Análise da Rolling Leucócitos Fisiológica E-Selectina-Mediated no endotélio microvascular

Summary

Este relatório fornece uma representação visual de placas paralelas análise câmara de fluxo para o estudo de interações leucócitos endoteliais sob tensão de cisalhamento fisiológico. Este método é particularmente útil para investigar o papel do endotélio (E)-selectina e E-selectina leucócitos ligantes que leucócitos gatilho rolando na superfície das células endoteliais.

Abstract

E-selectina é uma proteína de membrana tipo-1 em células endoteliais microvasculares que ajuda a iniciar o recrutamento de leucócitos circulantes para os tecidos ósseos cutânea, e inflamado. E-selectina expressão é constitutiva de microvasos dérmica e óssea e é induzível por citocinas pró-inflamatórias, como IL-1α / TNF-α e, em microvasos em tecidos inflamados. Este receptor medeia a lectina fracas interações de ligação com carboidratos contra receptor-ligantes em leucócitos circulantes, o que resulta em um comportamento característico de rolamento. Porque essas interações precedem eventos adesivo mais estável e atividade diapedese, caracterização da atividade rolling de leucócitos e identificação de leucócitos E-selectina ligantes foram objetivos principais em estudos de tráfico de leucócitos e inflamação e no desenvolvimento de terapêuticas anti-inflamatórios (1-5) . A intenção deste relatório é fornecer uma descrição, visual abrangente da tecnologia mais amplamente utilizada para estudar a E-selectina E-selectina interações ligante sob condições de fluxo fisiológico de sangue. Nosso laboratório em conjunto com o Centro de Pesquisas de Doenças da Pele Harvard usa um state-of-the-art de placas paralelas aparelhos de câmara de fluxo acompanhada através da visualização digital e software de gravação de novo, NIS Elements. Esta tecnologia permite-nos analisar os eventos de adesão em tempo real para visualização na tela assim como a atividade registro rolando em um formato de vídeo. Parâmetros de adesão celular, tais como a resistência ao rolamento, frequência de corte e ligação / tethering eficiência, são calculados com NIS Elements software, exportados para uma planilha do Excel e submetidos à análise estatística. Na demonstração apresentada aqui, foi empregado o câmara de fluxo de placas paralelas para investigar E-selectina-dependente a atividade de leucócitos rolando ao vivo medula óssea humana endotelial (hBMEC). Células progenitoras hematopoéticas KG1a, que expressam um alto nível de E-selectina ligante, foram utilizados como nosso modelo de leucócitos, enquanto que uma linha celular imortalizada hBMEC, HBMEC-60 celas, foi usado como nosso modelo de células endoteliais (6). Para induzir e simular expressão E-selectina nativa na câmara de fluxo, HBMEC-60 células foram ativado pela primeira vez com a IL-1. Nossa apresentação de vídeo mostrou que placas paralelas análise de fluxo é um método adequado para estudar a E-selectina mediada fisiológico de leucócitos atividades rolamento e que a caracterização funcional de ligante E-selectina leucócitos (s) na câmara de fluxo pode ser verificada através da implementação de protease ou glicosidase digestões.

Protocol

1. Preparação de hBMEC (HBMEC-60 Cell) monocamada em placas de Petri para a Câmara de Fluxo

1. Revestimento 35 x 10mm cultura de tecidos de pratos com 2ml de fibronectina 20μg/ml (em PBS) durante a noite a 4 ° C ou por 3 horas a 37 ° C.
2. Aspirar solução fibronectina dos pratos e acrescente 1,5 x10 ⁵ células HBMEC-60 [Meio 199 com HEPES e Glutamina, 10% FBS, 10% de soro humano, 5 unidades / ml de heparina, 1ng/ml fator de crescimento humano recombinante de fibroblastos, 1% Penicilina- estreptomicina] para o prato e permitir-lhes crescer a> confluência de 90%. (Isso leva 2 dias)
3. Aspirar meios de crescimento e, para se regular-E-selectina expressão, adicione meio fresco com IL-1β 50ng/mL para 4-6 hrs. Monocamadas de células agora está pronto para rolar ensaio. Para bloquear E-selectina função, neutralizando anti-humano E-selectina Moab (clone BBIG-E4 (5D11)) podem ser adicionados a 20μg/ml para ~ 1h a 37 ° C.

2. Preparação de células progenitoras hematopoéticas KG1a para Câmara de Fluxo

1. Células progenitoras hematopoéticas KG1a são cultivadas a confluência (1x10 ⁶ células / ml) em RPMI-1640 com glutamina e 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina e são pipetados diretamente do frasco para utilização em ensaio de câmara de fluxo.
2. Número de células é calculada usando um hemocitômetro e depois as células são re-suspenso em 1 x 10 ⁶ células / mL em HBSS com 10 mM HEPES (H / H buffer) e CaCl ₂ 2mM
3. Células são armazenadas no gelo até a sua utilização no ensaio.

