Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Resumo

Neste artigo apresentamos um protocolo geral para medir a expectativa de vida dos nematóides mantidos em meios sólidos com alimentos UV-morto bacteriana.

Resumo

O envelhecimento é um processo degenerativo caracterizado por uma deterioração progressiva de componentes celulares e organelas, resultando em mortalidade. O nematóide

Protocolo

Parte 1: Prepare nematóide crescimento media (NGM) placas

Esta seção descreve a preparação das placas NGM sólido para uso no experimento vida. A experiência de extensão básicas da vida requer dois tipos de placas: placas NGM padrão, que não contêm aditivos, e Amp / FUDR placas, que têm ampicilina (Amp) e fluorodeoxyuridine (FUDR) adicionado ao NGM. Ampicilina é usado para prevenir a contaminação bacteriana estrangeiros. FUDR inibe a divisão celular, reduz a produção de ovos, e impede que os ovos de incubação. O uso de FUDR para a análise da longevidade não afeta expectativa de vida de adultos e elimina a necessidade de transferência de worms cada poucos dias, a fim de separá-los de larva a crescer. Ambos os tipos de placas são semeados com E. coli OP50 bactérias, que é posteriormente morto por exposição a UV.

1. Prepare NGM (ver secção 5 para receita e notas de armazenamento) e placas de petri rótulo. Você vai precisar de uma placa de petri 60 milímetros por 10 mL de NGM. Se você está começando com previamente preparado NGM sólida, avance para o passo 1.2. Se você está começando com NGM recém autoclavado, pule para o passo 1.4.
2. Derreter completamente NGM sólido por microondas em alta em 30 pulsos segundo. Media redemoinho entre os pulsos para evitar bolhas de gás pressurizado de edificação.
3. NGM lugar líquido em 55 ° C ou banho de água na bancada para esfriar.
4. Uma vez que NGM atinge 55 ° C adicionar 33 mL de 150 FUDR mM e 100 mL de 100 mg / mL por 100 mL Ampicilina NGM (para Amp / FUDR placas) e agite para misturar. Para placas NGM sem drogas adicionais prosseguir diretamente para o passo 1.5.
5. Utilizando uma técnica estéril, pipetar 10 mL em cada placa NGM petri 60 mm. Evite a formação de bolhas, se possível. Se as bolhas se formam, elas podem ser estalado usando uma ponta da pipeta.
6. Deixar as placas sobre a bancada com tampas para permitir NGM para solidificar e seco. Se possível, deixe as placas no banco por 2 dias antes da adição de bactérias, mas um dia vai funcionar se as placas são necessários mais cedo.
7. No dia antes de terminar a secagem das placas, a semente da cultura LB líquido com uma única colônia a partir de uma raia fresca de E. coli OP50 bactérias em agar LB. Você deve preparar, pelo menos, 1 mL de uma cultura OP50 noite por 60 placa mm.
8. Cultura local OP50 em 37 ° C shaker e permitir que as bactérias cresçam overnight (a cultura deve atingir a saturação).
9. Pellet OP50 bactérias girando a 3.500 g por 10 minutos.
10. Remover 90% das bactérias sobrenadante e ressuspender concentrar cultura 10x.
11. Pipetar 100 mL da cultura 10x OP50 concentrada no centro de placas NGM solidificado. Placas agite cuidadosamente para espalhar cultura de bactérias se necessário (o ideal bactérias deve cobrir a área central da NGM sem chegar perto das muralhas da placa). Tente evitar tocar a ponta da pipeta na superfície da NGM, como falhas na superfície dos meios de comunicação permitirá que as minhocas burrow na NGM.
12. Deixe placas no banco durante a noite para permitir cultura de bactérias para secar na NGM sólido (normalmente demora cerca de 24 horas).
13. Depois de seco, expor a superfície das placas a uma dose UV suficiente para deter o crescimento das bactérias. Se você estiver usando uma Stratalinker UV Stratagene 2400:
    • Placas lugar no Stratalinker e remover as tampas
    • Feche a porta e ligar o Stratalinker
    • "Energia" de imprensa
    • Digite '9999 'usando o teclado
    • 'Start' imprensa
    • As placas serão expostos aos raios UV por aproximadamente 5 minutos
14. Placas com as bactérias UV-morto pode ser armazenado de cabeça para baixo a 4 ° C por até 1 mês.

Parte 2: Executar um ovo cronometrados que estabelece uma idade para a aquisição sincronizada população de animais

Nesta seção, vamos gerar uma população de vermes com uma data comum hatch. Isto é conseguido, permitindo que adultos reprodutivamente ativos para colocar ovos em um prato por um período definido de tempo e permitindo que os ovos se desenvolvam.

