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Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.
Peixe-zebra tem sido utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento por lapso de tempo de imagem do embrião vivo transparente. Aqui nós descrevemos um método para montar embriões zebrafish de longo prazo de imagem e demonstrar como automatizar a captura de imagens de lapso de tempo usando um microscópio confocal. Descrevemos também um método para criar danos, controlado precisa para ramos individuais de axônios sensitivos periféricos em zebrafish usando o poder concentrado de um laser de femtosegundos montado em um microscópio de dois fotões. Os parâmetros para axotomia dois fótons de sucesso deve ser otimizada para cada microscópio. Vamos demonstrar dois fótons axotomia em ambos um costume construída microscópio de dois fótons e uma Zeiss 510 / confocal de dois fótons para fornecer dois exemplos.
Zebrafish trigeminal neurônios sensoriais podem ser visualizados em uma linha de transgênicos expressando GFP dirigido por um promotor neurônio sensorial específica 1. Nós adaptamos este modelo zebrafish trigeminal para observar diretamente a regeneração do axônio sensorial em que vivem os embriões do zebrafish. Embriões são anestesiados com tricaina e posicionado dentro de uma gota de agarose como ela se solidifica. Embriões imobilizado são selados dentro de uma câmara de imagem cheia de phenylthiourea (PTU) Ringers. Nós descobrimos que os embriões podem ser continuamente trabalhada, nas câmaras de 12-48 horas. A única imagem confocal é então capturado para determinar o local desejado para a axotomia. A região de interesse está localizado no microscópio de dois fotões por imagem os axônios sensoriais em baixa, o poder não-prejudicial. Depois de ampliar no local desejado de axotomia, a potência é aumentada e uma única varredura da região definida é suficiente para romper o axônio. Múltiplas localização de imagens de lapso de tempo é então configurado em um microscópio confocal para observar diretamente a recuperação de uma lesão axonal.
Parte 1: embriões zebrafish de montagem para longo prazo imagem
Parte 2: Dois fótons axotomia usando um personalizado construído microscópio de dois fótons com um Ti-Safira Chameleon a laser
Parte 3: Two-photon axotomia em microscópio confocal Zeiss 510 / dois fótons
Parte 4: imagens de lapso de tempo em Confocal Zeiss LSM 510
Parte 5: Os resultados representativos
A experiência bem sucedida irá resultar em uma representação precisa da dinâmica celulars de axônio recuperação da lesão. Seu embriões será saudável após imagem, sem degeneração visível e uma batida de coração forte. A axotomia deve resultar em danos preciso, só cortando o ramo definido do axônio. Não deve haver prejuízo para os axônios circundante e morte celular mínima. Acreditamos que vemos a morte de uma única célula epidérmica diretamente sobre o local da axotomia em ~ 50% dos experimentos. Se você observar mais dano, você deve otimizar o protocolo de dois fótons, como descrito na discussão.
We have used the methods described to precisely axotomize peripheral sensory axons and to directly observe regeneration in the living zebrafish embryo. Long-term time-lapse confocal imaging in zebrafish can be used to observe many developmental processes in vivo. The two-photon axotomy procedure described can be modified for many different experimental goals. We have used the same general procedure to ablate entire trigeminal sensory neuron cell bodies, by zooming in on the cell body rather than on a branch of the peripheral axon. Any cell type identifiable with fluorescence can be precisely damaged or ablated with the focused power of the femtosecond laser. We were inspired to perfect these techniques for the zebrafish system by previous studies in several other systems where pulsed lasers were used to create localized damage or to ablate cells4,5,6. In control experiments we confirmed that axotomy is extremely precise: we have never damaged nearby axons, even when they are branches of the same cell, and only occasionally damaged epithelial cells in close juxtaposition to axons. This specificity can be explained by the fact that intensity from two-photon laser excitation drops off quadratically with distance from the focal point3,7. Moreover, since energy emitted from the excited fluorophore contributes to photodamage, surrounding unlabeled cells are likely to be spared.
The laser power required to damage an axon may vary depending on the set up of the laser, the depth of the tissue, and your experimental goal. If you wish to damage axons deeper in the embryo, more power will be required. It is best to attempt the axotomy at a low power, and then incrementally increase the power until you find the amount that will sever the axon. Once you have determined the appropriate amount of laser power for axotomy, you should be able to reproducibly use this laser power to cause local tissue damage. If you notice that over time more power is required to create an axotomy, the laser and microscope may require maintenance (for example, the laser may be out of alignment). Make sure your laser is properly aligned, clean your objective, and check the mirrors.
Agradecemos a Mark Terasaki para aconselhamento inicial sobre o uso de um microscópio de dois fótons para criar dano tecidual local, Kathy Joubin para aconselhamento sobre a montagem de lapso de tempo de imagem, e os laboratórios Sagasti e portera-Cailliau para as discussões. Experimentos iniciais foram realizados por AS como Fellow da Fundação grama nos laboratórios de Biologia Marinha de Woods Hole, MA. Trabalho no laboratório Sagasti foi suportada por concessões da Fundação Whitehall, a Fundação Klingenstein, e um Burroughs Wellcome Fund Prémio Carreira em Ciências Biológicas.
