Atividade enzimática
- Experimento da enzima peroxidase de linha de base
- Para começar, a linha de base para a reação enzimática da peroxidase deve ser determinada. Faça o substrato adicionando 7 mL de água destilada a um tubo de ensaio limpo e, em seguida, adicione 0,2 mL de guaiacol. Nota: Guaiacol é um indicador de mudança de cor que se torna mais amarelo-laranja à medida que a reação enzimática progride.
- Em seguida, adicione 0,3 mL de 0,1% de H2O2.
- Usando um marcador, rotule o substrato do tubo de ensaio e cubra o tubo com um pedaço de filme de vedação.
- Segurando a tampa no lugar, inverta o tubo quatro vezes para misturar o conteúdo do tubo.
- Em um segundo tubo de ensaio, adicione 6,0 mL de água destilada e 1,5 mL de peroxidase de nabo e rotule este tubo como "Enzimática".
- Cubra este tubo com um novo pedaço de filme de vedação e misture essas soluções por quatro inversões, conforme descrito anteriormente (etapa 4).
- Quando ambos os tubos estiverem misturados, coloque um temporizador na bancada, ao lado do suporte do tubo de ensaio, e despeje o conteúdo do tubo de substrato no tubo enzimático, tomando cuidado para não derramar nenhum líquido.
- Em seguida, despeje todo o volume do tubo enzimático de volta no tubo do substrato para misturar completamente as soluções e cobrir o tubo do substrato com outro pedaço de filme de vedação.
- Coloque o tubo de ensaio no rack e inicie o cronômetro.
- Observe a cor no tubo do substrato em 0, 1, 2, 3, 4 e 5 minutos, após a mistura.
- Para quantificar a mudança relativa na cor e a taxa da reação, combine a cor observada com a cor mais próxima no padrão. NOTA: Tirar uma foto da intensidade da cor observada em cada ponto de amostra pode facilitar o registro dos resultados.
- Registre as cores que você vê na tabela. Clique aqui para baixar a Tabela 1
- Investigando o efeito do pH na atividade da peroxidase
- HIPÓTESES: Neste exercício, a hipótese experimental é que a taxa de reação atingirá um máximo ou ótimo em um pH neutro de faixa média e que essas taxas serão maiores ou aproximadamente iguais à taxa de linha de base. A hipótese nula é que não haverá diferenças nas taxas de reação entre os tratamentos basal e pH.
- Primeiro, rotule seis tubos de ensaio limpos para cada um dos seis níveis de tampão de pH 3 a 8 e a palavra "Enzima".
- Em seguida, adicione 6 mL das soluções tampão de pH correspondentes fornecidas pelo seu instrutor a cada um dos tubos de ensaio.
- Em seguida, adicione 1,5 mL da peroxidase de nabo a cada tubo, tomando cuidado para não contaminar o conta-gotas com a solução tampão.
- Cubra os tubos enzimáticos com filme de vedação e inverta suavemente cada tubo para misturar o conteúdo do tubo.
- Conforme descrito no experimento de reação de linha de base, faça os substratos para essas reações adicionando 7 mL de água destilada, 0,2 mL de guaiacol e 0,3 mL de 0,1% H2O2 a seis novos tubos de ensaio limpos.
- Em seguida, rotule seis tubos de ensaio limpos adicionais com os níveis de pH 3 a 8 e a palavra "Solução" e prepare um cronômetro.
- Trabalhando rapidamente, despeje um tubo de substrato e um tubo de pH no tubo de solução correspondente. Repita esta etapa para cada um dos diferentes níveis de pH.
- Em seguida, cubra os tubos com filme de vedação e misture cada tubo com quatro inversões. Coloque cada tubo em um rack de tubos, à medida que são misturados.
- Observe a cor em cada tubo no tempo 0 e inicie imediatamente o cronômetro. Continue a observar a cor em cada tubo a cada intervalo de minutos, até 5 minutos.
- Em cada intervalo, use o código de cores no padrão para registrar as cores observadas em sua tabela.
- Investigando o efeito da temperatura na atividade da peroxidase
- HIPÓTESES: Neste exercício, a hipótese experimental é que a taxa de reação atingirá um ótimo acima da temperatura ambiente, ou 23 °C, mas abaixo da taxa de desnaturação enzimática e que esse máximo será maior que a taxa basal. A hipótese nula é que não haverá diferenças nas taxas de reação entre os tratamentos basais e de temperatura.
- Encha um copo de 800 mL até a metade do topo com gelo e despeje água fria no copo para criar um banho de gelo. Rotule este copo como "Gelo".
- Em seguida, rotule quatro novos béqueres de 600 mL com as mesmas temperaturas dos tubos de substrato e adicione 150 mL de água da torneira a cada um.
- Usando uma placa quente e um termômetro, leve os béqueres a 25, 35, 45 e 60 °C, conforme seus rótulos.
- Prepare mais cinco pares de substrato e tubos enzimáticos, conforme descrito para a reação inicial, usando água destilada no tubo enzimático, em vez de um tampão de pH.
- Rotule os tubos de substrato como "Gelo", "25 °C", "35 °C", "45 °C" e "60 °C".
- Quando todos os banhos-maria atingirem suas temperaturas apropriadas, misture o substrato e as soluções enzimáticas despejando primeiro o conteúdo de cada tubo de substrato em um tubo enzimático e, em seguida, despejando o conteúdo do tubo enzimático de volta no tubo de substrato.
- Cubra os tubos do substrato com filme de vedação e observe as cores no tempo 0.
- Em seguida, coloque os tubos em seus banhos de béquer correspondentes, com base no rótulo de temperatura que cada tubo recebeu e inicie um cronômetro.
- Para cada intervalo de 1 minuto, remova os tubos da água e registre sua cor, usando o stabdard como referência.
- Em seguida, coloque-os em seus banhos até que cada ponto de tempo, até 5 minutos, tenha sido registrado.
- Resultados
- Para determinar a linha de base da reação, represente graficamente a mudança na intensidade da cor em relação ao tempo. NOTA: O número de unidades em que a cor aumentou durante o período de 5 minutos servirá como a taxa de reação de linha de base para comparação relativa.
- Agora represente graficamente a diferença na intensidade da cor em relação aos níveis de pH usados no primeiro experimento.
- Adicione a linha de base para comparação e, em seguida, determine se a taxa de reação ideal foi maior, menor ou igual à linha de base.
- Usando este gráfico, determine o pH ideal para a reação. Nota: A reação pode não ocorrer em todos os pH. O pH ideal para a enzima peroxidase é normalmente na faixa de 6 a 7. Ao expor a enzima a um substrato com diferentes níveis de pH, você notará uma queda na taxa de reação à medida que o pH da enzima se torna mais básico, tornando a enzima mais instável.
- Por fim, represente graficamente a diferença na intensidade da cor ao longo do tempo para as diferentes temperaturas usadas no segundo experimento, usando a mesma linha de base para comparação.
- Usando este gráfico, determine a temperatura ideal para a reação e compare-a com a linha de base. NOTA: A reação pode não ocorrer em todas as temperaturas. Neste experimento, a reação parece mais eficiente em torno de 45 ° C e, acima disso, a enzima peroxidase começa a desnaturar. Por esta razão, não deve produzir uma mudança de cor no copo de 60 °C. A taxa de reação também diminuirá ou parará no banho de gelo, pois não há energia suficiente para a enzima catalisar a reação.