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Fonte: Smaa Koraym na Universidade Johns Hopkins, MD, EUA
Na primeira parte deste experimento, você preparará uma solução de fosfato de sódio tamponada em pH 7,0. O fosfato monossódico é um ácido fraco com a base conjugada, fosfato dissódico. As soluções de fosfato monossódico não ajustadas geralmente têm um pH de cerca de 4 a 6.
Os tampões são mais eficazes perto de seu pKa, que é de 6,8 a 7,2 para fosfato monossódico. Portanto, você usará NaOH para empurrar o equilíbrio em direção à base conjugada sem alterar a composição geral do equilíbrio do tampão.
| Massa molar de NaH2PO4 = 119,98 g/mol | |
| Volume da solução (mL) | 200 |
| Molaridade (mM) | 50 |
| Mols de NaH2PO4 (mol) | |
| Massa necessária (mg) | |
| Volume inicial de 1 M NaOH (mL) | |
| Volume final de NaOH 1 M (mL) | |
| Volume de NaOH utilizado (mL) | |
| Volume de água DI necessário (mL) | |
Os tampões podem ser usados para avaliar compostos em valores específicos de pH. Nesta seção, você registrará o espectro de absorbância do indicador vermelho neutro em vários buffers. A forma protonada do vermelho neutro é vermelha, e a forma desprotonada é amarelo-laranja, o que significa que eles absorvem luz verde e azul-violeta, respectivamente. Assim, as formas ácida e básica têm comprimentos de onda de absorção distintos. A ligação às proteínas altera as propriedades do vermelho neutro, alterando tanto sua absorbância quanto seu pKa.
Depois de medir o espectro de absorbância do vermelho neutro livre em vários valores de pH, você adicionará a proteína de ligação à riboflavina, ou RP, às soluções e medirá as absorbâncias novamente. A intensidade da absorbância está relacionada à concentração, então você usará os espectros para determinar o pKa do vermelho neutro livre e ligado após o laboratório.
| Cuvette # | Buffer pH | Abs. em λmax (NRH+ livre) | Abs. em λmax (NRH vinculado) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | blank |
Agora, vamos analisar nossos dados de absorbância para determinar os pKa do vermelho neutro.
| NRH+ grátis | Encadernado NRH+ | |
| λmax (nm) | ||
| ΔA (nm) | ||
| Ponto médio (nm) | ||
| pKa |
Clique aqui para baixar a Tabela 3
Na primeira parte deste experimento, você preparará uma solução de fosfato de sódio tamponada em pH 7,0. O fosfato monossódico é um ácido fraco com a base conjugada fosfato dissódico. As soluções de fosfato monossódico não ajustadas geralmente têm um pH de cerca de 4 a 6.
Os tampões são mais eficazes perto de seu pKa, que é de 6,8 a 7,2 para fosfato monossódico. Portanto, você usará hidróxido de sódio para empurrar o equilíbrio em direção à base conjugada sem alterar a composição geral do equilíbrio do tampão. Antes de iniciar o laboratório, calcule a massa de fosfato monossódico necessária para fazer 200 mililitros de uma solução de 50 milimolares.
Esta seção do laboratório usa hidróxido de sódio, que é corrosivo e tóxico. Tenha cuidado ao despejar e transportar hidróxido de sódio. Agora, vamos começar.
Primeiro, coloque um jaleco, óculos de segurança resistentes a respingos e luvas de nitrilo. Em seguida, encha uma garrafa de lavagem plástica de 250 mililitros com água deionizada. Rotule dois copos de 100 mililitros para resíduos aquosos neutros e básicos, respectivamente.
Em seguida, calibre seu medidor de pH usando os tampões fornecidos. Armazene a sonda em sua solução de armazenamento quando terminar. Agora, traga um copo de 400 mililitros para a área da balança analítica para obter o fosfato monossódico de que você precisa.
Tara um pedaço de papel de pesagem e use uma espátula limpa para medir a quantidade necessária de fosfato monossódico de acordo com seus cálculos. O fosfato monossódico absorve a umidade do ar, portanto, trabalhe rapidamente para obter uma medição precisa e feche bem o recipiente quando terminar. Registre a quantidade exata de fosfato monossódico que você mede em seu caderno de laboratório.
Em seguida, coloque o fosfato monossódico no béquer e limpe a espátula com um lenço umedecido. Jogue fora o papel de pesagem e o lenço de laboratório antes de retornar à sua hotte. Agora, use um cilindro graduado para medir 175 mililitros de água deionizada.
Despeje a água no copo de fosfato monossódico e adicione uma barra de agitação magnética. Mexa a solução em uma placa de agitação até que o sal se dissolva completamente e a solução pareça homogênea. Isso geralmente leva de dois a três minutos.
