Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Buffers

Conceitos Preparação do Instrutor Protocolo do Estudante

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Os tampões são soluções que trabalham para manter um pH constante em um sistema, independentemente da adição de ácidos ou bases fortes. Na ausência de tampões, a adição de um ácido forte ou de uma base a uma solução altera significativamente o pH. Os amortecedores são cruciais na vida cotidiana. Por exemplo, o sangue atua como um tampão e é capaz de manter um pH entre 7,35 e 7,45, pois um pH acima de 7,8 ou abaixo de 6,8 pode causar a morte.

Então, como funciona um buffer? Um tampão é essencialmente um ácido ou base fraca e sua base conjugada ou ácido em equilíbrio entre si. Tomemos, por exemplo, um tampão feito de ácido acético e acetato de sódio. A solução tampão contém um ácido fraco e seu sal conjugado, que se dissocia para formar o acetato de base conjugado. A solução é ácida porque o K_a do ácido acético é maior que o K_b da base conjugada.

Lembre-se de que a constante de dissociação, K_a ou K_b, define a força do ácido ou base, respectivamente, pois é a constante de equilíbrio para a dissociação do composto em água. A constante de dissociação também pode ser representada como pK_a, ou o log negativo de K_a, onde quanto menor o pK_a, mais forte é o ácido. O mesmo vale para pK_b, onde quanto menor o pK_b, mais forte é a base.

Voltando ao tampão acetato, se adicionarmos uma base forte, como hidróxido de sódio, os íons hidróxido reagem com os íons hidrônio presentes na solução. Isso faz com que mais ácido acético reaja com a água para retornar ao equilíbrio, formando assim mais íons hidrônio. Se adicionarmos um ácido forte, como o ácido clorídrico, mais íons hidrônio são formados em solução. Esses íons reagem com os íons acetato para formar mais ácido acético. Em ambos os casos, há muito pouca alteração no pH da solução.

Lembre-se de que cada tampão tem uma faixa de pH específica onde pode tamponar uma solução. Aqui mostramos uma curva de titulação para nosso tampão de ácido acético. O intervalo de buffer é realçado. Esta região é determinada pela equação de Henderson-Hasselbalch, que nos diz que o pH do tampão é determinado pelo K_a do ácido fraco e pela razão entre a base conjugada e o ácido fraco.

Longe desse pH, o ácido fraco ou a base do tampão se esgotam e não podem tamponar o pH. Portanto, ao selecionar um tampão para sua aplicação, escolha um cujo pK_a esteja próximo do pH desejado.

Finalmente, todos os tampões têm um limite para sua capacidade tampão, ou seja, a quantidade de ácido ou uma base que pode ser adicionada à solução tampão antes que o pH mude significativamente. Por exemplo, se adicionarmos muito ácido à nossa solução tampão de ácido acético e acetato de sódio, protonaremos todos os íons acetato e acumularemos muitos íons hidrônio, diminuindo assim o pH.

Da mesma forma, se adicionarmos muita base, desprotonaremos todo o ácido acético e acumularemos muitos íons hidróxido, aumentando assim o pH. Assim, a capacidade tampão é influenciada pela concentração do ácido fraco e do sal conjugado. Portanto, um tampão de acetato de 1 molar tem uma capacidade de tamponamento maior do que um tampão de acetato de 0,1 molar.

Neste laboratório, você preparará e examinará tampões com uma ampla variedade de faixas de pH. Em seguida, você usará seus tampões para determinar o pK_a de um indicador de pH, chamado vermelho neutro, e explorará a mudança no pK_a do vermelho neutro quando a proteína de ligação à riboflavina é introduzida.

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Fonte: Smaa Koraym na Universidade Johns Hopkins, MD, EUA

Preparando 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7

Na primeira parte deste experimento, você preparará uma solução de fosfato de sódio tamponada em pH 7,0. O fosfato monossódico é um ácido fraco com a base conjugada, fosfato dissódico. As soluções de fosfato monossódico não ajustadas geralmente têm um pH de cerca de 4 a 6.

Os tampões são mais eficazes perto de seu pKa, que é de 6,8 a 7,2 para fosfato monossódico. Portanto, você usará NaOH para empurrar o equilíbrio em direção à base conjugada sem alterar a composição geral do equilíbrio do tampão.

Antes de iniciar o experimento, calcule a massa de fosfato monossódico que você precisará para fazer 200 mL de uma solução de 50 mM.

