Os autores não têm nada a declarar.

dissecação de discos imaginais de 3 larvas drosophila instar

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

Este protocolo demonstra a técnica de dissecação usada para isolar discos imaginais de Drosophila larvas na fase instar 3. Métodos para fixar o tecido depois de dizer e remover a asa, perna, olho e os discos são demonstradas diretamente sobre uma lâmina de microscópio para visualização posterior.

Dissecação de discos imaginais de 3 larvas Drosophila Instar

Hoje vou mostrar como dissecar discos imaginais de larvas de drosófila de terceiro estágio. Discos larvais de terceiro estágio podem ser utilizados para diversos processos de desenvolvimento. Em nosso laboratório, analisamos esses discos para observar o processo de apoptose, mas você pode expressar diversas proteínas neles e estudá-los dessa forma, observando todos os tipos de processos de desenvolvimento que ocorrem nos discos.Para fazer isso, vou utilizar várias ferramentas muito importantes. A primeira é a haste de coleta, com a qual retiraremos as larvas de seus recipientes. Em seguida, e muito importante, estão as pinças de dissecação, que precisam ser extremamente afiadas para que a dissecação prossiga.Então usaremos uma lâmina cirúrgica, lâmina cirúrgica número 11, para remover os discos da cabeça. Em seguida, colocaremos os discos em uma lâmina com um pouco de Vector Shield como meio de montagem. Portanto, a primeira coisa que faremos é coletar algumas larvas de terceiro instar e estrela errante, terceiro instar e estrela.Estou apenas usando meu bastão de dissecção para, de certa forma, desprender as larvas da parede do frasco. Às vezes ajuda se o bastão estiver um pouco úmido; depois, coloque-as em uma gota de PBS. Ok, aqui temos nossa larva de terceiro estádio.Como sou destro, vou virar a cabeça dele em direção à minha direita e vamos usar algumas referências anatômicas para nos orientar sobre onde segurá-lo. Primeiro, a parte principal da traqueia aqui e aqui. E depois há uma pequena seção transversal aqui em cima, próxima à cabeça.Primeiro, vou segurar as larvas suavemente em aproximadamente dois terços do caminho ao longo do corpo a partir da cabeça. Em seguida, com a mão direita, vou segurar alguns milímetros atrás da peça transversal aqui, tentando alcançar cerca de metade da largura das larvas. Esse é um bom ponto de apoio.Dá para ver que estou mais ou menos na metade. Então vou puxar suavemente para frente com a mão direita, veja todos os intestinos saindo. Pronto. A parte principal do corpo pode agora ser descartada.E aqui temos a cabeça, que inclui os discos imaginais ligados às peças bucais. Vou segurá-lo pelas peças bucais para não esmagar nenhum dos discos e movê-lo para um novo ponto de PBS. Agora temos nossa cabeça de larva fixada.Vamos remover todo o tecido em excesso e, ou segurar a larva pelas peças bucais como antes, ou pressioná-la contra a placa de dissecação com a pinça. As peças bucais estão agora à esquerda. Muito bem, aqui temos o intestino, que não queremos, e há uma glândula salivar.Há algum corpo gorduroso ou tecido adiposo. Continue removendo, especialmente a gordura, que pode interferir em certos ensaios e colorações de estruturas que você não deseja. Agora temos a cabeça larval limpa.Agora temos nossas cabeças de larvas, que foram dissecadas separando-se do corpo, fixadas e lavadas, com os tecidos excedentes removidos, e que foram tratadas com o que for necessário, o que pode ser uma coloração com anticorpo no C dois túnel ou outra coloração funcional. Agora as colocamos em uma lâmina e estamos prontos para dissecar os discos propriamente ditos separando-os da cabeça. As peças bucais.Certo, desta vez nossas peças bucais estão à esquerda aqui. Vou pegar minha pinça e pressioná-la levemente contra a lâmina. Na minha mão direita, tenho uma lâmina de bisturi número 11, que é um instrumento um pouco mais fino, adequado para dissecar.Primeiro, vou remover o SNC e os lobos ópticos. Veja que aqui está o SNC, aqui estão os dois lobos ópticos e aqui estão os discos de olho e antena ligados a eles. Então, se eu remover o SNC inserindo minha lâmina entre os lobos ópticos e os discos oculares e puxando lentamente, os discos oculares se esticam um pouco.Ok, então aqui temos o SNC e os lóbulos ópticos. Agora temos os dois discos imaginais dos olhos, que foram destacados do SNC. Agora vou removê-los das peças bucais cortando e puxando suavemente na base.Certo, então há um disco do olho e da antena, e o outro disco do olho e da antena. Certo. E agora podemos ver o disco da asa projetando-se aqui. Vou, novamente, encontrar suavemente o corte basal e puxar.Aqui temos um disco alar e um disco de perna anexado a ele, juntamente com um pouco de traqueia. Ok, então aqui está o seu disco alar com um disco de perna anexado, e obviamente há vários discos de perna. Assim, podemos, de certa forma, procurar ao redor aqui e encontrar mais discos apenas sondando suavemente com a lâmina.São todos os discos que vamos encontrar neste espécime. Há mais alguns discos de perna.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

University of California, Irvine (UCI).  Este protocolo demonstra a técnica de dissecação usada para isolar discos imaginais de Drosophila larvas na fase instar 3. Métodos para fixar o tecido depois de dizer e remover a asa, perna, olho e os discos são demonstradas diretamente sobre uma lâmina de microscópio para visualização posterior.

Dissecação de discos imaginais de 3 larvas Drosophila Instar

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