Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Resumo

Um método simples, barato e eficaz de preparação de embriões de Drosophila live-imaging análise é apresentada. Nosso protocolo fornece umidade e as trocas gasosas e não comprimir o embrião de Drosophila. Este método é adequado para GFP baseada em imagens ao vivo de embriões Drosophila usando um estereomicroscópio ou microscópio composto vertical.

Resumo

Proteína fluorescente verde (GFP) baseado em timelapse ao vivo de imagens é uma técnica poderosa para estudar a regulação genética de processos dinâmicos como a morfogênese do tecido, célula-adesão, ou morte celular. Embriões Drosophila expressando GFP são prontamente fotografada usando um microscópio estereoscópico ou confocal. A meta de qualquer protocolo de live-imaging é minimizar efeitos negativos como a desidratação e hipóxia. Protocolos anteriores para preparar os embriões de Drosophila live-imaging análise envolveram a colocação de embriões dechorionated em óleo halocarbonos e imprensando-los entre um halocarbono gás-permeáveis ​​membrana e uma lamela

Protocolo

Preparação

1. Coletar embriões em placas padrão suco de uva-agar ^4. É conveniente usar um sistema automatizado de Drosophila Egg Collector (Flymax Scientific Equipment Ltd.). Usando síncrona encenado coleções embrião irá reduzir o número de dechorionations que devem ser executadas de modo a obter um número suficiente de embriões no estágio de desenvolvimento desejado.
2. Prepare um slide dechorionation anexando um pedaço de fita dupla face a uma lâmina de microscópio; remover a proteção da fita adesiva.
3. Prepare a câmara de imagens ao vivo, cortando um pedaço de tecido para caber no poço da câmara. Coloque o tecido no bem e molhe-a com água destilada.
4. Mix halocarbono óleo (Halocarbon Products Corp) série 700 viscosidade e série 56 na proporção de 1:1. A mistura pode ser armazenada e usada indefinidamente.
5. Coloque várias pequenas gotas de óleo de halocarbonos na superfície de uma lamela (22 X 40 mm, n º 2). O volume não é crítica mas deve ser da ordem de mL 20-40.

Procedimento

1. Com o auxílio de um estereomicroscópio, coletar embriões a partir do suco de uva-ágar placas usando um par de fórceps joalheiro (n º 5) ou um pincel muito fino. Embriões tendem a ficar uns aos outros e às pontas do fórceps ", pois eles são facilmente reunidas em grupos.
2. Com o auxílio de um estereomicroscópio, delicadamente abaixar a aglomerados de embriões que tenham aderido às pontas do fórceps na superfície da fita sobre o slide dechorionation.
3. Novamente usando o estereomicroscópio, delicadamente nudge ou acidente vascular cerebral os embriões com o lado da pinça, a fim de romper o córion exterior waxy sem ruptura da membrana vitelina interna (o embrião vai estourar se a membrana vitelina é rompido).
4. Uma vez que o córion exterior foi rompido, burlar o embrião a partir do córion; o embrião dechorionated tende a aderir à superfície do fórceps. Tome cuidado para evitar tocar o embrião dechorionated para a superfície da fita.
5. Assim que um embrião é dechorionated, rapidamente transferi-lo para a queda previamente preparado de óleo de halocarbonos na lamela. Toque a ponta da pinça carregando o embrião dechorionated à superfície da gota de óleo halocarbono - este desaloja o embrião do fórceps no óleo.
6. Confirmar a transferência do embrião para a queda do petróleo. Isto pode ser feito a olho nu, desde que você trabalha sobre um fundo preto e usar uma fonte de iluminação de fibra óptica fixado em um ângulo oblíquo.
7. Antes de tentar dechorionate outro embrião, limpar todo o óleo do fórceps. Fórceps revestido em óleo têm menos compra na superfície córion, tornando dechorionation mais difícil.
8. Embriões são Dechorionated flutuante no óleo halocarbonos. Utilizando uma pinça ou um pincel e durante a visualização através de um microscópio estereoscópico, empurre o embrião para o fundo da gota de óleo e organizá-lo na posição desejada.
9. Rapidamente inverter a lamínula sobre o poço da câmara de imagens ao vivo. Confirmar que os embriões estão descansando contra a lamínula na orientação desejada. Devido à sua flutuabilidade no óleo, os embriões serão agora flutuar contra a superfície inferior da lamela. Fixar a lamínula para a câmara de imagens ao vivo com fita adesiva. Ventilar a câmara cortando buracos na fita na área onde a fita mede o intervalo entre a extremidade da lamela eo fim do poço da câmara de imagens ao vivo.
10. Um microscópio de fluorescência na vertical ou um estereomicroscópio fluorescência agora pode ser usado para a imagem dos embriões.

Discussão

Descrevemos um novo método de preparação de embriões Drosophila para análise de imagens ao vivo, que chamamos de protocolo de gota em suspensão. Infelizmente, não é possível usar o protocolo de gota em suspensão se trabalhar com um microscópio invertido. Neste caso, a técnica de sanduíche (como descrito acima no abstract) deve ser utilizado e compressão dos embriões permanece uma preocupação.

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Materiais

Equipamento de série e materiais necessários para preparar embriões para live-imaging usando o protocolo gotas de suspensão incluem os seguintes itens: lâminas de microscópio, lamínulas (22 x 40 mm, n º 2), fita dupla face, fórceps joalheiro (estilo Dumont No. 5 ), óleo de halocarbonos série 56 e série 700 (Halocarbon Products Corp), uma faca ou lâmina de barbear única borda, papel de seda, tesoura, água destilada, fita de propósito geral, e uma pipeta adequada para a entrega mL 20-40. O protocolo de imagens ao vivo também requer uma custom-made câmara de imagens ao vivo. Esta é preparada através do corte de 5 mm acho policarbonato folha de plástico com as dimensões de uma lâmina de microscópio padrão (75 X 25 mm) e usando um rotor para criar uma depressão profunda 3 milímetros no slide (20 X 55 mm). Acesso a um microscópio estereoscópico (microscópio de dissecação) e uma fonte de iluminação de fibra óptica também é necessária.