Tabela 1: Preparação de tampão 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0

Massa molar de NaH₂PO₄ = 119,98 g/mol
Volume da solução (mL)	200
Molaridade (mM)	50
Mols de NaH₂PO₄ (mol)
Massa necessária (mg)
Volume inicial de 1 M NaOH (mL)
Volume final de NaOH 1 M (mL)
Volume de NaOH utilizado (mL)
Volume de água DI necessário (mL)

Clique aqui para baixar a Tabela 1

Para começar, coloque o equipamento de proteção individual necessário, incluindo jaleco, óculos de segurança resistentes a respingos e luvas. nota: Esta seção do laboratório usa NaOH, que é corrosivo e tóxico. Tenha cuidado ao despejar e transportar NaOH.
Encha um frasco de lavagem de plástico de 250 mL com água deionizada.
Rotule dois copos de 100 mL, um para resíduos aquosos neutros e outro para resíduos aquosos básicos.
Calibre seu medidor de pH usando os tampões fornecidos. Armazene a sonda em sua solução de armazenamento quando terminar.
Tara o papel de pesagem e use uma espátula limpa para medir a quantidade necessária de fosfato monossódico de acordo com seus cálculos. Registre a quantidade exata de fosfato monossódico em seu caderno de laboratório. nota: O fosfato monossódico absorve a umidade do ar, portanto, trabalhe rapidamente para obter uma medição precisa e feche bem o recipiente quando terminar.
Coloque o fosfato monossódico em um copo de 400 mL e limpe a espátula com um lenço umedecido. Jogue fora o papel de pesagem e o lenço de laboratório antes de retornar à sua hotte.
Use um cilindro graduado para medir 175 mL de água deionizada. Despeje a água no copo de fosfato monossódico e adicione uma barra de agitação magnética.
Agite a solução até que o sal se dissolva completamente e a solução pareça homogênea. Isso geralmente leva de 2 a 3 minutos.
Meça 15 mL de água deionizada e despeje no béquer. Continue mexendo a solução até que pareça homogênea novamente (cerca de 1 a 2 min). Desligue o motor de agitação.
Enxágue a sonda de pH com água deionizada e, em seguida, prenda-a na solução com o sensor acima da barra de agitação.
Traga um cilindro graduado de 10 mL e um vidro de relógio para a coifa de distribuição e meça 10 mL de NaOH 1 M. Observe o volume exato no cilindro graduado.
Cubra seu NaOH com o vidro do relógio e leve-o cuidadosamente para a exaustão.
Retomar a agitação da solução de fosfato monossódico. Enquanto monitora a leitura do pH, use uma pipeta descartável para adicionar lentamente NaOH à solução agitadora de maneira gota. Quando o pH do tampão atingir 7,0, retorne qualquer NaOH ainda na pipeta para o cilindro graduado.
Calcule o volume de NaOH que você adicionou ao buffer. Subtraia esse volume de 10 mL para determinar quanta água deionizada você deve adicionar ao seu tampão para atingir um volume total de solução de 200 mL.
Meça a água deionizada com outro cilindro graduado de 10 mL e adicione-o à solução de agitação para terminar de fazer o tampão.
Enxágue o sensor de pH com água deionizada, cubra-o com a tampa cheia de solução de armazenamento e desconecte ou desligue a sonda.
Rotule um frasco de polietileno de 250 mL como 'tampão fosfato monossódico de 50 mM, pH 7.0'. Recupere a barra de agitação magnética da solução.
Use um funil para despejar a solução tampão no frasco rotulado e tampe bem.

Espectroscopia de Absorção de Vermelho Neutro Livre e Ligado
Os tampões podem ser usados para avaliar compostos em valores específicos de pH. Nesta seção, você registrará o espectro de absorbância do indicador vermelho neutro em vários buffers. A forma protonada do vermelho neutro é vermelha, e a forma desprotonada é amarelo-laranja, o que significa que eles absorvem luz verde e azul-violeta, respectivamente. Assim, as formas ácida e básica têm comprimentos de onda de absorção distintos. A ligação às proteínas altera as propriedades do vermelho neutro, alterando tanto sua absorbância quanto seu pKa.

Depois de medir o espectro de absorbância do vermelho neutro livre em vários valores de pH, você adicionará a proteína de ligação à riboflavina, ou RP, às soluções e medirá as absorbâncias novamente. A intensidade da absorbância está relacionada à concentração, então você usará os espectros para determinar o pKa do vermelho neutro livre e ligado após o laboratório.
- Desenhe a tabela a seguir em seu caderno de laboratório. Numere as cubetas de 1 a 10 e liste os nove valores de pH do tampão que você usará. A 10ª cubeta será um branco de água deionizada. nota: Sempre segure as cubetas pelos lados texturizados e limpe os lados transparentes antes de colocar a cubeta no espectrofotômetro. Lembre-se de alinhar os lados transparentes com o feixe de luz no espectrofotômetro.
  Tabela 2: Absorbância de Vermelho Neutro Livre e Ligado
  