Em seguida, meça 15 mililitros de água deionizada com um cilindro graduado. Despeje a água deionizada no béquer e continue mexendo a solução até que pareça homogênea novamente, o que geralmente leva de um a dois minutos. Em seguida, desligue o motor de agitação.
Enxágue a sonda de pH com água deionizada e, em seguida, prenda-a na solução com o sensor acima da barra de agitação. Agora, traga um cilindro graduado de 10 mililitros e um vidro de relógio para o exaustor e meça 10 mililitros de hidróxido de sódio 1 molar. Cubra o hidróxido de sódio com o vidro do relógio e leve-o cuidadosamente para a capela.
Observe o volume exato no cilindro graduado. Em seguida, volte a mexer a solução de fosfato monossódico. Enquanto monitora a leitura do pH, use uma pipeta descartável para adicionar lentamente hidróxido de sódio à solução agitadora de maneira gota.
Quando o pH do tampão atingir 7,0, retorne qualquer hidróxido de sódio ainda na pipeta para o cilindro graduado. Em seguida, calcule o volume de hidróxido de sódio que você adicionou a partir dos volumes inicial e final no cilindro graduado. Subtraia esse volume de 10 mililitros para determinar quanta água deionizada você deve adicionar ao seu tampão para atingir um volume total de solução de 200 mililitros.
Meça a água deionizada necessária com outro cilindro graduado de 10 mililitros e adicione-a à solução de agitação para terminar de fazer o tampão. Enxágue o sensor de pH com água deionizada, cubra-o com a tampa cheia de solução de armazenamento e desconecte ou desligue a sonda. Depois disso, rotule um frasco de polietileno de 250 mililitros como tampão fosfato monossódico de 50 milimolares, pH 7,0 'Use uma pinça para recuperar a barra de agitação magnética da solução.
Em seguida, coloque um funil na boca do frasco e despeje a solução tampão no frasco. Remova o funil e tampe bem a garrafa. Agora você está pronto para passar para a seção de espectroscopia de absorção.
Os tampões podem ser usados para avaliar compostos em valores específicos de pH. Nesta seção, você registrará o espectro de absorbância do indicador vermelho neutro em vários buffers. A forma protonada do vermelho neutro é vermelha, e a forma desprotonada é amarelo-laranja, o que significa que eles absorvem luz verde e azul-violeta, respectivamente.
Assim, as formas ácida e básica têm comprimentos de onda de absorção distintos. A ligação às proteínas altera as propriedades do vermelho neutro, alterando tanto sua absorbância quanto seu pKa. Depois de medir o espectro de absorbância do vermelho neutro livre em vários valores de pH, você adicionará a proteína de ligação à riboflavina, ou RP, às soluções e medirá as absorbâncias novamente.
A intensidade da absorbância está relacionada à concentração, então você usará os espectros para determinar o pKa do vermelho neutro livre e ligado após o laboratório. Antes de iniciar esta seção, desenhe uma tabela em seu caderno de laboratório, listando o número da cubeta, o pH do tampão, a absorbância em lambda max para vermelho neutro protonado livre e a absorbância em lambda max para vermelho neutro protonado ligado. Numere as cubetas de 1 a 10 e liste os nove valores de pH do tampão que você usará.
A 10ª cubeta será um branco de água deionizada. Sempre segure as cubetas pelos lados texturizados e limpe os lados transparentes antes de colocar a cubeta no espectrofotômetro. Lembre-se de alinhar os lados transparentes com o feixe de luz no espectrofotômetro.
Agora, vamos começar. Obtenha dez cubetas e tampas de 1,5 mililitro e rotule as tampas de 1 a 10 para combinar com a tabela em seu caderno de laboratório. Rotule um copo de 25 mililitros como DIH2O'e encha-o com água deionizada.
Em seguida, despeje o resíduo aquoso neutro no ralo e rotule novamente o béquer como resíduo tampão aquoso'Além disso, rotule um copo de 400 mililitros para pontas de micropipeta usadas. Em seguida, coloque uma ponta em uma micropipeta de 1 mililitro e use-a para dispensar 1000 microlitros de água deionizada na cubeta 10. Este será o seu solvente em branco.
Agora, ejete a ponteira, ajuste a micropipeta para dispensar 925 microlitros e coloque uma nova ponteira. Coloque 925 microlitros de seu tampão fosfato monossódico pH 7.0 na cubeta cinco. Ejete a ponta e tampe a cubeta.
Em seguida, traga as cubetas vazias restantes para a mesa de buffer. Guiado pela tabela em seu caderno de laboratório, dispense 925 microlitros de cada tampão na cubeta apropriada usando as micropipetas rotuladas. Tenha cuidado para não usar a mesma ponta de pipeta para tampões diferentes.