3. Preparação de Microscópio Câmara de Fluxo, de placas paralelas e bomba de seringa (Figura 1)

Figura 1. Ilustração de placas paralelas Análise Câmara de Fluxo. Microscópio invertido, Harvard bomba de seringa, computador de câmera / e de placas paralelas câmara de fluxo são colocados em um arranjo ideal para análise de células eficientes e reprodutíveis.

1. Ligue a alimentação e fonte de luz para microscópio invertido e poder de bomba de seringa e selecione a objetiva de 10x no microscópio.
2. Coloque 50 mL em tubo cônico titular e encher com H / H e 2mM CaCl _2.
3. Lugar de tubos de plástico de 5 ml de teste em tubo de ensaio titular abaixo do tubo de 50 ml cônico
4. Coloque 60ml seringa na bomba de seringa (Certifique-se que tanto o êmbolo da seringa e do corpo são ambos garantidos).
5. Anexar 3 vias-stop pau-de-final da seringa 60ml e anexar seringa de 5 ml para 3 vias-stop-galo.
6. Coloque aparelho Câmara paralela de fluxo (GlycoTech, Inc.) no palco microscópio com tubo de entrada para a direita, tubo de saída para a esquerda e tubo de vácuo para trás.
7. Anexar tubos de vácuo para vácuo e válvula de ar livre para que os aparelhos de placas paralelas para aderir ao palco. (Isso testa se a saia de vácuo na câmara de fluxo é hermético.) Desligue a válvula de ar.
8. Ligar a linha de saída de tubos (à esquerda de microscópio) para 3-way-stop-galo. Aparelho está agora preparado para a colocação no HBMEC-60 placa monocamada.
9. Coloque placa de monocamada HBMEC-60 e colocar no centro do microscópio.
10. Ligue vácuo e posição do aparelho câmara de fluxo acima da placa de tal forma que a placa monocamada está no centro.
11. Delicadamente mais baixo do aparelho câmara de fluxo na placa monocamada HBMEC-60 e que os aparelhos câmara de fluxo de sucção para baixo. (Não deve haver nenhum som de ar escapando e, neste ponto você pode precisar de aplicar pressão sobre a câmara para comprimir a junta de borracha).
12. Uma vez vácuo foi estabelecido, tubo de entrada local (à direita) para dentro do tubo cônico contendo 50mL H / H com 2mM CaCl _2.
13. Abrir 3 vias-stop-galo para permitir o fluxo para a seringa 60ml e bomba lugar no "modo de bomba."
14. Para retirar o ar de entrada / saída de linhas sem levantar as células na placa, use a bomba de seringa fixada em 2mL/minute para encher o tubo de entrada, em seguida, definir rapidamente a 0,5 mL / minuto apenas antes de o líquido atinge o aparelho. É imperativo para preparar este jogo com cuidado e evitar bolhas de ar que vai levantar a monocamada da placa.
15. Uma vez que o fluido é visto para entrar na seringa 60ml, a câmara de fluxo e bomba de seringa foram preparadas e da câmara de fluxo está pronto para uso. Esta configuração será repetido para cada execução de entrada de célula e para cada novo prato necessário.

