Buffers

Fonte: Smaa Koraym na Universidade Johns Hopkins, MD, EUA

1. Preparação de SoluçõesExpandir

   Aqui, mostramos a preparação laboratorial para 10 alunos trabalhando em duplas, com algum excesso. Por favor, ajuste as quantidades conforme necessário.

   • Para se preparar para este experimento de laboratório, use o equipamento de proteção individual apropriado, incluindo jaleco, óculos de proteção contra respingos químicos e luvas. Todas as soluções para este laboratório devem ser preparadas em uma capela química.
   • Prepare 100 mL de uma solução de NaOH 1 M. nota: O NaOH é fortemente corrosivo, portanto, tenha cuidado ao manuseá-lo.
   • Meça 4 g de NaOH sólido e despeje em um Erlenmeyer de 125 mL. Em seguida, adicione 50 mL de água deionizada ao balão. Mexa a mistura em uma placa de agitação para dissolver o NaOH.
   • Rotule um frasco de polietileno de 100 mL como '1 M NaOH'. Assim que o NaOH se dissolver e a solução parecer homogênea, adicione mais 50 mL de água deionizada. Em seguida, recupere a barra de agitação e transfira a solução para o frasco rotulado. Coloque a garrafa tampada na parte de trás do capuz do instrutor.
   • Prepare 10 mL de uma solução de 0,56 mM de vermelho neutro em água deionizada. Meça 1,6172 mg de vermelho neutro em um balão volumétrico de 10 mL.
   • Use uma pipeta para encher o frasco cerca de 2/3 com água deionizada. Cobrir o balão com uma película de parafina de plástico e agitar a mistura até que o vermelho neutro se dissolva. Em seguida, retire a película e encha o balão até à linha marcada. Colocar uma barra de micro-agitação no balão e agitar a solução até ficar homogénea.
   • Rotule um frasco para injetáveis de 20 ml como «vermelho neutro 0,56 mM» e transfira a solução para o frasco para injetáveis. Tampe o frasco e guarde-o na geladeira.
   • Prepare 10 mL de uma solução de 0,66 mM de proteína de ligação à riboflavina da mesma maneira, começando pesando 198 mg da proteína. Transfira a solução para um frasco para injetáveis de 20 ml rotulado e guarde a solução no frigorífico.
   • Prepare ou obtenha um conjunto de buffers. Aqui, passaremos pela preparação de 100 mL de tampão fosfato monossódico pH 6,5 50 mM, ajustado com NaOH 1 M como exemplo.
   • Meça 0,5995 g de fosfato monossódico anidro em um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 80 mL de água deionizada ao frasco e comece a mexer a mistura.
   • Enquanto a mistura se mexe, ligue e calibre um medidor de pH digital.
   • Assim que o sal se dissolver e a solução parecer homogênea, clamp o sensor de pH no tampão e aguarde a estabilização da leitura.
   • Confirme se a solução de NaOH 1 M esfriou até a temperatura ambiente. Em seguida, adicione lentamente NaOH à solução tampão de agitação com pausas para permitir que o pH se estabilize até que o tampão atinja pH 6,5. Isso pode levar apenas 1 ou 2 mL de NaOH. Em seguida, desligue o motor de agitação, enxágue a sonda de pH e recupere a barra de agitação.
   • Despeje o tampão ajustado de pH em um balão volumétrico limpo de 100 mL e leve a solução até a marca de 100 mL com água deionizada. Fechar o balão com uma película de parafina de plástico e invertê-lo até que a solução pareça homogénea.
   • Rotule um frasco de polietileno limpo de 125 mL como 'tampão fosfato monossódico de 50 mM pH 6.5'. Transfira a solução para o frasco e tampe-o. Guarde o buffer no capô do instrutor.
   • Prepare tampões adicionais de maneira semelhante, usando 1 M NaOH ou 2 M HCl, conforme apropriado, para ajustar o pH. Altere as concentrações de tampão conforme necessário para obter aproximadamente a mesma força iônica.
   • Quando terminar, armazene o NaOH 1 M em um armário corrosivo, limpe a vidraria e o equipamento usando seus procedimentos padrão e jogue fora os itens descartáveis no lixo do laboratório.
2. Preparação do LaboratórioExpand
   • Traga um recipiente de fosfato monossódico anidro para a área da balança analítica e confirme se há suprimentos suficientes de papel de pesagem, lenços umedecidos de laboratório e espátulas limpas.
   • Defina os seguintes equipamentos de laboratório e vidraria em cada estação de laboratório (sugerimos que os alunos trabalhem em pares):

     1 Prato de agitação

     1 suporte de laboratório com braçadeira de termômetro

     1 medidor de pH

     1 Espectrofotômetro portátil

     2 buffers de calibração

     2 copos de 400 mL

     2 copos de 100 mL

     1 copo de 25 mL

     1 cilindro graduado de 50 mL

     2 cilindros graduados de 10 mL

     1 vidro de relógio pequeno

     1 Barra de agitação magnética

     1 funil

     1 fórceps

     1 frasco de lavagem de plástico

     1 frasco de polietileno com tampa de 250 ou 500 mL

     1 Rolo de fita de laboratório

     2 pipetas de plástico

     1 Caneta de rotulagem

     1 caixa de lenços umedecidos de laboratório

     1 micropipeta de 1 mL com pontas

     1 micropipeta de 200 μL com pontas

     10 cubetas de 1,5 mL com tampas

   • Coloque pipetas de plástico descartáveis adicionais para que todos tenham fácil acesso a elas.
   • Coloque os frascos ou frascos rotulados contendo os tampões em uma área central.
   • Rotule uma micropipeta de 1 mL para cada tampão e coloque as micropipetas com os tampões correspondentes junto com uma caixa de ponteiras de pipeta.
   • Distribua as soluções neutras de vermelho e proteína. Rotule três tubos de ensaio de 5 mL como 'vermelho neutro' e três tubos de ensaio de 5 mL como 'proteína de ligação à riboflavina'. Em seguida, retire os frascos de solução vermelha neutra e proteína de ligação à riboflavina da geladeira e coloque cerca de 2 mL da solução vermelha neutra e 2 mL de solução de proteína de ligação à riboflavina nos tubos de ensaio devidamente marcados.
   • Defina as soluções neutras de vermelho e proteína para que os grupos de alunos possam compartilhar os tubos de ensaio.