1. (Opcional) Transferência de aproximadamente 20 vermes adultos jovens a uma placa NGM fresca sem FUDR. Deixar as placas a 25 ° C, a fim de permitir que worms se propaguem e comer através de todos os alimentos bacteriana. Depois que o alimento foi consumido bacteriana worms recém-nascidos vai entrar no estágio de crescimento preso Dauer. Você começará a ver larva Dauer em torno de uma semana, dependendo de quantos worms você transferir para a placa inicialmente. Dauer larva pode ser usado para as próximas etapas para até um mês.
2. (Opcional) Transferência larva Dauer 20-30 a uma placa NGM fresca sem FUDR. Na presença de larva de alimentos se tornarão adultos Dauer reprodutivamente ativa dentro de 2 dias e manter-se reprodutivamente ativa por alguns dias depois a 25 ° C.
3. Transferência de 10-15 adultos reprodutivamente ativa para uma placa NGM fresca sem FUDR. Esta placa é referida como a postura de ovos cronometrado (TEL) da placa.
4. Deixe a placa TEL a 25 ° C durante 6 horas, a fim de permitir que tele worms tempo para botar ovos.
5. Remover vermes adultos de placa TEL. Placa pode ser inspeccionados visualmente para os ovos antes de remover os adultos. Se os vermes não tenham estabelecido um número suficiente de ovos a placa TEL podem ser deixados a 25 ° C por até um total de 24 horas antes de retirar vermes adultos.
6. Colocar a placa TEL a 20 ° C até que os ovos eclodiram e os vermes desenvolveram ao estágio larval L4 (o que normalmente leva 2 dias para tipo selvagem C. elegans, mas pode demorar mais tempo para as cepas com fenótipos de desenvolvimento lento).

Parte 3: animais Partituras de vida

Nesta seção, siga as idade sincronizado população de vermes na parte 2 até morrerem. Worms são mantidos em Amp / FUDR placas para impedir a produção de ovos ea contaminação bacteriana e são considerados mortos quando não conseguem responder a estímulos externos.

1. Transferência de larva L4 para semeado Amp / FUDR placas. Para cada estirpe ou condição a ser testada, é típico para configurar 2-3 placas com 25-30 worms por placa. Imagens da C. fases da vida elegans são fornecidos para a referência (Figura 1) ^1.
2. Lugar Amp / FUDR placas a 20 ° C por 24 horas.
3. Após 24 horas, visualmente avaliar worms, mídia e bactérias. Transferência de worms para fresco Amp / FUDR placas se qualquer um dos seguintes é observado:
   • Worms ter comido a maior parte dos alimentos bacteriana. No início da vida worms experimento extensão terá de ser transferida 1-2 vezes por semana para evitar que as bactérias fossem esgotados.
   • Um número significativo de larvas estão presentes. Isso geralmente é uma indicação de que os vermes foram transferidos para as placas Amp / FUDR como jovens adultos, em vez de L4s e foram capazes de colocar alguns ovos antes da FUDR entrou em vigor. O FUDR geralmente impedir que as larvas se transformem em adultos completa, mas, ocasionalmente, alguns vão se transformar em adultos e se confundem com os animais experimentais.
   • Bactérias vivas / crescentes são observadas. Geralmente, a combinação de Amp e UV-matança vai garantir que nenhuma bactéria contaminar viver a experiência, mas ocasionalmente ocorre.
   • Crescimento do fungo é observada na mídia. Se detectada a tempo, o crescimento de fungos geralmente podem ser cortadas usando uma ponteira ou espátula. Uma vez que cresce a ser maior do que alguns milímetros de diâmetro é geralmente mais fácil de transferir os vermes para um novo prato.
   • Usando o escopo de dissecação, determinar se cada um worm é vivo ou morto.
   • Bata suavemente a placa. O worm é vivo se move em resposta ao toque.
   • Se o worm não responde a tocar a placa de zoom, em na região da cabeça.
   • Bata suavemente a cabeça do verme com pick transferência de platina. Pontuação o worm como morto, se ele não responder movendo a cabeça.
   • Worms mortos pode ser removido da placa.
4. Registrar a data eo número de vermes que estão vivos e mortos.
5. Retorno placas a 20 ° C.
6. Repita os passos 3,3 a 3,6 a cada 2 a 3 dias até que todos os vermes já morreram.

Parte 4: Resultados Representante.

Os dados brutos produzidos por um período de experiência de nematóides de vida é uma lista de datas com números correspondentes de vermes que estão vivos e mortos para cada cepa testada. O número de worms que morrem em cada dia é tipicamente invertido para calcular a proporção de vermes vivos em cada dia (Figura 2A), que é plotado graficamente como uma curva de sobrevivência (Figura 2B, o dia da postura de ovos cronometrado é considerado dia 0 ). O tempo de vida para cada verme individuais no estudo pode ser calculado a partir da contagem de vermes que morrem em cada dia e usado para calcular tempo de vida média e mediana para a comparação entre as linhagens. A contagem do número de vermes vivos em cada dia não é utilizado diretamente na análise de ciclo de vida. Worms mantidos em meios sólidos irá ocasionalmente 'fugir', ou rastrear tanto para cima da parede da placa ou para baixo abaixo da media. O número de vermes vivos em cada dia pode ser usado para determinar quantos worms fugiram durante todo o curso do experimento. Worms que fogem são normalmente removidos da análise. Como referência, o tempo de vida típico mediana para N2, a C. elegans cepa do tipo selvagem, mantidos em UV-matou as bactérias a 20 ° C é de aproximadamente 25 dias, como medida de ovo.

