Um método simples, barato e eficaz de preparação de embriões de Drosophila live-imaging análise é apresentada. Nosso protocolo fornece umidade e as trocas gasosas e não comprimir o embrião de Drosophila. Este método é adequado para GFP baseada em imagens ao vivo de embriões Drosophila usando um estereomicroscópio ou microscópio composto vertical.
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Artigo de método
Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Proteína fluorescente verde (GFP) baseado em timelapse ao vivo de imagens é uma técnica poderosa para estudar a regulação genética de processos dinâmicos como a morfogênese do tecido, célula-adesão, ou morte celular. Embriões Drosophila expressando GFP são prontamente fotografada usando um microscópio estereoscópico ou confocal. A meta de qualquer protocolo de live-imaging é minimizar efeitos negativos como a desidratação e hipóxia. Protocolos anteriores para preparar os embriões de Drosophila live-imaging análise envolveram a colocação de embriões dechorionated em óleo halocarbonos e imprensando-los entre um halocarbono gás-permeáveis membrana e uma lamela
Protocolo
Preparação
- Coletar embriões em placas padrão suco de uva-agar 4. É conveniente usar um sistema automatizado de Drosophila Egg Collector (Flymax Scientific Equipment Ltd.). Usando síncrona encenado coleções embrião irá reduzir o número de dechorionations que devem ser executadas de modo a obter um número suficiente de embriões no estágio de desenvolvimento desejado.
- Prepare um slide dechorionation anexando um pedaço de fita dupla face a uma lâmina de microscópio; remover a proteção da fita adesiva.
- Prepare a câmara de imagens ao vivo, cortando um pedaço de tecido para caber no poço da câmara. Coloque o tecido no bem e molhe-a ....
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Discussão
Descrevemos um novo método de preparação de embriões Drosophila para análise de imagens ao vivo, que chamamos de protocolo de gota em suspensão. Infelizmente, não é possível usar o protocolo de gota em suspensão se trabalhar com um microscópio invertido. Neste caso, a técnica de sanduíche (como descrito acima no abstract) deve ser utilizado e compressão dos embriões permanece uma preocupação.
Em experimentos onde a forma da célula e tamanho são medidos para calcular forças associadas com o m.......
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Agradecimentos
Agradecemos o apoio de HB através de um Grant Descoberta, bem como um instrumentos de pesquisa e Grant Instrumento das Ciências Naturais e Engenharia pesquisas Council of Canada (NSERC). Reconhecemos também H. Oda eo Bloomington Drosophila ações Centro para a prestação de estoques genéticos que foram usadas no exemplo sequências de imagens ao vivo.
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Materiais
Equipamento de série e materiais necessários para preparar embriões para live-imaging usando o protocolo gotas de suspensão incluem os seguintes itens: lâminas de microscópio, lamínulas (22 x 40 mm, n º 2), fita dupla face, fórceps joalheiro (estilo Dumont No. 5 ), óleo de halocarbonos série 56 e série 700 (Halocarbon Products Corp), uma faca ou lâmina de barbear única borda, papel de seda, tesoura, água destilada, fita de propósito geral, e uma pipeta adequada para a entrega mL 20-40. O protocolo de imagens ao vivo também requer uma custom-made câmara de imagens ao vivo. Esta é preparada através do corte de 5 mm acho policarbonato folha de plástico com as dimensões de uma lâmina de microscópio padrão (75 X 25 mm) e usando um rotor para criar uma depressão profunda 3 milímetros no slide (20 X 55 mm). Acesso a um microscópio estereoscópico (microscópio de dissecação) e uma fonte de iluminação de fibra óptica também é necessária.
Referências
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retracti....
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Reimpressões e permissões