4. Captura dos leucócitos Eventos do Rolling usando NIS Elements

1. Elementos aberta NIS no desktop.
2. Pressione o botão "play" ícone para imagem ao vivo. Exposição automática permitirá que você ver a placa mais fácil para agora e é importante para focagem.
3. Certifique-se que microscópio está focado corretamente na monocamada de células.
4. Uma vez focada, a exposição re-set a 1 luz de quadros / segundo e ajustar no microscópio. A imagem deve aparecer no computador e não estar mais visível no visor do microscópio, devido ao nível de pouca luz. Histograma de luz pode então ser adajustada para eliminar a exposição de fundo ou melhorar a clareza da célula.
5. Clique em bin 2X2 ou Bin Live para obter imagem que é ideal para captura de filme
6. Clique em "Macro" na barra de menu e selecione "gravar na porta"; selecione a porta "COM3" e "aberto". (Isso abre a porta para coordenar com a bomba de seringa.
7. Pipetar 1 ml de suspensão de células KG1a no tubo de ensaio 5ml perto da linha de tubulação de entrada e em seguida, coloque linha de tubulação de entrada para o fundo do tubo de ensaio.
8. Ir para barra de menus, clique em "Capture", "aquisição de lapso de tempo."
9. Um novo menu irá aparecer. Selecione o protocolo com duração 210 segundos, esta é a duração do programa para rolar em HBMEC-60 Cells. (Cada fase é programado para tirar uma foto a cada segundo para a duração do protocolo de bomba. Também é configurado para enviar um comando através da porta COM3 para ligar a bomba.) Se lapso de tempo é interrompida, a bomba não vai parar por conta própria e deve ser reposto. Pressione Cancelar para voltar a viver da imagem.
10. Definir a bomba de seringa para "Modo de Programação" de acordo com manual de instruções. (Modo Programa permite a programação manual de taxas de fluxo específico (ou seja, níveis de estresse de cisalhamento), a ser transmitido dentro da câmara e ditar as interações célula KG1a sobre a monocamada de células HBMEC-60.) Configurações para KG1a célula rolando em Células hBMEC foram os seguintes 4,2 dinas / cm ² por 45 s, 0,3 dinas / cm ² por 60 s, e aumenta gradualmente a cada 15 s até um máximo de 4,2 dinas / cm ²
11. Parede de tensão de cisalhamento (W _st) na câmara foi calculada de acordo com a seguinte equação: W _st = 6μQ / a b ^2, onde μ é a viscosidade estimada dos meios de comunicação (0,0076 P), Q é a vazão volumétrica em ml / s, a é a altura do canal (espessura da junta) em cm (0,03 cm), e b é a largura do canal em cm (0,5 cm). Vazões foram regulamentados usando o modo de programação da bomba de seringa.
12. Microscópio e computador agora está pronto para capturar lapso de tempo fotografia. Pressione "start run" no computador para começar a aquisição de dados. Durante a execução do programa, não se esqueça de adicionar mídia para o tubo de ensaio contendo células KG1a a fim de manter a tubulação de entrada / saída completa do meio (Certifique-se que não há bolhas de ar).

5. Dependência de sialilação Terminal e glicoproteína de superfície de E-selectina-mediada por células KG1a 5. Rolamento (Figura 2; Vídeos Clipes de 5,1-5,5)

1. Dosagem de KG1a célula rolando sobre a não-estimulada HBMEC-60 células. (Controle negativo), células KG1a foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver não-IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.
2. Dosagem de célula KG1a rolando no HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β. (E-selectina-dependência controle) KG1a células foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.
3. Dosagem de célula KG1a rolando no HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β e neutralizantes anti-humano E-selectina Moabe. (E-selectina-dependência controle) KG1a células foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL- 1β estimulada HBMEC-60 pré-tratados com anti-humano neutralizando Moabe E-selectina como descrito acima.
4. Dosagem de células-sialidase digerida KG1a rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pré-tratadas com 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidase de 1hr a 37 ° C foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.
5. Dosagem de célula protease-digerida KG1a rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pré-tratadas com protease, 0.2U/ml Bromelain de 1h a 37 ° C, foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.

6. Análise do NIS Elements-Cells KG1a Capturado e gráficos de Cell KG1a Dados do Rolling

1. Após seqüência de tempo é adquirido, salvar os dados.
2. Ir para "medir" a guia na barra de menu e selecione "definir limite." Mover barras de modo que as células desejadas são coloridos em vermelho. Selecione "todas as imagens" e depois "Ok". A seqüência de lapso de tempo inteiro deve agora ser modificado com vermelho visível células de rolamento.
3. Vá para "Medir" e selecione "restrições". (Restrições permitem ao usuário excluir objetos thresholded que não representam as células de rolamento. Isto é principalmente de fundo criado pela monocamada HBMEC-60.) Selecione "área" e min de entrada e os valores máximo para a área de células de rolamento. Repita este passo para "alongamento" e "circularidade".
4. Selecione "medida" e selecione "criar binários usando restrições", e definir os valores de restrição para otimizar NIS Elements software de reconhecimento de células rolando em monocamada de células HBMEC-60.
5. Voltar para "medir", selecione "Os dados de campo" e selecione "dados reset". Fechar este menu.
6. Retorno à "Medida" e SEselecione "campo scan".
7. "Medida" aberto "; Os dados de campo", selecione "número ou Objects" e selecione "todos os campos" e exportar dados para o Microsoft Excel.
8. Selecione "dados claros" para preparar-NIS Elements aquisição de células para a coleta de dados seguinte.