Depois de terminar, traga os buffers de volta para sua bancada. Lá, defina uma micropipeta de 200 microlitros para dispensar 75 microlitros e coloque uma ponta na micropipeta. Agora, obtenha um frasco ou tubo de solução vermelha neutra, que pode ser compartilhado com outro grupo de alunos.
Dispense 75 microlitros de vermelho neutro em cada uma das nove cubetas tampão. Substitua a ponta da pipeta se ela tocar em um tampão. Ejete a ponta da pipeta e tampe as cubetas quando terminar.
Agora, inverta cada cubeta várias vezes para misturar bem as soluções. Depois de misturar o vermelho neutro com cada tampão, tire uma foto ou anote as cores das soluções. Em seguida, ligue um espectrofotômetro portátil e espere a fonte de luz aquecer.
Quando estiver pronto, crie um novo experimento para medir a absorbância versus o comprimento de onda para o vermelho neutro livre. Em seguida, insira a cubeta de água deionizada. Adquira um espectro da água deionizada e coloque-o como um fundo solvente ou branco.
Em seguida, remova o branco do espectrofotômetro e insira a cubeta de vermelho neutro no tampão de pH mais baixo, que terá a maior concentração de vermelho neutro protonado. Adquira um espectro, que deve mostrar um pico forte. Identifique o comprimento de onda correspondente ao ponto mais alto desse pico, ou o máximo.
Registre esse comprimento de onda em seu caderno de laboratório como lambda max para vermelho neutro livre protonado. Salve os dados e remova a cubeta. Registe a absorbância no seu caderno e, em seguida, recolha os espectros das cubetas 2 a 9 utilizando o mesmo procedimento.
Os espectros devem cruzar em um único ponto, chamado de ponto isosbético. Registre o comprimento de onda deste ponto em seu caderno de laboratório. Se um espectro não cruzar nesse ponto, esvazie e limpe a cubeta, prepare uma nova amostra e tente novamente.
Depois de terminar de coletar espectros para todas as 9 cubetas, salve e exporte os dados. Em seguida, crie um novo experimento para medir a absorbância versus o comprimento de onda para o vermelho neutro ligado. Encaixe uma nova ponta na micropipeta de 200 microlitros e obtenha um recipiente compartilhado de proteína de ligação à riboflavina.
Adicione 75 microlitros de solução de proteína de ligação à riboflavina a cada cubeta, incluindo o branco. Ejete a ponta, prenda as tampas da cubeta e inverta a cubeta várias vezes para misturar as soluções. Agora, insira a cubeta 10 no espectrofotômetro e coloque-a como o solvente em branco.
Em seguida, adquira um espectro da amostra de pH mais baixo e identifique o comprimento de onda correspondente ao máximo do pico mais intenso. Grave-o em seu caderno de laboratório como o lambda max de vermelho neutro ligado a protonado. Depois disso, adquira espectros para cubetas 2 a 9 da mesma forma que você fez para as amostras vermelhas neutras grátis.
Registre as intensidades em lambda max para vermelho neutro ligado a protonação em sua tabela, juntamente com o comprimento de onda no ponto isosbético. Quando terminar, salve seus dados, exporte-os para análise posterior e desligue o espectrofotômetro. Guarde as micropipetas, as caixas de pontas, o medidor de pH e o espectrofotômetro.
Descarte as ponteiras de pipeta usadas em um recipiente de lixo ou lixeira aprovado. Agora, esvazie as cubetas no copo aquoso de resíduos de tampão e enxágue as cubetas no copo com água deionizada. Na sua hotte, esvazie o excesso de hidróxido de sódio no lixo básico e lave o cilindro graduado com água.
Lave os resíduos aquosos básicos no ralo com água da torneira em abundância, junto com os outros resíduos aquosos. Lave seus copos, tampas de cuvete e barra de agitação de acordo com os procedimentos padrão do seu laboratório. Por fim, limpe suas superfícies de trabalho com uma toalha de papel úmida e jogue fora as toalhas de papel usadas e os lenços umedecidos no lixo do laboratório.
Agora, vamos analisar nossos dados de absorbância para determinar os pKa do vermelho neutro. Primeiro, plote os dois conjuntos de dados de intensidade com a intensidade de absorbância em lambda max no eixo y e o pH no eixo x, com os pontos unidos por linhas suaves. Em seguida, para cada série de dados, calcular a diferença entre as intensidades de absorbância inicial e final.
Use isso para calcular a absorbância a meio caminho entre as absorbâncias inicial e final para cada série, ou os pontos médios de absorbância. Agora, descubra onde ocorre o ponto médio em cada linha e identifique o valor do pH nesse ponto. Esses valores de pH são os pKa do vermelho neutro livre e ligado.
Aqui, vemos um aumento no pKa de cerca de 1 entre o vermelho neutro livre e ligado, indicando que o vermelho neutro protonado ligado é um ácido mais fraco do que o vermelho neutro protonado livre em uma ordem de magnitude.
