Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.
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Artigo de método
Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste vídeo, descrevemos os métodos eletrofisiológicos para a gravação da transmissão sináptica na junção neuromuscular (MNJ) da larva Drosophila. O sistema neuromuscular é uma sinapse larval modelo para o estudo da fisiologia sináptica e neurotransmissão, e é um valioso instrumento de pesquisa que definiu a genética e é acessível à manipulação experimental. As larvas podem ser dissecado para expor o corpo musculatura da parede, sistema nervoso central, e os nervos periféricos. Os músculos de Drosophila e seu padrão de inervação estão bem caracterizadas e os músculos são de fácil acesso para gravação intracelular. Músculos individuais podem ser identificados por sua localização e orientação dentro do 8 segmentos abdominais, cada um com 30 músculos dispostos em um padrão que se repete em segmentos A2 - A7. Dissecados larvas de drosófila são músculos finos e individuais e feixes de axônios do neurônio motor pode ser visualizado por transiluminação
Protocolo
Antes de iniciar preparar:
- Wandering yhird instar as larvas Drosophila
- HL3.1 solução (Modificado hemolinfa-like)
- Placas Sylgard (borracha de silicone transparente) dissecção preparado em pequena (35 x 10 mm) pratos de plástico petri usando métodos descritos por Brent e McCabe (2008) 3.
- Cortar pinos dissecção curta
- Estimulando pipetas eletrodo
- Afiada pipetas de gravação
HL3 Solução:
- Durante as dissecções e experimentos eletrofisiológicos, larva são imersos em solução de 2 HL3.1 que contém (em mM): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHC....
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Discussão
Os métodos descritos aqui oferecem uma maneira relativamente rápida e ampla para detectar mudanças na função sináptica no MNJ. A capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas usando animais intactos in vivo, e executar manipulações genéticas ou farmacológicas, fazer Drosophila um modelo animal ideal para investigar os aspectos fisiológicos e genéticos da neurotransmissão.
Como as células musculares são muito grandes, alguns podem preferir adicionar um passo adicional para este protocol.......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri pequenas (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| Kit de Elastômero de Silicone SYLGARD 182 | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Microscópio estereoscópico | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Luz para microscópio | Schott AG | KLI500 | |
| Agulhas de dissecação | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Software pClamp 9 | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Tesoura de dissecação: Tesoura de mola Vannas de 3 mm | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Pinça Dumont SS | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinça Dumont nº 5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capilares de vidro borossilicato com paredes finas, com filamento (1,0 mm, 4 pol) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Capilares de vidro borossilicato, com filamento (1,2 mm, 4 pol) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Puxador de micropipetas a laser Sutter P-2000 | Sutter Instrument Co. | Modelo P-2000 | |
| Polidor de pipetas | Narishige International | MF-83 | |
| Estágio de cabeça Axon HS-2A | Molecular Devices | Modelo HS-2A | |
| Micromanipuladores | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Amplificador Axoclamp 2B | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Software Clampex | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Software Mini analysis, v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Amplificador de Precisão Brownlee | Brownlee | Modelo 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sacarose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Gerador de Pulso Master-8 | A.M.P.I | ||
| Mesa vibratória para configuração de eletrofisiologia | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Gaiola de Faraday |
Referências
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F.
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Reimpressões e permissões