Parte 5: Soluções

Nematóide Crescimento Media (NGM), 100 mL:
Combine:
0,3 g	NaCl
0,25 g	Peptona
2 g	Agar
Autoclave por 40 minutos e deixe esfriar até 55 ° C, em seguida, acrescentar:
100 L	1 M MgSO 4
100 L	Colesterol 5 mg / mL
100 L	1 M CaCl2
1,625 mL	1,5 M pH 6,0 KPI
NGM líquido pode ser usado imediatamente para derramar placas ou permissão para solidificar e armazenados a longo prazo na temperatura ambiente

Luria Broth (LB), 1L:
10 g	BactoTryptone
5 g	Extrato de levedura
10 g	NaCl
10 mL	1 M Tris pH 8,0
1 L	água deionizada
Autoclave e armazenar em temperatura ambiente.

1 M MgSO 4, 300 mL:
73,95 g	MgSO 4
300 mL	água deionizada
Autoclave e armazenar em temperatura ambiente.

Colesterol 5 mg / mL, 200 mL:
1 g	colesterol
200 mL	Etanol 100%
Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente.

1 M CaCl 2, 500 mL:
27,75 g	CaCl 2
500 mL	água deionizada
Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente.

1,5 M pH 6,0 KPI, 1L:
Combine:
31,4 g	KPI dibásico
179,6 g	KPI monobásico
850 mL	água deionizada
De calor durante a mistura para permitir KPI para dissolver na solução. Ajustar o pH para 6,0 com NaOH 10 N.
Adicione água deionizada para 1 L.
Autoclave e armazenar em temperatura ambiente.

1 M Tris, pH 8.0:
60,57 g	Tris
400 mL	água deionizada
Ajustar o pH para 8,0 com HCl.
Adicionar água deionizada até 500 mL.
Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente.

150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 mL:
0,3693 g	FUDR
10 mL	água deionizada estéril
Armazenar a -20 ° C.

100 mg / mL Ampicilina (AMP), 10 mL:
1 g	Ampicilina
10 mL	água deionizada estéril
Armazenar a -20 ° C.

50 mg / mL carbenicilina (Carb), 10 mL:
500 mg	Carbenicilina
10 mL	água deionizada estéril
Armazenar a -20 ° C.

1 M isopropílico β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 mL:
2,38 g	IPTG
10 mL	água deionizada estéril
Armazenar a -20 ° C.

Figura 1. Brilhante imagens campo de C. fases da vida elegans, incluindo ovo, quatro estágios larvais (L1 - L4) e adultos. Todos os painéis mostram hermafroditas, exceto o inferior direito, o que mostra um homem adulto (Imagem de Wood (1988)).

Figura 2. Os resultados representativos de um C. elegans experimento tempo de vida comparando N2 linhagem selvagem tipo para uma cepa que contém uma mutação no gene daf-2. (A) Uma tabela mostrando os dados coletados, incluindo o número de dias desde worms foram ovos, número de vermes mortos observadas em cada dia, ea porcentagem da amostra original permanecer vivo em cada dia (como calculado a partir da contagem diária de vermes mortos) . (B) Survival curvas correspondentes aos dados de tempo de vida previsto no (A).

Figura 3. Comparação Representante da lipofuscina entre jovens e velhos adulto C. elegans. Imagens de campo claro são mostrados à esquerda e as imagens de fluorescência DAPI canal à direita. Painéis superiores mostram um verme 4 dias de idade e painéis de fundo mostram um worm de 11 dias de idade (medida a partir de ovo).

Discussão

O controle genético da longevidade tem sido estudado extensivamente em C. elegans, em grande parte devido à facilidade e rapidez com que expectativa de vida pode ser determinada. O protocolo discutido neste artigo descreve uma estrutura básica para a obtenção de dados de vida reprodutíveis extensão em C. elegans e também pode ser aplicado às espécies relatednematode. ² Ao fazer algumas alterações simples desses procedimentos pode ser adaptado para medir a expectativa de vida sob uma variedad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar	Reagente	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicilina	Reagente	Ciência Média	0339
BactoTriptona	Reagente	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Reagente	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Reagente	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Carbenicilina	Reagente	Biotecnologia do Ouro	C0109
Colesterol	Reagente	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodesoxiuridina (FUDR)	Reagente	Sigma-Aldrich	F0503
Isopropil β-d-Tiogalactopiranósido (IPTG)	Reagente	Biotecnologia do Ouro	I2481C5
KPi Dibasic	Reagente	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Reagente	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Reagente	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Reagente	Fisher Scientific	S251
Tris	Reagente	Sigma-Aldrich	T1503
Extrato de Levedura	Reagente	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)