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Antes de iniciar preparar:
- Wandering yhird instar as larvas Drosophila
- HL3.1 solução (Modificado hemolinfa-like)
- Placas Sylgard (borracha de silicone transparente) dissecção preparado em pequena (35 x 10 mm) pratos de plástico petri usando métodos descritos por Brent e McCabe (2008) 3.
- Cortar pinos dissecção curta
- Estimulando pipetas eletrodo
- Afiada pipetas de gravação
HL3 Solução:
- Durante as dissecções e experimentos eletrofisiológicos, larva são imersos em solução de 2 HL3.1 que contém (em mM): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trealose, 115, sacarose e 5 HEPES, pH 7.2.
- Concentrações de CaCl 2 são adicionados à solução HL3.1 para fornecer a concentração necessária de Ca 2 + extracelular.
- Dissecções larvas são realizados em baixa Ca 2 + concentrações (para evitar a contração muscular), utilizando HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, mantido em gelo.
- Experimentos eletrofisiológicos são normalmente registrados em HL3.1 + 1 mM CaCl 2, mas isso pode ser ajustado 0,4-1 mM Ca 2 +, conforme necessário.
- A solução é HL3.1 filtro esterilizadas antes do uso, e armazenados a 4 ˚ C.
Preparação de estimulação e registro pipetas:
- Pipetas de gravação e estimulantes são puxados com um P-2000 Sutter extrator Laser micropipeta com base utilizando as seguintes definições: Calor = 390, Filamento = 4 Velocity, = 35, Delay = 200 e Pull = 0.
- Eletrodos estimulantes são preparados a partir de paredes finas de vidro de borosilicato capilares com extremidades largas que eram ligeiramente maior que a largura da axônios motores cortados. As extremidades moldadas são firepolished para dar um acabamento liso (usando uma pipeta Narashiga polidor), para minimizar os danos ao nervo. Eletrodos estimulantes são preenchidos com solução de banho (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +).
- Os eletrodos de gravação são preparados a partir de 1,2 milímetros de vidro de borosilicato, que é puxado para formar uma pipeta afiada (30-60 mohms), e preenchido com KCl 3M.
Parte 1: Dissecção de larvas de Drosophila
- Larvas de terceiro estádio errantes são dissecados para expor os músculos da parede do corpo, conforme descrito anteriormente 4.
- Dissecções são realizados em HL3.1 + 0,25 mM Ca 2 + em placas de silicone pequena (35 x 10 mm). HL3.1 solução deve ser gelada para dissecções, a fim de anestesiar a larva, e é mantido no gelo antes e durante a dissecção.
- As larvas são dissecados usando métodos descritos por Brent e McCabe (2008), que é modificado para experimentos de eletrofisiologia, adicionando 0,25 mM Ca 2 + para a solução dissecção HL3.1, e utilizando pinos de dissecção de curta duração (~ 2 mm de comprimento) que são menos probabilidade de acertar a objetiva do microscópio e eletrodos durante um experimento.
- Após dissecação, os axônios motores das larvas são cortados. Isto é feito com cuidado, segurando o SNC e elevá-la ligeiramente para os nervos periféricos que inervam os músculos posteriores ao gânglio ventral pode ser cortada sem danificar os músculos (Figura 1). O cérebro é então removido.
- A preparação das larvas dissecadas é lavada duas vezes com HL3.1 + 1 mM Ca 2 +.
Figura 1. Esquemático mostrando as etapas envolvidas no corte os axônios motores de larvas dissecadas. O CNS é levantado com uma pinça e os axônios motores são cortadas na base do cérebro.
Parte 2: gravações intracelular das células musculares larval.
- Coloque a placa de dissecção no microscópio eletrofisiologia e submergir a preparação com HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + e fixar o eletrodo banho assim que está em contato com a solução.
- Todos os experimentos são realizados no músculo seis dentro do terceiro segmento abdominal (A3). Nervos periféricos que inervam os músculos são estimulados através de um eletrodo de sucção 5.
- Posição do eletrodo de estimulação no primeiro prato, para evitar vibrações quando o eletrodo intracelular está no lugar. Coloque o eletrodo estimulando nas imediações do neurônio motor inerva músculo 6 e aplicar sucção suave até que o nervo corte está dentro da pipeta de vidro. Tenha cuidado para não esticar os nervos quando a sucção é aplicada. Elevar a pipeta ligeiramente por isso não está tocando o músculo e posicioná-lo por isso não é puxando as fibras nervosas cortadas (Figura 2).
Figura 2. Um esquema da musculatura e dos neurônios motores, que inervam de um segmento abdominal da larva Drosophila. A posição da pipeta estimulante e nervos cortados eo eletrodo de gravação na posição em músculo 6 são ilustrados. - Intragravações de celulares são feitos com microeletrodos afiada cheia com 3 M KCl. Posição do eletrodo de registro acima do centro do músculo 6 no terceiro segmento abdominal (A3) e ajustar a entrada compensado assim que lê zero para a solução do banho. Abaixe lentamente o eletrodo e se aproximar do músculo sob ampliação ótica de alta até tocar a superfície do músculo. Assista o osciloscópio para confirmar que o músculo tenha sido penetrado. O potencial de repouso deve ser de pelo menos -60 mV, ou o animal não deve ser usado. Esporádicos potenciais de placa terminal em miniatura deverão ser agora visíveis. Deixe o celular para estabilizar por um minuto antes de começar a gravar.
- Mudanças no potencial de membrana são detectados com um estágio de cabeça Axon HS-2A e 2B Axoclamp um amplificador e gravou com Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). A 2B Axoclamp é conectado a um computador que executa o software pCLAMP e funciona em conjunto com a interface Digidata 1322A.
- As células foram gravadas por 3 minutos, sem qualquer estímulo para medir as respostas mEJP. Traços foram analisados usando o software de análise Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) e da amplitude mEJP e freqüência determinada.
A estimulação do nervo:
- O final cortado do neurônio motor é estimulado com uma série de pulsos de voltagem quadrados (0,3 ms de duração) em uma intensidade que é suficiente para ambos os axônios motores, para evocar respostas consistentes em todo o músculo.
- O estímulo é gerado com o Mestre-8 gerador de pulsos, que é programado para entregar pulsos continuamente de acordo com a duração e os tempos de intervalo.
- Permitir que cinco segundos entre os estímulos para a recuperação sináptica no MNJ.
- Ao determinar a força do estímulo, começar com o nível mais baixo e aumentar a intensidade lentamente ao longo de vários ensaios. A intensidade do estímulo mínimo que resulta em uma resposta evocada deve ser usado em experimentos.
- Quando a intensidade do estímulo adequado é alcançado, deve haver uma EJP composto e uma contração muscular evocada pelo estímulo.
- Registro de pelo menos 10 potenciais evocados de cada músculo e média as amplitudes.
Parte 3: Resultados Representante
Figura 3. Intracelular gravação Representante do músculo 6 mostrando o evocado EJP é resposta à estimulação elétrica do nervo segmentar, e os potenciais de placa terminal em miniatura esporádicos, ou mEJP é. EJP amplitudes no músculo 6 de larvas do tipo selvagem saudáveis, como Canton S, são normalmente em torno de 40 mV e as amplitudes mEJP entre 1-3 mV.