Artigo de método
GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.
Alto rendimento métodos para examinar localização de proteínas ou morfologia organela é uma ferramenta eficaz para o estudo de interações de proteínas e podem ajudar a alcançar uma compreensão abrangente de vias moleculares. Em Saccharomyces cerevisiae, com o desenvolvimento da matriz de exclusão não essenciais gene, podemos globalmente estudar a morfologia das organelas diferentes, como o retículo endoplasmático (ER) e da mitocôndria utilizando GFP (ou variante) marcadores no gene backgrounds diferentes. No entanto, os marcadores de GFP incorporando em cada mutante único individualmente é um processo trabalhoso. Aqui, descrevemos um procedimento que é utilizado rotineiramente em nosso laboratório. Usando um sistema robótico para lidar com arrays de alta densidade fermento e técnicas de seleção de drogas, podemos reduzir significativamente o tempo necessário e melhorar a reprodutibilidade. Em resumo, nós cruzamos um marcador GFP-tagged mitocondrial (Apc1-GFP) para um conjunto de alta densidade de 4.672 mutantes de deleção do gene não essencial por robótico réplica pinagem. Através da seleção diplóide, esporulação, germinação e seleção marcador dual, nós recuperamos ambos os alelos. Como resultado, cada mutante haplóide única contém Apc1 GFP-incorporados em seu locus genômica. Agora, podemos estudar a morfologia das mitocôndrias em todas fundo não essenciais mutante. Usando essa abordagem de alto rendimento, podemos convenientemente estudar e delinear os caminhos e os genes envolvidos na herança ea formação de organelas em um cenário de todo o genoma.
Materiais e métodos:
SGA mídia:
A mídia de crescimento (YPD) e meios de comunicação selecionando (SD) utilizado neste protocolo é utilizado rotineiramente em biologia molecular de leveduras. Por favor, consulte Métodos de levedura (Amberg et al., 2005) para descrições detalhadas.
LRK, LHRK mídia (para 400 total de ml)
| Adicionar a fim | Quantidade |
| Base de levedura nitrogenadas com sulfato de amônio | 2,7 g |
| Aminoácidomistura | 0,8 g |
| Agar | 8 g |
| dH 2 O | 360 mL |
| Autoclave | |
| Dextrose 20% | 40 ml |
| Arrefecer a 65 ˚ C | |
| 100 mg / ml canavanina | 0,2 ml |
| 100 mg / ml thialysine | 0,2 ml |
| Misture, despeje 50 ml por placa | |
LRK, LHRK G418 + media (para 400 total de ml)
| Adicionar a fim | Quantidade |
| Base de levedura nitrogenados, sem sulfato de amônio | 0,7 g |
| Mix de aminoácidos | 0,8 g |
| O glutamato monossódico | 0,4 |
| Agar | 8 g |
| dH 2 O | 360 mL |
| Autoclave | |
| Dextrose 20% | 40 ml |
| Arrefecer a 65 ˚ C | |
| 100 mg / ml canavanina | 0,2 ml |
| 100 mg / ml thialysine | 0,2 ml |
| 200 mg / ml G418 | 0,4 ml |
| Misture, despeje 50 ml por placa | |
Enriquecido esporulação de mídia (para 400 total de ml)
| Adicionar a fim | Quantidade |
| Acetato de potássio | 4 g |
| Extrato de levedura | 0,4 g |
| Dextrose | 0,2 g |
| Esporulação mix de aminoácidos | 0,04 g |
| Agar | 8 g |
| dH 2 O | 360 mL |
| Autoclave | |
| Arrefecer a 65 ˚ C | |
| 200 mg / ml G418 | 0,4 ml |
| Misture, despeje 50 ml por placa | |
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Este método pode ajudar eficientemente incorporar um marcador mitocondrial, ACP1-GFP em várias formações mutantes. Ele se baseia na utilização de um sistema robótico, e pode facilmente adotado para uso com qualquer sistema robótico. Este procedimento pode ser usado também para incorporar outros tipos de marcadores. Por exemplo, para visualizar ER, que utilizam rotineiramente o marcador Erg11-GFP. No nosso imagens representativas, uma mutante e um tipo selvagem com o fabricante ACP1-GFP foram visualiz ed por microscopia ...
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Este trabalho foi financiado pela Biotecnologia e Ciências Biológicas Research Council (concessão 31/C15982), os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, a Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento, a Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde (conceder a CJR Loewen) e Luta em Prol da Visão.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mídia SGA | A mídia de crescimento (YPD) e as mídias sintéticas de eliminação (SD), incluindo LRK e LHRK, e a mídia enriquecida para esporulação utilizadas neste protocolo são comumente empregadas na biologia molecular de leveduras. Consulte Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) para descrições detalhadas. |
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