Microinjeção de seleção, e as imagens de fluorescência marcado com F-actina através de microscopia fluorescente speckle (FSM).
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Artigo de método
Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste protocolo, descrevemos o uso de Microscopia fluorescente Speckle (FSM) para capturar imagens de alta resolução de actina na dinâmica PtK1 células. A única vantagem do FSM é sua capacidade de captar o movimento e cinética volume de negócios (montagem / desmontagem) da rede de F-actina dentro de células vivas. Esta técnica é particularmente útil em derivar medidas quantitativas de F-actina dinâmica quando emparelhado com o computador de software de visão (qFSM). Descrevemos a seleção microinjeção, e visualização de sondas fluorescentes de actina em células vivas. Importante, procedimentos semelhantes são aplicáveis a visualizar conjuntos macomolecular outros. FSM tem sido demonstrado por microtúbulos, filamentos intermediários, e os complexos de adesão.
Protocolo
Seção 1: Obtenção do seu actina fluorescente etiquetado para FSM
Materiais necessários: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga
- Um componente chave para a aquisição de filmes FSM boa exige a rotulagem adequada de actina (ou outras proteínas do citoesqueleto) com o fluoróforo de sua escolha.
Recomendamos o uso de fluoróforos Alexa (488, 568 comprimentos de onda) e X-rodamina derivados de éster succinimidyl que a meta exposta resíduos de lisina sobre a superfície da actina. - Ao escolher o seu fluoróforo e seu comprimento de onda adequado, assegurar que sua configura....
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Discussão
Vários fatores importantes são cruciais para o êxito da obtenção de imagens speckle, manchas no entanto bom começar e terminar com a qualidade do seu actina fluorescente etiquetado. A relação de rotulagem elevado de tintura para actina monômero, situado em torno de 0,4-,7 irá garantir que os salpicos aparecerá brilhante e discreta, enquanto a proteína em si deve ser rotulado solúvel e livre de agregados. Igualmente importante é o procedimento de microinjeção. Para garantir a homeostase celular normal (e sobrevivência), .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
O desenvolvimento de qFSM é financiado pelo NIH a concessão U01 GM06230.
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Materiais
Injeção de buffer (IB)
50 mM glutamato de potássio
0,5 M MgCl2 (ANEXO 2A)
Armazenar até 2 anos a -20 ° C
G-buffer
2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Apêndice 2A)
0,2 mM CaCl2 (ANEXO 2A)
Adicionar imediatamente antes da utilização:
0,2 mM ATP (ver receita para 100 mM)
0,5 mM 2-mercaptoetanol
Referências
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin network....
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Reimpressões e permissões
