por outro lado, nas placas que contêm o antibiótico ampicilina, apenas as bactérias transformadas com sucesso com o plasmídeo de resistência crescerão, enquanto as placas de plasmídeo negativo não conterão bactérias. A hipótese nula deste experimento é que não haverá diferença no crescimento bacteriano entre as placas.
Incube os dois tubos no gelo.
Após 30 minutos, mergulhe os dois tubos 3/4 do caminho na água de um banho-maria a 42 °C por 30 segundos.
No final da incubação do banho-maria, coloque os tubos de volta no gelo por 5 minutos e, em seguida, adicione 950 μL de meio SOC em temperatura ambiente a cada tubo.
Incube os tubos em um agitador a 37 °C por 60 minutos a 250 rpm.
Enquanto os tubos estão incubando, rotule o fundo de uma placa LB e uma LB/ampicilina, ou AMP, "+ plasmídeo", e o fundo de uma placa LB e uma placa LB/AMP "- plasmídeo".
No final da incubação, pipete 50 μL do tubo celular "+ plasmídeo" para a placa LB/AMP plus e a placa LB plus.
Em seguida, com uma nova ponta, adicione 50 μL das bactérias que não foram expostas ao plasmídeo a cada uma das placas negativas.
Em seguida, espalhe cada placa usando uma nova ponta de pipeta.
Cubra as placas com suas tampas e feche-as com filme de laboratório.
Em seguida, armazene as placas de cabeça para baixo em uma incubadora a 37 °C por 24 horas.
Resultados
No dia seguinte à transformação, observe quais placas têm bactérias e como as bactérias estão distribuídas em cada placa.
Para determinar a massa inicial, IM, do plasmídeo, primeiro multiplique a concentração de plasmídeo do tubo de estoque de p-GREEN pelo volume transferido para o tubo experimental.
Para calcular quanto DNA é espalhado em cada placa, divida o volume de suspensão bacteriana espalhada em cada placa pelo volume da suspensão no tubo e multiplique essa fração pela massa inicial de plasmídeo usado.
Para determinar a eficiência da transformação, conte todas as colônias visivelmente distintas na placa LB/AMP do plasmídeo positivo e divida esse número pela massa de propagação do plasmídeo. NOTA: A unidade de eficiência de transformação é ufc/μg de DNA de plasmídeo.
Registre todos os resultados de cada placa na tabela e analise-os.
Observe quaisquer diferenças entre as colônias e faça hipóteses para explicar essa observação. Considere os fatores que podem afetar a eficiência de transformação de bactérias competentes.
NOTA: Você também deve ter notado que cada placa teve um resultado diferente. As placas LB de plasmídeo negativo e plasmídeo positivo devem ter crescido muitas bactérias em suas placas. A placa de plasmídeo negativo LB / AMP não deve ter crescimento bacteriano. E a placa LB / AMP do plasmídeo positivo deveria ter crescido colônias bacterianas que fluoresciam em verde.