Resultados:

Figura 3. Parallel Plate-Análise Câmara Fluxo de E-selectina-Binding Atividade em Células KG1a. KG1a células tratadas com sialidase ou protease foram analisados ​​para rolar a eficiência em monocamadas de HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β. Controle negativo rolando experimentos também foram realizados por meio da análise de células KG1a rolando sobre a não-IL-1β estimulada HBMEC -60 células ou IL-1β estimulada HBMEC-60 células tratadas com anti-humano neutralizando E-selectina Moab (5D11). Freqüências de rolamento de células foram realizadas em triplicata e analisados ​​com NIS Elements software. (Significância estatística *, p <0,001)

Neste relatório, baseado em vídeo, nós fornecemos uma representação visual de como analisar leucócitos - células endoteliais interações fisiológicas sob condições de estresse de cisalhamento. Em particular, analisamos o papel da E-selectina - E-selectina ligantes na mediação tethering leucócitos e rolando, um comportamento adesivo necessário para o compromisso do ensino secundário mais estável atividades de ligação através de receptores, como integrinas e receptores de ácido hialurônico. Usando a câmara de fluxo de placas paralelas adaptada para uso com um microscópio invertido, bomba de Harvard Seringa, câmera de vídeo e computador / celular de aquisição de hardware, realizamos experimentos em que E-selectina ligante + células KG1a foram usados ​​como nosso modelo de leucócitos e células hBMEC (HBMEC- 60) estimuladas com citocinas pró-inflamatórias, IL-1β, foram usados ​​como o nosso E-selectina modelo de células endoteliais humanas + (1-6). Como relatado anteriormente, observamos células KG1a robusta rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60 células em um intervalo de níveis de tensão de cisalhamento de uma maneira E-selectina-dependente (Figura 3) (diferença estatisticamente significativa quando comparada com células KG1a rolando no não-IL-1β HBMEC-60 estimulou as células). Controles negativos, que consistia em KG1a célula rolando sobre a não-IL-1β estimulada HBMEC-60 em células ou IL-1β estimulada HBEMC-60 células pré-tratadas com mAb anti-humano E-selectina, foram realizados em paralelo para demonstrar a dependência de estimulação de citocinas e E-selectina expressão para a atividade de rolamento (Figura 3). Além disso, análise de rolamento de células pré-tratadas com KG1a Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) ou com bromelina, uma protease não específica conhecida para digerir superfície E-selectina glicoproteína ligante, destacou a importância dos resíduos de ácido siálico terminais e glicoproteína de superfície de E-selectina ligante atividade (2,3).

Discussion

De placas paralelas análise câmara de fluxo é uma empresa especializada sistema in vitro utilizado para estudar leucócitos - interações adesivas endoteliais sob condições de estresse de cisalhamento semelhantes aos transmitidos na superfície de uma vênula pós-capilar. Tal como é descrito aqui, em nossa apresentação visual, que demonstram o valor deste sistema para investigar o papel da E-selectina - E-selectina ligantes na mediação tethering leucócitos e rolando sobre a superfície do endotélio microvascular ativado. Nós também revelam a aplicação de glicosidase protease, e os tratamentos de anticorpos bloqueadores para elucidar o papel da E-selectina e seus ligantes neste sistema. Estas análises são altamente reprodutíveis e ajudar a formar uma base experimental para o estudo de E-selectina - E-selectina função de ligante in vivo.

Além de estudar a adesão celular com monocamadas de citocinas ativadas células endoteliais microvasculares (veia umbilical hBMEC ou humanos ou células endoteliais microvasculares dérmicas), os ensaios podem ser realizados utilizando humana recombinante purificada E-selectina ou E-selectina-Ig moléculas quiméricas como substrato de adesão celular. Interações outro adesivo mediada por leucócitos (L)-selectina e de plaquetas (P)-selectina também podem ser analisadas utilizando-placa paralela tecnologia de câmara de fluxo. Variando o tipo de substrato celular monocamada / proteína ou de leucócitos de entrada / modelos-selectina transfectant célula, os pesquisadores podem estudar o papel dessas interações sob condições de estresse fisiológico de cisalhamento.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Sigma-Aldrich	F6178-500ML
DPBS	GIBCO, da Life Technologies	14190
0.5 M EDTA	GIBCO, da Life Technologies	15575-038
1M HEPES	GIBCO, da Life Technologies	15630
Kit de Câmara de Fluxo de Placa Paralela	GlycoTech	31-001
PHD2000 Programável Bomba de seringa	Harvard Apparatus	PHD 2000
35x10mm Placa de cultura de tecidos	BD Biosciences	353001
Fibronectina, de plasma humano	Sigma-Aldrich	86088-83-7 F2006-2MG
Interleucina-1_, Humano; Recombinante	Sigma-Aldrich	I9401-5UG
HBSS (Solução salina tamponada de Hank)	GIBCO, por Life Technologies	14170
Medium 199 com HEPES & Glutamina	Invitrogen	12320-039
Soro Humano	Innovative Research, Inc.	IPLA-SER1
Heparina	Abraxis BioScience	504011
Fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes	R& D Systems	233-FB
Penicilina Estreptomicina	GIBCO, da Life Technologies	15140
Tubos de ensaio de plástico	BD Biosciences	352008
clone de E-selectina anti-humana BBIG-E4 (5D11)	R & Sistemas D	BBA16
Bromelina	Sigma-Aldrich	B-4882