Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

Resumo

Um protocolo curto para a coloração de proteínas com Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 em gel de poliacrilamida é descrito sem o uso de solventes orgânicos ou em ácido acético como nos procedimentos de coloração clássica com CBB.

Resumo

Em protocolos de proteína clássica coloração com Coomassie Brilliant Blue (CBB), soluções com alto teor de substâncias tóxicas e inflamáveis ​​solventes orgânicos (metanol, etanol ou 2-Propanol) e ácido acético são usados ​​para fixação, coloração e descoloração de proteínas em um gel após SDS -PAGE. Para acelerar o procedimento, o aquecimento da solução corante no forno de microondas por um tempo curto é freqüentemente usada. Isso geralmente resulta em evaporação do metanol tóxicos ou perigosos, etanol ou 2-Propanol e um forte cheiro de ácido acético no laboratório, que deve ser evitado devido a considerações de segurança. Em um protocolo publicado originalmente em dois pedidos de patente por EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), uma composição alternativa de solução de coloração é descrito em que nenhum solvente orgânico ou ácido é usado. A CBB é dissolvido em água bidestilada (60-80mg de CBB G-250 por litro) e 35 mM HCl é adicionado como o único composto outras na solução corante. A CBB staning do gel é feito após a lavagem SDS-PAGE e completa do gel em água bidestilada. Pelo aquecimento do gel durante a lavagem e coloração etapas, o processo pode ser concluído mais rapidamente e não compunds tóxicos ou perigosos são evaporando. A coloração das proteínas ocorre já dentro de 1 minuto após o aquecimento do gel na coloração da solução e está totalmente desenvolvido após 15-30 min com um fundo levemente azul que é totalmente descorados por lavagem prolongada do gel corado em água bidestilada, sem afetar as proteínas coradas bandas.

Protocolo

Parte 1: Preparação da solução de coloração CBB

1. 60-80 mg de CBB G-250 são dissolvidos em 1 litro de água bidestilada pela agitação por 2-4 horas. Finalmente, 3 ml de HCl concentrado é adicionado à solução de azul escuro, com agitação por mais um minuto e armazenados no escuro para uso posterior. A solução pode ser armazenada por várias semanas até vários meses sem perder sua eficiência de coloração.
2. HCl concentrado deve ser tratado com o cuidado habitual und usada sob uma coifa. A solução final será em cerca de pH 2, por isso as luvas devem ser utilizadas e qualquer contacto com a pele devem ser evitados.

Parte 2:....

Discussão

• Os passos de lavagem são críticos para a coloração eficiente das proteínas. Um menor tempo de lavagem com menos de 2 min ou volume reduzido de água (<50ml) pode resultar em pálida bandas de proteína azul, provavelmente devido a maior quantidade de SDS residuais no gel.
• Se as proteínas vão ser analisados ​​por espectrometria de massa, os passos de aquecimento no forno de microondas deve ser ignorada, o tempo para a lavagem do gel estendido para cerca de 10 min em cada etapa eo tempo de coloração prorrogado até a intensidade.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	pode-se usar igualmente qualquer outro CBB G-250
Ácido clorídrico concentrado