Rato de isolamento de células Adrenal Cromafim

Resumo

Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.

Resumo

Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.

Protocolo

Abreviaturas:
ACCs - Células Adrenal Cromafim, E. Soln - solução enzimática, E. DMEM - Modified Dulbecco Enriquecido Eagle Medium

1. Preparação
   1. Adicionar papaína a quantidade desejada de E. Soln (40 unidades papaína / 1ml E. Soln.).
   2. Ativar papaína com carbogênio por cerca de 15 minutos em gelo. Buffer de Locke oxigenar sobre gelo também.
      
2. Dissecação
   1. Use 10/08 rato semana.
   2. Antes de remover a digestão oxigenado tampão de Locke e colocar no gelo.
   3. Consulte o vídeo para procedimento de dissecção.
   4. Uma vez retirado, glândulas lugar em oxigenado tampão de Locke.
      
3. Preparação de Gland
   1. Retire a gordura da glândula.
   2. Faixa de córtex da glândula.
      
4. A digestão enzimática
   1. Filtro estéril oxigenado papaína.
   2. Fazer quatro piscinas de papaína oxigenada em uma placa de Petri.
      1. 3 piscinas deve ser de cerca 100uls.
      2. Uma das piscinas deve ser de cerca 400uls.
   3. Lavar medulas através piscinas
      1. 1 através da 3 piscinas 100ul.
      2. Em seguida, através da piscina 400ul
      3. Pippette 300ul E. Soln e medula peças de piscina 400ul em tubo de microcentrífuga.
      4. Qrap parafilme em microcentrífuga tubo e colocar em 37 ° C banho-maria por 20min.
      5. Lembre-se de continuar a oxigenar restantes E. Soln contendo papaína.
      6. Após 20 minutos estéril filtro mais E. Soln.
      7. Substituir as antigas E. medulas banho Soln com o recém-filtrada E. Soln.
         
5. Triturações
   1. Aspirar e descartar E. Soln.
   2. Lavar medulas em 1ml E. DMEM.
   3. Aspirar e descartar E. DMEM.
   4. Adicionar 300ul E. DMEM e triturar 20X com 1ml ponta.
   5. Cortar ponta 200ul com lâmina de barbear estéril.
   6. Triturar 5-10X com ponta 200ul corte.
   7. Descartar E. DMEM medulas peças de banho. Medium irá conter detritos.
   8. Adicionar 300uls fresco E. DMEM para medulas peças.
   9. Triturar com a ponta 200ul 20x
   10. Pippette E. DMEM para microcentrífuga pedaços de tubo withough medulas. Médio conterá ACCs livres.
   11. Adicionar 300uls fresco E. DMEM para medulas peças.
   12. Triturar medulas com uma agulha de seringa 23,5 calibre 20x.
   13. Combine E. DMEM de ambas as triturações. Peças medulas não deve estar presente e deve agora ter uma aparência featherlike.
       
6. Galvanização
   1. Microcentrífuga E. DMEM de as duas últimas etapas de trituração por 2,5 minutos a 3.7g s.
   2. Ressuspender sedimento em 50uls-200 E. DMEM, dependendo experimentos subseqüentes.
   3. Placa de 10 30uls em uma lamela de vidro.
   4. Esperar 15 minutos para que as células aderem.
   5. Adicionar 750uls de E. DMEM.