  Cuvette # Buffer pH Abs. em λ_max(NRH⁺ livre) Abs. em λ_max (NRH vinculado)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 blank
  Clique aqui para baixar a Tabela 2
- Obtenha dez cubetas e tampas de 1,5 mL e rotule as tampas de 1 a 10 para corresponder à tabela em seu caderno de laboratório.
- Rotule um béquer de 25 mL como 'DIH2O' e encha-o com água deionizada.
- Despeje seus resíduos aquosos neutros no ralo e rotule novamente o béquer como 'resíduo tampão aquoso'.
- Rotule um copo de 400 mL para pontas de micropipeta usadas.
- Conecte uma ponta a uma micropipeta de 1 mL e use-a para dispensar 1000 μL de água deionizada na cubeta 10. Este é o seu solvente em branco.
- Coloque 925 μL do seu tampão fosfato monossódico de pH 7,0 na cubeta 5.
- Traga as cubetas vazias restantes para a mesa de buffer. Guiado pela tabela em seu caderno de laboratório, dispense 925 μL de cada tampão na cubeta apropriada usando as micropipetas rotuladas. Tenha cuidado para não usar a mesma ponta de pipeta para tampões diferentes.
- Depois de terminar, traga os buffers de volta para sua bancada. Lá, defina uma micropipeta de 200 μL para dispensar 75 μL e conecte uma ponta à micropipeta.
- Dispense 75 μL de vermelho neutro em cada uma das nove cubetas tampão. Inverta cada cubeta várias vezes para misturar bem as soluções. nota: Substitua a ponta da pipeta se ela tocar em um tampão.
- Depois de misturar o vermelho neutro com cada buffer, tire uma foto ou anote as cores das soluções.
- Ligue um espectrofotômetro portátil e deixe a fonte de luz aquecer. Quando estiver pronto, crie um novo experimento para medir a absorbância versus o comprimento de onda para o vermelho neutro livre.
- Insira a cubeta de água deionizada e adquira um espectro da água deionizada. Defina-o como um fundo solvente ou em branco.
- Em seguida, remova o branco e insira a cubeta de vermelho neutro no tampão de pH mais baixo, que terá a maior concentração de vermelho neutro protonado.
- Adquira um espectro, que deve mostrar um pico forte. Identifique o comprimento de onda correspondente ao ponto mais alto desse pico, ou o máximo. Registre esse comprimento de onda em seu caderno de laboratório como lambda max para vermelho neutro livre protonado.
- Salve os dados e remova a cubeta. Registre a absorbância em seu caderno e, em seguida, colete espectros para cubetas 2 a 9 usando o mesmo procedimento.
- Registre o comprimento de onda do ponto isosbético em seu caderno de laboratório. É aí que todos os espectros se cruzam em um único comprimento de onda. Se um espectro não cruzar nesse ponto, esvazie e limpe a cubeta, prepare uma nova amostra e tente novamente.
- Depois de terminar de coletar espectros para todas as nove cubetas, salve e exporte os dados.
- Crie um novo experimento para medir a absorbância versus o comprimento de onda para o vermelho neutro ligado.
- Encaixe uma nova ponta na micropipeta de 200 μL e adicione 75 μL de solução de proteína de ligação à riboflavina a cada cubeta, incluindo o branco. Ejete a ponta, prenda as tampas da cubeta e inverta a cubeta várias vezes para misturar as soluções.
- Inserir a cubeta 10 no espectrofotómetro e colocá-la como o solvente em branco.
- Adquira um espectro da amostra de pH mais baixo e identifique o comprimento de onda correspondente ao máximo do pico mais intenso. Grave-o em seu caderno de laboratório como o lambda max de vermelho neutro ligado a protonado.
- Adquira espectros para cubetas 2 a 9 da mesma forma que você fez para as amostras vermelhas neutras grátis. Registre as intensidades em lambda max para vermelho neutro ligado a protonação em sua tabela, juntamente com o comprimento de onda no ponto isosbético.
- Quando terminar, salve seus dados, exporte-os para análise posterior e desligue o espectrofotômetro.
- Guarde todo o equipamento e descarte as ponteiras de pipeta usadas em um recipiente de lixo ou lixeira aprovado.
- Esvazie as cubetas no copo de resíduos aquoso e lave as cubetas no copo com água deionizada.
- Esvazie o excesso de NaOH no lixo básico e enxágue o cilindro graduado com água.
- Lave os resíduos aquosos básicos no ralo com água da torneira abundante, junto com os outros resíduos aquosos.
- Lave seus copos, tampas de cuvete e barra de agitação de acordo com os procedimentos padrão do seu laboratório. Limpe suas superfícies de trabalho com uma toalha de papel úmida e jogue fora toalhas de papel usadas e lenços umedecidos no lixo do laboratório.
Results
Agora, vamos analisar nossos dados de absorbância para determinar os pKa do vermelho neutro.

Tabela 3: Determinação de pKa vermelhos neutros

NRH⁺ grátis Encadernado NRH⁺
λ_max (nm)
ΔA (nm)
Ponto médio (nm)
pKa

Clique aqui para baixar a Tabela 3
- Plote ambos os conjuntos de dados de intensidade com intensidade de absorbância em lambda max no eixo y e pH no eixo x, com os pontos unidos por linhas suaves.
- Calcule a diferença entre as intensidades de absorbância inicial e final para cada série de dados.
- Determine a absorbância a meio caminho entre as absorbâncias inicial e final para cada série, ou os pontos médios de absorbância.
- Descubra onde o ponto médio ocorre em cada linha e identifique o valor do pH nesse ponto. Esses valores de pH são os pKa do vermelho neutro livre e ligado.
- Aqui, vemos um aumento no pKa de cerca de um entre o vermelho neutro livre e o vermelho, indicando que o vermelho neutro protonado ligado é um ácido mais fraco do que o vermelho neutro protonado livre em uma ordem de magnitude.